Name: Ajustabilidade de Nanoesponjas em Tamanho e Densidade Reticular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T11:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprenda a sintetizar nanoesponjas com controle preciso de tamanho e densidade reticular para aplicações em liberação de fármacos. Este método permite ajustar parâmetros de síntese para otimizar sistemas de entrega de medicamentos.

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LK é grato para o financiamento do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (DGE-1445197) e departamento de química da Universidade Vanderbilt. LK e EH gostaria de agradecer o financiamento para o instrumento TEM de Osiris (NSF EPS 1004083).

1. Síntese e Caracterização da LVA
<ol>
	<li>Coloque uma barra de agitação magnética dentro de um balão de fundo redondo de 2 gargalos de 500 mL (Frasco 1) e sele com um septo de borracha de tamanho apropriado e fio de aço. Seque o frasco com chama para remover a umidade purgando com gás nitrogênio conectado através de uma agulha de entrada e uma agulha de saída aberta no septo, enquanto usa um maçarico de chama de butano para aquecer suavemente a parte externa do frasco movendo a chama ao longo da superfície.
	<ol>
		<li>Continuar a aquecer todo o balão passando a chama pela superfície até que não se veja humidade turva o interior do balão. Remover a chama e deixar o balão arrefecer até à temperatura ambiente, continuando o fluxo de azoto durante toda a reacção.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Adicione 156,25 mL de tetrahidrofurano anidro (THF) por meio de uma seringa de 30 mL ao frasco 1. Arrefecer o balão de 1 a -78 °C com um banho de gelo seco/acetona. Monitore a temperatura com um termômetro durante toda a reação e adicione gelo seco conforme necessário para manter -78 °C. Comece a mexer a barra de agitação magnética usando uma placa de agitação magnética para criar um vórtice suave.</li>
	<li>Adicione N,N-diisopropiletilamina (DIPA) (3,30 mL, 2,3 x 10-2 mol) por meio de uma seringa de 5 mL, seguida pela adição gota a gota de 2,5 M de n-butillítio (9,34 mL, 2,3 x 10-2 mol) por meio de uma seringa de vidro de 10 mL equipada com um mecanismo de travamento da agulha e agulha de metal ao frasco 1. Continue a mexer usando uma placa de agitação magnética por 15 min a -78 °C.</li>
	<li>Seque com chama (conforme descrito na etapa 1.1) e purgue com gás argônio (conforme descrito na etapa 1.1 com gás nitrogênio) um balão de fundo redondo de 100 mL (frasco 2). Remova a entrada e a saída do gás argônio ao mesmo tempo, uma vez que o frasco esteja frio o suficiente para tocar. Adicione 56 mL de THF anidro por meio de uma seringa de 30 mL e δ-valerolactona (VL) (1,97 mL, 2,1 x 10-2 mol) por meio de uma seringa de 5 mL.</li>
	<li>Adicione a solução do Frasco 2 ao Frasco 1 por meio de uma pequena cânula gota a gota por 45 minutos, mexendo continuamente por meio de uma barra de agitação magnética. Quando o frasco 2 estiver vazio, remova a cânula e deixe o frasco 1 continuar agitando por 15 min a -78 °C.</li>
	<li>Seque com chama (conforme descrito na etapa 1.1) e purgue com gás argônio (conforme descrito na etapa 1.1 com gás nitrogênio) um balão de fundo redondo de 25 mL (frasco 3). Remova a entrada e a saída do gás argônio ao mesmo tempo, uma vez que o frasco esteja frio o suficiente para tocar, para manter a pressão positiva dentro do frasco. Adicione brometo de aliado (2,02 mL, 2,3 x 10-2 mol) e hexametifosforamida (HMPA) (4,43 mL, 2,5 x 10-2 mol) cada um por meio de uma seringa de 5 mL.</li>
	<li>Adicione o Frasco 3 ao Frasco 1 por meio de uma pequena cânula gota a gota. Quando o frasco 3 estiver vazio, remova a cânula.
	<ol>
		<li>Remova o máximo possível de gelo seco e acetona fria do banho de gelo seco/acetona no qual o Frasco 1 é submerso usando uma colher e um copo plástico. Substituir por acetona à temperatura ambiente para elevar o banho a -40 °C e deixar o balão 1 continuar a agitar durante 2 h enquanto controla a temperatura. Se a temperatura aumentar acima de -40 °C, adicione alguns pedaços de gelo seco para resfriar a acetona.</li>
		<li>Aquecer a -10 °C retirando a acetona fria e o gelo seco e substituir por acetona à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Remova o septo do frasco 1 e tempere a reação com uma solução saturada de cloreto de amônio de 150 mL, agitando por meio de uma barra de agitação magnética. Colocar o Balão 1 num congelador a -20 °C durante a noite para armazenar.</li>
	<li>Retire o frasco 1 do congelador e deixe aquecer até à temperatura ambiente. Despeje a solução do Frasco 1 em um funil de separação de 500 mL.</li>
	<li>Adicione 50 mL de diclorometano (DCM), tampe o funil separatório e agite suavemente para misturar o DCM e a mistura aquosa / THF para extrair o produto para a camada orgânica. Recolher a camada orgânica num copo de 500 ml contendo uma barra de agitação magnética de dimensões adequadas, abrindo a torneira do funil de separação e reservando. Repita duas vezes.</li>
	<li>Recolher todos os produtos orgânicos no mesmo copo e agitar sobre o sulfato de magnésio (para remover a água residual) utilizando uma placa de agitação magnética até que o sulfato de magnésio deixe de grudar quando adicionado à solução. Descarte os resíduos aquosos.</li>
	<li>Remover o sólido de sulfato de magnésio da solução do produto orgânico utilizando um papel de filtro dentro de um funil de vidro e recolher os orgânicos num balão de fundo redondo de 250 ml. Enxágue o papel de filtro e o sulfato de magnésio sólido com excesso de DCM para garantir que todo o produto seja coletado.</li>
	<li>Remover o solvente do produto por evaporação rotativa durante o aquecimento a 30 °C e utilizando um aspirador de água como fonte de vácuo.</li>
	<li>Purificar o produto bruto por cromatografia em coluna10 utilizando um gel de sílica como fase estacionária e eluindo começando com 3% de acetato de etilo/hexanos para 1 volume de coluna (CV), aumentando o gradiente para 29% de acetato de etilo/hexanos em 5 CV. Recolher as fracções em tubos de vidro borossilicato de 16 x 150 mm2.</li>
	<li>Realizar cromatografia em camada delgada utilizando acetato de etilo/hexanos a 20% como eluente para determinar as fracções do produto.</li>
	<li>Combinar todas as fracções do produto num balão de fundo redondo de dimensões adequadas e remover o solvente por evaporação rotativa a 40 °C. Transferir para um frasco para injetáveis de produto pré-pesado e colocar sob um vácuo elevado a 0,05 torr para obter o AVL puro. Caracterize o produto por 1H NMR11 (CDCl3, 400 MHz): δ 5,75 (m, 1H), 5,06 (m, 2H), 4,26 (m, 2H), 2,54 (m, 3H), 2,28 (m, 1H), 2,03 (m, 1H), 1,87 (m, 1H), 1,54 (m, 1H). Rendimento: 2,07 g (70,56%).</li>
</ol>
2. Síntese e Caracterização de VL-co-AVL
<ol>
	<li>Seque com chama e purgue com gás nitrogênio um balão de fundo redondo de 25 mL equipado com uma barra de agitação magnética e septo.
	<ol>
		<li>Seque o frasco com chama para remover a umidade purgando com gás nitrogênio conectado através de uma agulha de entrada e uma agulha de saída aberta no septo, enquanto usa um maçarico de chama de butano para aquecer suavemente a parte externa do frasco movendo a chama ao longo da superfície.</li>
		<li>Continuar a aquecer todo o balão passando a chama pela superfície até que não se veja humidade turva o interior do balão. Remover a chama e deixar o balão arrefecer até à temperatura ambiente, continuando o fluxo de azoto durante toda a reacção.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Remova rapidamente o septo do fundo redondo e adicione triflato de estanho (II) (2,5 mg, 5,9 x 10-6 mol) no fundo do frasco usando uma espátula. Substitua o septo.</li>
	<li>Adicione 3-metil-1-butanol (72,6 μL, 6,6 x 10-3 mol) por meio de uma microsseringa de 100 μL e 1,33 mL de DCM anidro por meio de uma seringa de 2 mL sequencialmente. Mexa através de uma placa de agitação magnética por 10 min.</li>
	<li>Adicione AVL (0,48 mL, 3,7 x 10-3 mol) e VL (1,37 mL, 1,4 x 10-2 mol) sequencialmente por meio de uma seringa. Deixe continuar mexendo por 18 - 20 h. 
	NOTA: A porcentagem de AVL e VL no copolímero final pode ser alterada por estequiometria nesta etapa.</li>
	<li>Extinguir a reação adicionando ~ 5 mL de metanol (MeOH). Adicione ~ 100 mg de estanho de suporte sólido e mexa por 2 h. Filtre por filtração por gravidade para remover o sólido.</li>
	<li>Remover o solvente por evaporação rotativa com um aspirador de água como fonte de vácuo, aquecendo a 30 °C até que a solução fique viscosa. Precipite a solução gota a gota em 500 mL de MeOH frio (resfriado com gelo seco por pelo menos 1 h) para produzir flocos de sólido branco. Filtrar a solução por filtração a vácuo para um funil contendo um disco de vidro frito com papel de filtro para recolher o sólido. 
	NOTA: Se a precipitação produzir um sobrenadante turvo ou pó fino que passa pelo papel de filtro, a solução do produto está muito diluída. Todo o solvente sobrenadante deve ser removido por evaporação rotativa com um aspirador de água como fonte de vácuo, aquecendo a 30 °C até que a solução fique viscosa e, em seguida, a precipitação deve ser realizada novamente.</li>
	<li>Transfira o produto sólido para um frasco pré-pesado por meio de uma espátula e seque durante a noite com alta pressão de vácuo de 0,05 torr para coletar o sólido branco e escamoso.</li>
	<li>Caracterize o polímero por 1H NMR11 (CDCl3, 400 MHz): δ 5,71 (m, 1H), 5,03 (t, 2H), 4,08 (m, 4H), 3,65 (t, 2H), 2,15 - 2,50 (m, 5H), 1,47-1,78 (m, 9H), 0,91 (d, 6H). 81,42% VL, 18,58% AVL, 2.940 g/mol, 578 g/mol unidade de repetição de AVL. Rendimento: 1,43 g, (73,43%).</li>
</ol>
3. Epoxidação pós-polimerização para produzir unidades de copolímero de epóxi-valerolactona (EVL)
<ol>
	<li>Adicione o copolímero VL-co-AVL (500 mg, 1,7 x 10-4 mol, 2.940 g / mol) a um frasco de 6 dram com uma barra de agitação magnética. Adicione 6,15 mL de DCM anidro ao frasco e ao vórtice para solubilizar o polímero.</li>
	<li>Adicione ácido metacloroperoxibenzóico (mCPBA) (74,53 mg, 4,3 x 10-4 mol) a um segundo frasco para injetáveis de 6 dram. Adicionar 6,15 mL de DCM anidro e vórtice até que o mCPBA esteja completamente solubilizado. 
	NOTA: A taxa de conversão de alilos em epóxidos pode ser variada alterando a estequiometria nesta etapa. A concentração final de alilo no solvente deve ser de 0,065 M.</li>
	<li>Transfira a solução mCPBA para a solução VL-AVL. Tampe a reação e cubra com um filme plástico de parafina. Deixe mexer por 48 h.</li>
	<li>Transferir a mistura de reacção para uma ampola de separação de 50 ml. Adicione 15 mL de bicarbonato de sódio saturado, tampe o funil separatório e balance suavemente para misturar. Recolher a camada orgânica que contém o produto para um Erlenmeyer de 50 ml com uma barra de agitação magnética de dimensões adequadas (balão do produto).
	<ol>
		<li>Adicione 5 mL de DCM à camada aquosa que ainda está no funil separador, tampa e, em seguida, balance suavemente. Recolha os orgânicos no balão do produto. Descarte os resíduos aquosos. Transferir a camada orgânica de volta para um funil de separação. Repita esta lavagem aquosa duas vezes.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Adicione sulfato de magnésio (para remover qualquer água residual) ao frasco do produto, mexendo sobre uma placa de agitação magnética. Continue adicionando pequenas colheres de sulfato de magnésio até que não grude mais quando adicionado. Utilizar um funil de vidro com papel de filtro para remover o sulfato de magnésio sólido, transferindo a mistura para um balão de fundo redondo de 50 ml.</li>
	<li>Remover o solvente por evaporação rotativa com um aspirador de água como fonte de vácuo e aquecimento a 25 °C. Transferir o conteúdo do balão de fundo redondo para um frasco para injetáveis de produto pré-pesado e remover o solvente por evaporação rotativa. Coloque em alto vácuo a 0,05 torr durante a noite para produzir um sólido branco e ceroso.</li>
	<li>Caracterizar por 1H NMR11 (CDCl3, 400 MHz): δ 5,71 (m, 1H), 5,03 (t, 2H), 4,08 (m, 4H), 3,65 (t, 2H), 2,94 (d, 1H), 2,90 (s, 1H), 2,74 (s, 1H), 2,15-2,50 (m, 5H), 1,47-1,78 (m, 9H), 0,92 (d, 6H). 84,53% VL, 9,65% AVL, 5,82% EVL, 2,855 g/mol, 1,841 g/mol unidade de repetição de EVL. Rendimento: 417,3 mg (83,46%).</li>
</ol>
4. Síntese e Caracterização de Nanoesponjas
<ol>
	<li>Dissolver o polímero VL-co-AVL-co-EVL (200 mg, 7,0 x 10-5 mol, 2.855 g/mol) em 20,01 ml de DCM anidro para uma concentração de epóxido de 0,0054 M. Transferir para um balão de fundo redondo de 100 ml com um pescoço de 14/20. 
	NOTA: Para catalisar a reação, 100 μL de bicarbonato de sódio saturado aquoso pode ser adicionado nesta etapa.</li>
	<li>Colocar o balão de reacção num banho de óleo a 50 °C. Agitar a solução com um vórtice rápido e adicionar 2,2'-(etilenodioxi)bis(etilamina) (21,45 μL, 2,9 10-4 mol) através de uma microsseringa gota a gota. Montar no gargalo do balão um condensador com camisa de água com água fria que flui através dele, equipado com um adaptador de gargalo 14/20, e refluir a solução durante 12 h. Assegurar uma vedação muito apertada entre o gargalo do balão e o refrigerante para evitar a evaporação do solvente.</li>
	<li>Remover o excesso de solvente do balão de reacção por evaporação rotativa a 25 °C até obter uma solução viscosa.</li>
	<li>Coloque uma grande barra de agitação magnética em um copo de 2 L. Corte uma seção de aproximadamente seis polegadas de tubo de diálise de corte de peso molecular (MWCO) de 10 K e dobre uma extremidade e feche com um clipe de diálise.
	<ol>
		<li>Transfira o produto para um tubo de diálise MWCO de 10 K. Enxágue o frasco com excesso de DCM e transfira-o para o tubo. Dobre a parte superior do tubo e feche com um clipe de diálise que tenha um fio para pendurar. Pendure o tubo de diálise na lateral do béquer usando o fio e encha o béquer com DCM até que o tubo de diálise esteja completamente submerso.</li>
		<li>Coloque em uma placa magnética e mexa delicadamente. Cubra o copo com papel alumínio para evitar a evaporação do solvente. Remova o solvente despejando em um recipiente de resíduos e substitua por DCM novo três vezes ao dia por 48 h para remover o polímero e o reticulador não reagidos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Remova todo o solvente do béquer e transfira o conteúdo do tubo de diálise para uma seringa de 10 mL equipada com um filtro de seringa de politetrafluoretileno (PTFE) de 0,45 μm. Empurre a solução através do filtro diretamente para um frasco de produto pré-pesado para remover quaisquer impurezas restantes. Remover o solvente por evaporação rotativa a 25 °C e, em seguida, colocar em vácuo alto a 0,05 torr durante a noite para recolher o sólido ceroso amarelo claro.</li>
	<li>Caracterizar por 1H NMR11 (CDCl3, 400 MHz): δ 5,71 (m, 1H), 5,03 (t, 2H), 4,08 (m, 4H), 3,60-3,67 (t, 14H), 2,94 (d, 1H), 2,90 (s, 1H), 2,74 (s, 1H), 2,15-2,50 (m, 5H), 1,47-1,78 (m, 9H), 0,92 (d, 6H). Rendimento: 176,9 mg (88,45%).</li>
</ol>
5. Imagem TEM da morfologia e tamanho da nanoesponja
<ol>
	<li>Filtre 5 mL de água de cultura de células através de um filtro de seringa de PTFE de 0,2 μm.</li>
	<li>Coloque nanoesponjas de 0,5 mg em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Adicione 1 mL de água filtrada para cultura de células. Use um sonicador de sonda (20 kHz, 40 a) para sonicar a solução com rajadas de 2 s 4 a 5 vezes à temperatura ambiente até que as partículas desenvolvam uma suspensão fina. Não use sonicação prolongada nem deixe a solução aquecer, pois isso causará agregação.</li>
	<li>Adicione 30 mg de hidrato de ácido fosfotúngstico (PTA) a 1 mL de água de cultura de células filtrada em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Vórtice na configuração mais alta por 10 s ou até que o PTA esteja completamente solubilizado para produzir solução de PTA a 3%.</li>
	<li>Use uma seringa de 1 mL com agulha de 22 G para extrair 0,5 mL de solução de PTA a 3%. Adicione 4 gotas da solução de PTA a 3% às partículas e votice na configuração mais alta por 10 s. Use um par de pinças de fechamento automático para pegar uma grade TEM e mergulhe-a na solução de partículas rapidamente, três vezes. Deixe a grelha secar durante 5 h sob uma tampa para reduzir a acumulação de pó na grelha.</li>
	<li>Realize a imagem TEM12 da amostra usando alto contraste e objetiva de 40 μm.</li>
</ol>

<ol><li>van der Ende, A. E., Sathiyakumar, V., Diaz, R., Hallahan, D. E., Harth, E. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2010/py/b9py00272c/unauth">Linear release nanoparticle devices for advanced targeted cancer therapies with increased efficacy.</a> Polym Chem. 1 (1), 93(2010).</li>
<li>Sharma, S., Parmar, A., Kori, S., Sandhir, R. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165993615300121">PLGA-based nanoparticles: A new paradigm in biomedical applications.</a> Trends Anal Chem. 80, 30-40 (2016).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Obtenção de tamanhos nanosponge reprodutível é vital em aplicações de entrega de drogas. Vários parâmetros na síntese de polimerização e nanosponge afetam o tamanho e o crosslink densidade da partícula resultante. Três parâmetros importantes foram identificados em nossa análise: peso molecular de polímeros, epóxido pingente funcionalidade e crosslinker equivalentes. A fim de produzir uma gama de pesos moleculares e epóxido funcionalidades para a síntese de nanosponge, a estequiometria do VL -co -AVL copolímero d...

Precisamente, ajuste a densidade de tamanho e reticulação de nanopartículas com base na reticulação intermolecular é de grande importância para influenciar e orientar o perfil de liberação de drogas desses nanosistemas1. Projetando nanosponge pré-definido, ou seja, preparando partículas de densidades de rede diferentes, é dependente em cima a funcionalidade de pingente do polímero precursor e os equivalentes do crosslinker hidrofílico incorporada. Nesta abordagem, a concentração do precursor e agente reticulante no solvente é importante forma de nanopartículas de um tamanho discreto, em vez de um gel de volume. Utilizando a espectroscopia quantitativa da ressonância magnética nuclear (NMR) como uma técnica de caracterização permite a determinação precisa da funcionalidade incorporada pingente e peso molecular de polímeros. Uma vez que as nanopartículas são formadas, podem ser concentrados e solubilizados em produtos orgânicos, sem ter o caráter de um nanogel.
Trabalho recente na entrega da droga nanopartículas centrou-se na utilização de poli (lático-co-ácido glicólico) (PLGA) Self montado nanopartículas2,3,4,5,6. PLGA tem ligações éster degradável que torná-lo adequado para aplicações de entrega de drogas e é frequentemente combinada com poly(ethylene glycol) (PEG) devido a suas propriedades stealth7. No entanto, devido à natureza Self montada da formação de partículas PLGA, as partículas não podem ser solubilizadas em produtos orgânicos para functionalization ainda mais. Em contraste com nanopartículas PLGA, o método proposto fornece reticulação covalente formando uma nanopartícula com tamanhos definidos e morfologia, que são estáveis em produtos orgânicos e degradar em soluções aquosas1. As vantagens desta abordagem são a capacidade de ainda mais quimicamente funcionalizar a superfície do nanosponge8, e sua estabilidade em solventes orgânicos pode ser usada para o pós-carregamento das partículas com compostos farmacêuticos1,9. Com este método, encapsulamento de moléculas pequenas hidrofóbicas pode ser alcançado pela precipitação em meio aquoso. A hidrofobicidade da espinha dorsal do poliéster juntamente com o hidrofílico crosslinker curto dá estas partículas um caráter amorfo à temperatura corporal. Além disso, após o carregamento de drogas, a partícula pode formar suspensões bem em meios aquosos para ser facilmente injetado em vivo. É nosso objetivo neste trabalho para avaliar os parâmetros para a síntese destes nanosponges do poliéster e determinar aqueles que são de vital importância para o projeto e o controle do tamanho e morfologia.

<table><tbody><tr><td>2,2'-(Etilenodioxi)bis(etilamina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>385506-100ML</td><td></td></tr><tr><td>3-metil-1-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309435-100ML</td><td>anidro, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124-4L</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de alilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A29585-5G</td><td>&ge; Solução</td></tr> <tr>saturada <td>A661-500</td><td>científica de Fisher do</td> <td>cloreto de amônio</td><td>99</td>%</tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500-500ML</td> da<td>água da cultura de pilha</td> na água do DI <td>filtrada completamente 0,45 &mu; m filtro de seringa</td></tr><tr><td>Diclorometano (DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997-100ML</td><td>anidro, &ge; 99%, contém 40 - 150 ppm de amileno como estabilizador</td></tr><tr><td>Acetato de etila</td><td>Fisher Scientific</td><td>E145SK-4</td><td></td></tr><tr><td>EZFlow 0.2 &mu; m Filtro de Seringa</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>386-2116-OEM</td><td>Hidrofílico PTFE, 13 mm</td></tr><tr><td>EZFlow 0.45 &mu; m Filtro de Seringa</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>386-3126-OEM</td><td>PTFE Hidrofílico, 25 mm</td></tr><tr><td>Tubos de Ensaio de Vidro Borosilicato Descartáveis Fisherbrand com Extremidade Lisa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-31</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga Fisherbrand Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-666-318</td><td>Seringa de Microlitro Hamilton de 1,5 mL</td></tr><tr><td>, 100 &mu; L</td><td>Hamilton Company</td><td>80600</td><td>Modelo 710 N SYR, NDL Cimentado, 22s ga, 2 pol, estilo de ponta 2</td></tr><tr><td>Hexametilfosforamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H11602-100G</td><td>&ge; 99%, contém &le; 1.000 ppm de óxido de propileno como estabilizador</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher Scientific</td><td>H292-4</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>Meta-cloroperoxibenzoico ácido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>273031-100G</td><td>Purificado para &ge; 99% por lavagem tampão</td></tr><tr><td>Metanol (MeOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-100ML</td><td>anidro, &ge; Solução de 99%</td></tr> <tr><td>N-butil-lítio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230707-100ML</td><td>2.5 M em hexanos</td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>550043-500ML</td><td>&ge; 99%</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Pro Reverse (fechamento automático) Pinças</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5375-NM</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de ácido fosfotúngstico</td><td>Alfa Aesar</td><td>40116</td><td></td></tr><tr><td>Q55 Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q55-110</td><td>55 Watts, 20 kHz</td></tr><tr><td>SiliaMetS Cisteína</td><td>Siliciclo</td><td>R80530B-10g</td><td></td></tr><tr><td>Clipes de Diálise SnakeSkin</td><td>Thermo Scientific</td><td>68011</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Diálise SnakeSkin, 10K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>5233-500</td><td>solução saturada em grade TEM de água DI</td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>01822-F</td><td>Carbono Ultrafino Tipo-A, 400 mesh, Cobre, aprox. tamanho do furo da grade: 42 &micro; m</td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano (THF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757-1L</td><td>Anidro, &ge; 99,9%,</td></tr><tr><td>Tin(II) trifluorometanossulfonato</td> livre de inibidores <td>Sigma-Aldrich</td><td>388122-1G</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Papel de Filtro Whatman, Grau 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-805H</td><td>Círculos, 185 mm</td></tr><tr><td>&delta;-valerolactona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>389579-100ML</td><td>Purificado por destilação a vácuo</td></tr></tbody></table>

nanosponge pré-definido em tamanho e densidade de reticulação

Nanosponge Tunability in Size and Crosslinking Density

Descreveremos um protocolo para a síntese de poliéster linear contendo pingente epóxido funcionalidade e sua incorporação de um nanosponge com dimensões controladas. Essa abordagem começa com a síntese de uma lactona funcionalizada, que é a chave para o functionalization pingente do polímero resultante. Valerolactona (VL) e alil-valerolactona (AVL) são então copolymerized usando anel de abertura polimerização. Modificação de pós-polimerização é usada para instalar um moiety epóxido em alguns ou todos os grupos de alilo pendente. Química do epóxi-amina é empregada para nanopartículas de formulário em uma solução diluída de polímero e pequena molécula diamina crosslinker baseado na densidade desejada nanosponge tamanho e reticulação. Nanosponge tamanhos podem ser caracterizados por transmissão (TEM) microscopia eletrônica de varredura de imagem para determinar a dimensão e a distribuição. Este método fornece um caminho pelo qual poliésteres altamente sintonizáveis podem criar nanopartículas ajustáveis, que podem ser usadas para o encapsulamento de drogas pequena molécula. Devido à natureza do backbone, estas partículas são hydrolytically e enzimaticamente degradáveis para uma liberação controlada de uma vasta gama de moléculas pequenas hidrofóbicas.

Para avaliar a relação entre os parâmetros de síntese da nanosponge e seu tamanho resultante, a funcionalidade de concentração e pingente de cada precursor do polímero é importante. Na Figura 1, um esquema de successfulsynthetic de nanosponges é realizado sob condições de refluxo após incorporando ambos precursor polímero e diamina crosslinker em DCM para 12h. A concentração de epóxidos na solução é também fundamental para a formação de partículas discretas. ...

Este artigo descreve um processo para ajustar a densidade de tamanho e reticulação de covalentemente quitosana nanopartículas de poliéster linear contendo funcionalidade pendente. Ajustando os parâmetros de síntese (peso molecular de polímeros, incorporação de funcionalidades de pingente e crosslinker equivalentes), uma densidade de tamanho e reticulação de nanopartículas desejado pode ser alcançada para aplicações de entrega de drogas.

Nanosponge pré-definido em tamanho e densidade de reticulação

We describe a protocol for the synthesis of linear polyesters containing pendant epoxide functionality and their incorporation into a nanosponge with ...

O objetivo geral dessa técnica de síntese de nanotampas é compreender e utilizar parâmetros importantes de síntese para o projeto e controle do tamanho na morfologia. Este método ajudará você a produzir nanopartículas com dimensões precisas e densidades de reticulação para aplicações em entrega de fármacos. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser adaptada para diferentes densidades de reticulação dessas partículas e também para diferentes tamanhos dessas partículas, o que representa um fator muito importante em diversas aplicações nas quais essas partículas serão utilizadas.Embora este método possa fornecer informações sobre o design de nanopartículas ao utilizar parâmetros personalizados de síntese da lã, ele também pode ser aplicado a outras redes poliméricas, como hidrogéis e micropartículas. Remova a umidade de um frasco de fundo redondo de 25 mililitros equipado com um bastão de agitação magnética, conforme detalhado no protocolo do texto. Após o resfriamento, remova rapidamente o septo do frasco de fundo redondo e adicione 2,5 miligramas de triflato de estanho na parte mais baixa do frasco, utilizando uma espátula.Substitua a séptula. Adicione sequencialmente 72,6 µL de 3-metil-1-butanol por meio de uma microsseringa de 100 µL e 1,33 mL de DCM anidro por meio de uma seringa de dois mL. Agite a suspensão em um agitador magnético durante 10 minutos.Em seguida, adicione sequencialmente 0,48 mililitros de AVL e 1,37 mililitros de VL. Deixe a reação sob agitação por 18 a 20 horas. Interrompa a reação adicionando aproximadamente cinco mililitros de metanol e, então, adicione 100 miligramas de suporte sólido tipo sequestrante ao frasco e agite por duas horas. Filtre a suspensão por filtração simples para remover o sólido e, em seguida, enxágue o frasco com diclorometano como solvente e despeje sobre o filtro.Remova o solvente sob evaporação rotatória, utilizando um aspirador de água como fonte de vácuo, aquecendo a 30 graus celsius até que a solução fique viscosa. Precipite o solvente gota a gota em 500 mililitros de metanol frio para produzir flocos de sólido branco. Em seguida, filtre a solução por filtração a vácuo em um funil contendo um disco de vidro sinterizado com papel de filtro para coletar o sólido.Transfira o produto sólido para um frasco previamente pesado com auxílio de uma espátula e seque durante a noite utilizando vácuo alto com pressão de 05 Torr para obter o sólido branco em flocos. Adicione 500 miligramas do copolímero VLAVL a um frasco de seis vias contendo uma barra de agitação magnética. Em seguida, adicione 6,15 mililitros de DCM anidro ao frasco e vortexe para solubilizar o polímero.Em seguida, adicione 74,53 miligramas de mCPBA a um segundo vial de seis vias. Adicione 6,15 mililitros de DCM anidro e vortex até que o mCPBA esteja completamente solubilizado. Em seguida, transfira a solução de mCPBA para a solução VLAVL.Tampe a reação e cubra com filme de parafina plástico, antes de deixar sob agitação por 48 horas. Transfira a mistura reacional para um funil de separação de 50 mililitros e adicione 15 mililitros de bicarbonato de sódio saturado. Tampe o funil de separação e agite suavemente para homogeneizar.Colete a camada orgânica contendo o produto e transfira-a para um frasco Erlenmeyer de 15 mililitros com um bastão magnético de tamanho apropriado. Adicione cinco mililitros de DCM à camada aquosa que ainda está no funil de separação, tampe e agite suavemente. Colete as frações orgânicas e transfira-as para o frasco do produto.Após descartar o resíduo aquoso, transfira a camada orgânica de volta para um funil de separação. Em seguida, adicione sulfato de magnésio ao frasco do produto sob agitação em uma placa de agitação magnética para remover qualquer água residual; continue adicionando pequenas porções de sulfato de magnésio até que ele não se aglomere mais ao ser adicionado. Utilize um funil de vidro equipado com papel filtro para remover o sulfato de magnésio sólido durante a transferência da mistura para um frasco redondo de 50 mililitros.Transfira o conteúdo do balão de fundo redondo para um frasco de produto previamente pesado. Remova o solvente por evaporação rotativa utilizando o aspirador de água como fonte de vácuo e aquecimento a 25 graus Celsius. Coloque o frasco sob vácuo elevado a 05 Torr durante a noite para obter um sólido ceroso branco.Dissolva 200 miligramas do polímero VLAVL EVL em 20,01 mililitros de DCM anidro, para obter uma concentração de apóxido de 0,054 molar. Transfira a solução resultante para um balão de fundo redondo de 100 mililitros, com pescoço 14/20. Coloque o frasco de reação em um banho de óleo a 50 graus Celsius.Agite a solução com um vórtex rápido e adicione 21,45 microlitros de EDEA gota a gota por meio de uma microseringa. Adapte o pescoço do frasco ao condensador com jaqueta de água, pelo qual circula água fria, acoplado a um adaptador de pescoço 1420, e refluja a solução por 12 horas. Em seguida, remova o excesso de solvente do frasco de reação por evaporação rotativa a 25 graus celsius até obter uma solução viscosa.Transfira o produto para tubos de diálise com limite de peso molecular de 10k que tenham uma extremidade dobrada e fechada com o clipe de diálise. Enxágue o frasco com DCM em excesso e transfira-o para o tubo. Dobre a parte superior do tubo e feche-a com um clipe de diálise que tenha um fio para pendurar.Em seguida, pendure o tubo de diálise na borda de um béquer de dois litros com um bastão de agitação magnética grande e encha o béquer com DCM até que o tubo de diálise fique completamente submerso. Agite suavemente a solução de diálise em uma placa de agitação magnética e cubra o béquer com papel alumínio para evitar a evaporação do solvente. Remova o solvente despejando-o em um recipiente de resíduos e substitua por DCM fresco três vezes ao dia, durante 48 horas, para remover o polímero não reagido e o agente reticulante.Após a diálise, remova todo o solvente do béquer e transfira o conteúdo do tubo de diálise para uma seringa de 10 mililitros equipada com um filtro de seringa PTFE de 0,45 mícron. Passe a solução através do filtro diretamente para um frasco de produto previamente pesado, a fim de remover quaisquer impurezas remanescentes. Remova o solvente por evaporação rotatória a 25 graus Celsius e, em seguida, coloque o frasco de produto sob vácuo elevado a 05 Torr durante a noite para obter um sólido ceroso de cor amarelo-claro.Coloque 0,5 miligramas de nanosponjas em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Adicione um mililitro de água filtrada para cultura celular. Utilize um sonicator de prova para sonificar a solução com pulsos de dois segundos, de quatro a cinco vezes, à temperatura ambiente, até que as partículas formem uma suspensão fina.Em seguida, adicione 30 miligramas de PTA a um mililitro de água de cultura celular filtrada em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Agite em vórtex na velocidade máxima por 10 segundos ou até que o PTA esteja completamente solubilizado, para produzir uma solução de PTA a 3%. Utilize uma seringa de um mililitro com agulha de 22 graus para aspirar 0,5 mililitros da solução de PTA a 3%, adicione quatro gotas da solução de PTA a 3% às partículas e agite em vórtex na velocidade máxima por 10 segundos.Em seguida, utilize um par de pin&ccedil;as autoclav&aacute;veis para pegar uma grade de MET e mergulh&aacute;-la rapidamente na solu&ccedil;&atilde;o de part&iacute;culas tr&ecirc;s vezes. Deixe a grade secar por cinco horas, sob uma tampa para reduzir a coleta de poeira na grade. Por fim, realize a imagemologia por MET da amostra, utilizando alto contraste e um objetivo de 40 m&iacute;cons.Esta figura representa o método de síntese de nanotampas utilizando um copolímero poliéster linear contendo grupos funcionais laterais reagidos com um agente reticulante diamina para formar nanopartículas discretas em solução. A imagem de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é utilizada para caracterizar as dimensões precisas de cada conjunto de nanotampas; esta imagem contém nanotampas de 79 nanômetros com desvio padrão de 12 nanômetros. Os tamanhos das nanotampas foram analisados com base no peso molecular do precursores polimérico e na quantidade de funcionalidade lateral, a fim de avaliar a relação entre esses dois fatores.Uma tendência de aumento no tamanho dos nanosponjas está correlacionada com o aumento do peso molecular do polímero, independentemente da funcionalidade pendente. Os tamanhos dos nanosponjas também foram analisados com base na quantidade de funcionalidade pendente e na quantidade de reticulante diamina adicionada à reação. O aumento tanto da funcionalidade pendente quanto do equivalente de reticulante mostra um aumento nos tamanhos dos nanosponjas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar esses parâmetros sintéticos para projetar essas nanopartículas, controlando o tamanho e a morfologia exatamente da maneira desejada. Podemos ajustar a síntese dessas nanoesponjas com esses parâmetros importantes: peso molecular do polímero, concentração de apóxito e quantidade de agente de reticulação. Após o desenvolvimento dessa síntese de nanopartículas, essa técnica tem sido fundamental para o nosso laboratório de pesquisa na exploração da entrega de fármacos compostos hidrofóbicos pequenos.Ao realizar este procedimento, é muito importante ser preciso nas medições, pois a estequiometria e a concentração são fundamentais para o produto final. Após este procedimento, outros métodos de síntese de redes poliméricas podem ser realizados com o objetivo de responder perguntas relacionadas ao desenvolvimento de plataformas de liberação de fármacos.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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