Name: Puxando a membrana nanotubos de vesículas Unilamellar gigante (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Aprenda a puxar nanotubos de membrana a partir de vesículas unilamelares gigantes para estudar interações proteína-membrana curvada. Este método quantifica ligação proteica e propriedades mecânicas, revelando mecanismos de endocitose e tráfego intracelular.

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Os autores agradecer Benoit Sorre, Damien Cuvelier, Pierre Nassoy, François Quemeneur e Gil Toombes por suas contribuições essenciais para estabelecer o método de nanotubo no grupo. O grupo de P.B. pertence ao consórcio CNRS CellTiss, para o Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038) e de Ciências de Paris et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F.-C. Tsai foi financiado pela EMBO comunhão a longo prazo (ALTF 1527-2014) e acções Marie Curie (H2020-ACEM-IF-2014, projeto membrana-Yasmim-actina). MS é um Junior Fellow da sociedade Simons de Fellows.

Os autores não têm nada para divulgar.

O método de puxar os tubos de GUVs dá a rica informação sobre o sistema de membrana-proteína, como não é apenas o meio para medir as propriedades mecânicas fundamentais da membrana, mas ajuda a lançar luz sobre o acoplamento entre proteínas e membrana curvatura. Como discutido na introdução, outras técnicas existem para medir os efeitos das proteínas de membrana-encurvamento, incubando-se as proteínas com lipossomas de submícron, amarrados a uma superfície passivadas18,<sup class="xref"...

Muitos processos celulares, tais como endocitose, tráfico, formação de filopodia, infecção, etc, são acompanhados por uma mudança dramática na forma de membranas celulares,1,2. Na célula, um número de proteínas participar nestes processos vinculando à membrana e alterando sua forma. Os exemplos mais notáveis são membros da família de proteínas de Rvs/Bin/Amphiphysin (BAR), que contém uma característica intrinsecamente curvada BAR domínio3,4,5,6,7. Normalmente, eles interagem com a membrana, aderindo o domínio de BAR para a superfície e, em muitos casos, também superficialmente, inserindo anfifílicos hélices a BICAMADA. Determina a forma, tamanho e carga do domínio do BAR, juntamente com o número de hélices de anfifílicos: (1) a direção da curvatura de membrana (ou seja, se eles irão induzir invaginações ou saliências) e (2) a magnitude da membrana curvatura de5,8. Digno de nota, aqui curvatura positiva é definida como o lado convexo da membrana curvada, ou seja, bulge em direção a interação das partículas e negativo caso contrário. Além disso, estudos quantitativos do BAR proteínas revelaram que seu efeito na membrana depende de um conjunto de parâmetros físicos: densidade de tensão de membrana, proteínas e forma de membrana (plana contra tubular contra esférico de superfície forma)7. Dependendo desses parâmetros barra de proteínas pode: (1) atuam como sensores de curvatura da membrana, (2) Dobre as membranas ou (3) induzir a membrana cisão7.
Devido o grande número de componentes envolvidos na remodelagem de membrana na célula, estudando os aspectos quantitativos dos fenómenos, tais como endocitose, na vivo é extremamente desafiador. In vitro a reconstituição dos componentes mínimos imitando curvas membranas na célula fornece meios para ganhar uma compreensão mecanicista das proteínas de membrana-curvar como operar. Este artigo descreve um protocolo para reconstituir uma membrana nanotubo em vitro usando micromanipulação, microscopia confocal e pinça óptica. A abordagem pode ser usada para estudar, de forma quantitativa, como proteínas, lipídios ou pequenas moléculas interagem com as membranas curvas. GUVs de lipídios são usados como modelos de uma membrana celular, cuja curvatura é insignificante em comparação com o tamanho das moléculas da membrana-curvando-se interagindo. Eles estão preparados usando o método electroformation9 em que as vesículas são formadas por um filme lipídico de hidratação e inchaço em GUVs sob uma corrente alternada (AC)10. Substratos mais comuns em que são cultivadas GUVs são também placas semi condutoras revestidas com óxido da lata do indium (ITO) ou fios de platina (Pt-fios)11. Neste trabalho, GUVs são cultivadas na Pt-fios como esse método foi demonstrado funcionar muito melhor do que a alternativa em fazer GUVs na presença de sais na reserva12. Embora o protocolo de electroformation é descrito aqui em detalhes suficientes para reproduzi-lo, nos referimos o leitor para artigos anteriores em que semelhantes e outros métodos de fazer GUVs têm sido descritos em detalhe13,14. Em nossas mãos, electroformation em Pt-fios com sucesso rendeu GUVs partir de uma mistura de lipídeos sintéticos ou lipídica natural extratos em um buffer que contém ~ 100 mM NaCl. Além disso, foi possível também encapsular as proteínas dentro de GUVs durante o crescimento. Uma câmara de electroformation exemplo é mostrada na figura 1A; é composto por dois ~ 10 cm de comprimento Pt-fios, inseridos em um suporte feito de politetrafluoretileno (PTFE) que pode ser selado em ambos os lados com as lamelas de vidro ~ 1-2 cm de distância (figura 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg"> Figura 1: configuração Experimental. (A), o chefe electroformation câmara com conectores elétricos, ligado ao Pt-fios. (B) à esquerda: o sistema experimental mostrando o microscópio, câmara experimental acima o objetivo e duas micropipetas (esquerdas e direita) anexado para os Micromanipuladores e inserido na câmara experimental para tubo puxando e proteína injeção. Direito: uma visão mais apurada da câmara experimental montado acima o objetivo de mostrar as dicas da aspiração e as Micropipetas de injeção inseridas. (C) A seringa equipada com um distribuidor fino inserido uma micropipeta no seu back-end. O fundo é uma close-up vista do distribuidor no interior da micropipeta com linha pontilhada azul delineando a micropipeta. Este sistema é usado para preencher a micropipeta com caseína passivate a superfície do vidro e também para voltar a enchê-lo com óleo mineral, quando necessário. (D), um sistema usado para aspirar quantidades µ l da solução da proteína. A agulha é conectada a uma seringa e a tubulação que é conectada à micropipeta de injeção. A ponta da micropipeta cuidadosamente é imerso na solução da proteína e então aspirada para preencher a ponta da micropipeta. A micropipeta é então volta preenchida com óleo mineral, utilizando o sistema mostrado no painel C. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Um nanotubo de membrana, variando no raio de 7 nm a várias centenas de nm, pode ser retirado um chefe por uma força externa. Esse método foi inicialmente projetado para medir as propriedades elásticas das membranas celulares e vesículas, tais como a flexão rigidez15,16. Em trabalhos mais recentes, o método foi estendido para estudar a interação das proteínas com membranas curvas por microinjecting as proteínas perto do nanotubo puxada7,17. Outros métodos foram desenvolvidos para o estudo de proteínas de membrana-curvando-se. Em um método, as proteínas são incubadas com lipossomas de diferente tamanhos amarrados a uma superfície passivada. Microscopia confocal é usada para medir o emperramento da proteína em função do diâmetro de lipossomas, que pode indicar induzida por curvatura classificação18,19. Em outro método, as proteínas são injetadas perto de um chefe de microaspirado para medir sua capacidade de induzir espontaneamente túbulos20,21. O método descrito neste protocolo é especialmente adequado para estudar o encurvamento da membrana proteínas envolvidas na endocitose, onde a maioria das proteínas normalmente encontram pré-formadas membrana nanotubos conectando a invaginação da membrana contendo carga com o membrana de plasma plana subjacente. Além disso, neste método, ao contrário no ensaio com lipossomas pequenos amarrados, o nanotubo de membrana está continuamente ligado à membrana; Portanto, é no equilíbrio mecânico com o chefe, uma situação esperada na vivo. Por isso, fundamental membrana física aplica-se e podemos inferir uma infinidade de propriedades mecânicas de nossas medições22,23,24.
Para uma plena implementação deste método, o equipamento necessário inclui um microscópio confocal, pinça óptica e uma ou duas micropipetas conectadas a um tanque de água (figura 1B). Combinando todos os três, é possível medir a tensão de membrana, curvatura de membrana, densidade de superfície das proteínas e simultaneamente tubo de força25. Micropipeta de aspiração é essencial e é facilmente construído através da inserção de uma micropipeta de vidro em um suporte ligado a um tanque de água, que, através de pressão hidrostática, controla a pressão de aspiração26. A micropipeta e o titular são controlados por um micromanipulador e, idealmente, em uma direção por um piezo-atuador para movimento de precisão. Para puxar um nanotubo, o microaspirated chefe é brevemente preso a um mícron de tamanho do grânulo então puxou embora criando um nanotubo. Nesta implementação, o grânulo é realizado pela Pinça óptica, que pode ser construída seguindo um protocolo publicado27. É possível dispensar da pinça óptica e puxar nanotubos de maneiras diferentes, embora à custa de medições precisas de força. Se é muito difícil construir uma armadilha óptica ou se as medições de força são não essenciais, como se você simplesmente quiser verificar a preferência de proteínas por membranas curvas, um tubo pode ser puxado usando um grânulo aspirado na ponta de um segundo micropipeta28. Também é possível puxar os tubos usando força gravitacional29 ou30,31de fluxo. Além disso, a microscopia confocal também não é essencial; no entanto, é tão preferido para medir a densidade da superfície de proteínas. Também permite medir o raio de nanotubo de intensidade de fluorescência de lipídios no tubo, assim, independentemente da membrana força e tensão. Raio de tubo inferindo da fluorescência é particularmente importante se a relação entre essas quantidades afasta-se das equações bem estabelecidas, devido à presença de proteínas de membrana se adere25. Importante, um não pode dispensar da armadilha óptica e microscopia confocal, pois não será possível medir a curvatura do tubo.
O método conforme descrito neste protocolo tem sido usado para estudar a classificação induzida em curvatura de várias proteínas de membrana periférica em nanotubos, principalmente aqueles do BAR família25,32,33,34 . Também foi demonstrado que o canal de potássio transmembrana cònicamente em forma em que kvap é enriquecida curvo nanotubos da mesma forma como BAR proteínas35. Otimizando o método para encapsular as proteínas dentro de GUVs, a interação das proteínas com curvatura negativa foi investigada recentemente como bem36. Além disso, este método tem sido usado para elucidar a formação de proteína andaimes25,37 e estudar o mecanismo de cisão de membrana por qualquer linha tensão38, proteína Dinamina39, ou BAR proteínas40,,41. Além de proteínas, pequenas moléculas ou íons podem também induzir a curvatura. Usando esse método, os íons de cálcio foram mostrados para induzir a curvatura positiva sob condições sem sal42. Curiosamente, ele também foi mostrado que lipídios podem sofrer curvatura classificação, embora somente para composições que estão perto de um demixing ponto43,44. Em suma, o método pode ser usado por pesquisadores interessados em investigar ou como componentes de integral de membrana (por exemplo, lipídios ou proteínas transmembrana) ou vinculação perifericamente moléculas (seja dentro ou fora GUVs) interagir com membranas cilindricamente curvas, do ponto de vista mecânico e quantitativo. Também se destina para aqueles interessados em medir as propriedades mecânicas da membrana em si22,23,45.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>Exemplo de lipídio usado nos dados da Figura 3</td></tr><tr><td>1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[biotinil(polietilenoglicol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotina]</td><td>Avanti</td><td>880129</td><td>lipídio biotinilado</td></tr><tr><td>BODIPY-TR-C5-ceramida</td><td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td><td>D7540</td><td>lipídio fluorescente</td></tr><tr><td>BODIPY- FLC5-hexadecanoil fosfatidilcolina (HPC*)</td><td>Sondas moleculares (ThermoFisher)</td><td></td><td>lipídio fluorescente para calibração de densidade de proteína</td></tr><tr><td>ovo L-&alfa;-fosfatidilcolina (eggPC)</td><td>Avanti</td><td>840051</td><td>usado para calibrar a constante de raio do tubo</td></tr><tr><td>&beta;-caseína de leite bovino (>99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td>usado para passivar a micropipeta e o câmara experimental</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>D(+) glicose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>osmômetro</td><td>Loser</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Pt-fios, 0,5 mm de diâmetro, 99,99% puro</td><td>Goodfellow USA</td><td>PT005139</td><td>usado para</td></tr><tr><td>o gerador</td><td></td> de função de eletroformação <td>GUV n / a</td><td>usado para criar corrente para</td></tr><tr><td>o selante de massa de eletroformação</td> GUV <td>Vitrex (da CML França)</td> <td>CRIT 140013</td><td>usado para selar o</td></tr><tr><td>sonicador</td><td></td> de banho da câmara de eletroformação <td>n / a</td><td>útil para limpar a câmara de eletroformação, mas não crucial</td></tr><tr><td>Microscópio invertido Nikon TE2000, sistema confocal eC1 (Nikon), com duas linhas de laser (&lambda; = 488 nm e 543 nm); pinças ópticas induzidas por um laser de onda contínua de fibra de itérbio de 5 W (&lambda; > 1070 nm; IPG GmBH Alemanha)</td><td></td><td></td><td>um exemplo de um sistema de microscopia confocal equipado com pinças ópticas</td></tr><tr><td>micromanipuladores</td><td></td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>capilares de borossilicato (com raios interno e externo de 0,78 mm e 1 mm, respectivamente)</td><td>Aparelho Harvard</td><td>30-0036</td><td></td></tr><tr><td>extrator de micropipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2100</td><td></td></tr><tr><td>microforge</td><td>Narishige</td> Atuador piezoelétrico <td>MF-800</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Physik Instrumente</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>grânulos revestidos de estreptavidina de poliestireno (diâmetro 3,2 &micro; m)</td> <td>Spherotech</td><td>SVP-30-5</td><td></td></tr></tbody></table>

puxando a membrana nanotubos de vesículas unilamellar gigante

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

A reformulação da membrana celular é parte integrante de muitos fenômenos celulares, tais como endocitose, tráfico, formação de filopodia, etc. Muitas proteínas diferentes associam com membranas curvadas por causa de sua capacidade de sentir ou induzir a curvatura da membrana. Normalmente, esses processos envolvem uma infinidade de proteínas, tornando-os muito complexa para estudar quantitativamente na célula. Descreveremos um protocolo para reconstituir uma membrana curva em vitro, imitando uma curvada estrutura celular, tais como o pescoço endocítica. Uma vesícula unilamellar gigante (GUV) é usada como um modelo de uma membrana celular, cuja pressão interna e a tensão superficial é controlado com aspiração micropipeta. Aplicando uma força puxando do ponto sobre o chefe usando a Pinça óptica cria um nanotubo de curvatura alta ligada a uma membrana plana. Este método tem sido tradicionalmente usado para medir as propriedades mecânicas fundamentais das membranas de lipídios, tais como rigidez de flexão. Nos últimos anos, tem sido expandido para estudar como as proteínas interagem com a curvatura da membrana e a forma como elas afetam a forma e a mecânica das membranas. Um sistema que combina micromanipulação, microinjeção, pinça óptica e microscopia confocal permite a medição da curvatura da membrana, tensão de membrana e a densidade da superfície das proteínas, simultaneamente. Partir destas medições, muitas propriedades mecânicas e morfológicas importantes do sistema de membrana-proteína podem ser inferidas. Além disso, podemos esquematizar um protocolo de criação de GUVs na presença de concentração de sal fisiológica e um método de quantificar a densidade da superfície das proteínas na membrana de intensidades de fluorescência de rotulada de proteínas e lipídios.

O experimento de puxar o tubo pode dar informações vitais de mecânicas sobre a membrana. Na ausência de proteínas ou outras moléculas que força a par com a curvatura da membrana, a membrana e o raio do tubo pode estar relacionado com a tensão de membrana aplicando o hamiltoniano Canham-Helfrich equação para um tubo retirado um chefe50,51 
<img alt="Equation 3" src="/file...

Muitas proteínas na célula sentem e induzem a curvatura da membrana. Nós descrevemos um método para puxar a membrana nanotubos de vesículas lipídicas para estudar a interação de proteínas ou qualquer molécula de curvatura-ativo com membranas curvo em vitro.

Puxando a membrana nanotubos de vesículas Unilamellar gigante

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

O objetivo geral desta metodologia de extração de nanotubos é estudar quantitativamente as interações entre proteínas específicas de interesse e membranas altamente curvas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia das membranas celulares, como endocitose e tráfego intracelular. Essa técnica nos permite quantificar diretamente como as proteínas se ligam às membranas curvas e as deformam reciprocamente.Inicialmente, esse método foi utilizado para medir as propriedades mecânicas básicas das membranas lipídicas. Recentemente, tem sido aplicado para elucidar mecanismos importantes nas interações da membrana proteica, particularmente nas membranas formadoras de proteínas. Comece coletando as vesículas unilamelares gigantes diretamente dos fios de platina da câmara de eletroformação.Para construir a câmara experimental, coloque duas lamínulas retangulares de vidro separadas por um milímetro em uma base metálica, deixando aberturas ao longo das bordas longas grandes o suficiente para permitir que uma ponta de micropipeta de vidro alcance pelo menos o centro da câmara. Encher a câmara experimental e uma micropipeta de vidro com cinco miligramas por mililitro de uma solução de beta-caseína de alta pureza, tendo o cuidado de evitar bolhas. Enquanto a câmara está sendo passivada, monte-a em um microscópio óptico centralizado acima da objetiva e insira a ponta da micropipeta de aspiração através da abertura ao longo da borda longa até que a ponta esteja acima da objetiva.Ajustar o nível do reservatório de água de modo a que a pressão de aspiração seja próxima de zero e encher uma micropipeta de injecção com a molécula de interesse dissolvida em tampão experimental à concentração experimental adequada. Monte a micropipeta de injeção dentro de um micromanipulador e insira a micropipeta pelo outro lado da câmara experimental. No final da incubação, remova a solução de beta-caseína da câmara e lave a câmara várias vezes com tampão experimental.Em seguida, adicione alguns microlitros de solução de vesícula à câmara, seguidos por alguns microlitros de esferas revestidas com estreptavidina, até uma concentração final de 0,1 vezes 10 para a taxa negativa de 3% de grânulos por volume ou menos. Depois que as vesículas e contas se acomodarem no fundo da câmara, deixe o tampão experimental evaporar por cerca de 15 minutos, momento em que as vesículas devem ondular visivelmente sob um microscópio óptico. Quando as vesículas estiverem adequadamente flexíveis, aspire vesículas individuais para dentro da micropipeta até que os comprimentos das membranas dentro da pipeta sejam iguais ou maiores que o raio da pipeta.Quando uma língua de aspiração de tamanho apropriado for identificada, sele as bordas abertas da câmara com óleo mineral. Para definir a posição zero da pressão de aspiração, posicione a extremidade da pipeta de aspiração perto de um cordão e ajuste a altura do tanque de água para que o cordão não seja sugado nem soprado pela pipeta. Ajustar a altura da água é fundamental para controlar a tensão da membrana da vesícula que é aspirada pela micropipeta.Aspire uma vesícula e mova a micropipeta para cima e para fora de foco sem quebrar a micropipeta. Usando uma pinça óptica, prenda um cordão a aproximadamente 20 micrômetros de distância do fundo da câmara. Traga a vesícula de volta ao foco longe do cordão e alinhada com a armadilha óptica e registre o movimento do cordão por um a dois minutos para medir a posição de equilíbrio.Reduza a pressão dentro da micropipeta o máximo possível sem perder a vesícula para diminuir a tensão da membrana e coloque cuidadosamente a vesícula em contato com o grânulo por cerca de um segundo para estabelecer as ligações estreptavidina-biotina. Em seguida, usando um atuador piezoelétrico, puxe suavemente a vesícula para trás para criar um nanotubo. Aumente a pressão de aspiração para recriar a língua de aspiração e alinhe o tubo dentro do eixo da pipeta de aspiração.Colocar o tubo e a vesícula totalmente em foco e registar o movimento do cordão a uma velocidade de aquisição de 30 hertz e a altura do reservatório de água em relação à posição zero durante alguns minutos sob microscopia de campo claro. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, registre o movimento do cordão novamente em diferentes pressões de aspiração e tensões da membrana. Para injetar proteínas ou moléculas de interesse, aproxime a micropipeta de injeção do nanotubo, tomando cuidado para que o cordão na armadilha óptica não seja perturbado, e injete suavemente as proteínas a um a dois pascais de pressão.Depois que a ligação às proteínas estiver equilibrada, repita as medições passo a passo na presença das proteínas adicionadas, conforme demonstrado para a membrana nua. As medições de força e raio em nanotubos extraídos de vesículas 100% DOPC são independentes, pois a força é medida a partir do deslocamento do cordão na armadilha óptica e o raio da intensidade de fluorescência, fornecendo duas maneiras de calcular a rigidez de flexão da membrana. O enriquecimento relativo de BAR ou proteínas do canal de potássio nos tubos de membrana sobre as vesículas subjacentes indica que as proteínas são mais propensas a se ligar a membranas curvas.De fato, a ligação da endofilina A2 da proteína N-BAR à membrana reduz gradualmente a força do tubo a zero, indicando a formação de um andaime tridimensional que mantém o tubo estável. Após esse procedimento, outras técnicas podem ser combinadas para responder a perguntas adicionais, por exemplo, microscopia de alta resolução para detectar a organização de proteínas em tubos de membrana ou rastreamento de partícula única para medir a mobilidade de proteínas.

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JoVE Journal

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Biologia

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