Puxando a membrana nanotubos de vesículas Unilamellar gigante

O objetivo geral desta metodologia de extração de nanotubos é estudar quantitativamente as interações entre proteínas específicas de interesse e membranas altamente curvas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia das membranas celulares, como endocitose e tráfego intracelular. Essa técnica nos permite quantificar diretamente como as proteínas se ligam às membranas curvas e as deformam reciprocamente.

Inicialmente, esse método foi utilizado para medir as propriedades mecânicas básicas das membranas lipídicas. Recentemente, tem sido aplicado para elucidar mecanismos importantes nas interações da membrana proteica, particularmente nas membranas formadoras de proteínas. Comece coletando as vesículas unilamelares gigantes diretamente dos fios de platina da câmara de eletroformação.

Para construir a câmara experimental, coloque duas lamínulas retangulares de vidro separadas por um milímetro em uma base metálica, deixando aberturas ao longo das bordas longas grandes o suficiente para permitir que uma ponta de micropipeta de vidro alcance pelo menos o centro da câmara. Encher a câmara experimental e uma micropipeta de vidro com cinco miligramas por mililitro de uma solução de beta-caseína de alta pureza, tendo o cuidado de evitar bolhas. Enquanto a câmara está sendo passivada, monte-a em um microscópio óptico centralizado acima da objetiva e insira a ponta da micropipeta de aspiração através da abertura ao longo da borda longa até que a ponta esteja acima da objetiva.

Ajustar o nível do reservatório de água de modo a que a pressão de aspiração seja próxima de zero e encher uma micropipeta de injecção com a molécula de interesse dissolvida em tampão experimental à concentração experimental adequada. Monte a micropipeta de injeção dentro de um micromanipulador e insira a micropipeta pelo outro lado da câmara experimental. No final da incubação, remova a solução de beta-caseína da câmara e lave a câmara várias vezes com tampão experimental.

Em seguida, adicione alguns microlitros de solução de vesícula à câmara, seguidos por alguns microlitros de esferas revestidas com estreptavidina, até uma concentração final de 0,1 vezes 10 para a taxa negativa de 3% de grânulos por volume ou menos. Depois que as vesículas e contas se acomodarem no fundo da câmara, deixe o tampão experimental evaporar por cerca de 15 minutos, momento em que as vesículas devem ondular visivelmente sob um microscópio óptico. Quando as vesículas estiverem adequadamente flexíveis, aspire vesículas individuais para dentro da micropipeta até que os comprimentos das membranas dentro da pipeta sejam iguais ou maiores que o raio da pipeta.

Quando uma língua de aspiração de tamanho apropriado for identificada, sele as bordas abertas da câmara com óleo mineral. Para definir a posição zero da pressão de aspiração, posicione a extremidade da pipeta de aspiração perto de um cordão e ajuste a altura do tanque de água para que o cordão não seja sugado nem soprado pela pipeta. Ajustar a altura da água é fundamental para controlar a tensão da membrana da vesícula que é aspirada pela micropipeta.

Aspire uma vesícula e mova a micropipeta para cima e para fora de foco sem quebrar a micropipeta. Usando uma pinça óptica, prenda um cordão a aproximadamente 20 micrômetros de distância do fundo da câmara. Traga a vesícula de volta ao foco longe do cordão e alinhada com a armadilha óptica e registre o movimento do cordão por um a dois minutos para medir a posição de equilíbrio.

Reduza a pressão dentro da micropipeta o máximo possível sem perder a vesícula para diminuir a tensão da membrana e coloque cuidadosamente a vesícula em contato com o grânulo por cerca de um segundo para estabelecer as ligações estreptavidina-biotina. Em seguida, usando um atuador piezoelétrico, puxe suavemente a vesícula para trás para criar um nanotubo. Aumente a pressão de aspiração para recriar a língua de aspiração e alinhe o tubo dentro do eixo da pipeta de aspiração.

Colocar o tubo e a vesícula totalmente em foco e registar o movimento do cordão a uma velocidade de aquisição de 30 hertz e a altura do reservatório de água em relação à posição zero durante alguns minutos sob microscopia de campo claro. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, registre o movimento do cordão novamente em diferentes pressões de aspiração e tensões da membrana. Para injetar proteínas ou moléculas de interesse, aproxime a micropipeta de injeção do nanotubo, tomando cuidado para que o cordão na armadilha óptica não seja perturbado, e injete suavemente as proteínas a um a dois pascais de pressão.

Depois que a ligação às proteínas estiver equilibrada, repita as medições passo a passo na presença das proteínas adicionadas, conforme demonstrado para a membrana nua. As medições de força e raio em nanotubos extraídos de vesículas 100% DOPC são independentes, pois a força é medida a partir do deslocamento do cordão na armadilha óptica e o raio da intensidade de fluorescência, fornecendo duas maneiras de calcular a rigidez de flexão da membrana. O enriquecimento relativo de BAR ou proteínas do canal de potássio nos tubos de membrana sobre as vesículas subjacentes indica que as proteínas são mais propensas a se ligar a membranas curvas.

De fato, a ligação da endofilina A2 da proteína N-BAR à membrana reduz gradualmente a força do tubo a zero, indicando a formação de um andaime tridimensional que mantém o tubo estável. Após esse procedimento, outras técnicas podem ser combinadas para responder a perguntas adicionais, por exemplo, microscopia de alta resolução para detectar a organização de proteínas em tubos de membrana ou rastreamento de partícula única para medir a mobilidade de proteínas.