Confocal da imagem latente do Neuropeptide Y-pHluorin: uma técnica para visualizar a exocitose de grânulo de insulina em ilhotas murino e humanas intactas

O objetivo geral deste ensaio é visualizar a exocitose de grânulos de insulina em tempo real em ilhotas pancreáticas intactas por microscopia confocal. Este método responderá a questões fundamentais na área do diabetes. Por exemplo, o que regula a exocitose da insulina?

Isso é crítico porque a fusão de grânulos é o evento mais importante na vida de uma célula beta. A principal vantagem desta técnica é que podemos usar ilhotas intactas e observar eventos de fusão em células dentro de seu ambiente natural. Madina Mahkmutova, uma estudante de doutorado do nosso laboratório, demonstrará a técnica.

Para começar, após a chegada dos ilhotas pancreáticas, transfira-as para tubos cônico de 50 mililitros e centrifugue a suspensão de ilhotas a 1.000 rotações por minuto durante cinco minutos. As ilhotas se acumularão no fundo do tubo; transfira as ilhotas em dois mililitros de meio de cultura CMRL para placas de Petri de 35 milímetros não tratadas para cultura de tecidos e incube-as a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas antes da infecção viral. Após o seu isolamento, re-suspenda aproximadamente equivalentes de ilhotas pancreáticas de camundongo em dois mililitros de meio de cultura CMRL e transfira-os para placas de Petri de 35 milímetros não tratadas para cultura de tecidos.

Incube o tecido a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas antes da infecção viral. Para realizar a infecção viral, adicione de cinco a 10 microlitros de vírus estoque a cada placa de Petri de 35 milímetros contendo ilhotas humanas ou de camundongo em dois mililitros de meio de cultura CMRL. Após cultivar as ilhotas por 24 horas, aspire o meio e substitua por dois mililitros de meio de cultura CMRL sem vírus.

Cultive os ilhotas por quatro a seis dias, substituindo o meio a cada três dias. Prepare a solução extracelular combinando os reagentes listados aqui e, em seguida, filtre esterilize o tampão. Prepare o meio de glicose basal com uma concentração final de glicose de três milimolares, adicionando 75 microlitros de estoque de glicose dois molares a 50 mililitros de solução extracelular.

Em seguida, para preparar o meio hiperglicêmico com concentração final de 16 milimolar de glicose, adicione 400 microlitros de solução estoque de glicose 2 molar a 50 mililitros da solução extracelular. Dilua quaisquer estímulos adicionais e a solução extracelular contendo 3 milimolar de glicose. Antes de iniciar um experimento, pré-trate as lamínulas com 30 microlitros de solução de poli-d-lisina a 1 miligrama por mililitro e incube por uma hora.

Em seguida, use água para lavar completamente as lamínulas. Pelo menos uma hora antes do experimento, transfira um grupo de ilhotas para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo solução extracelular com três milimolares de glicose. Mantenha as ilhotas restantes a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Trinta minutos antes de iniciar um experimento, fixe a lamínula à câmara de imagem usando graxa de silicone para selá-la. Em seguida, fixe a câmara de imagem à plataforma de imagem. Depois, com uma pipeta, transfira de 20 a 30 ilhotas para a área da lamínula tratada com poli-d-lisina e deixe as ilhotas aderirem à superfície por 20 minutos.

Esta etapa é crítica para o sucesso do experimento e coletamos aproximadamente 20 a 30 ilhotas em menos de 10 microlitros de tampão e aguardamos 20 minutos. É importante não deixar a lamínula secar completamente, para evitar danos às ilhotas. Enquanto as ilhotas estão aderindo à lamínula, prepare o sistema de perfusão utilizando água para enxaguá-lo completamente.

Em seguida, adicione cada solução a um canal diferente, de acordo com esta tabela. Remova todas as bolhas do sistema abrindo cada canal separadamente e deixando a solução fluir por alguns minutos. Certifique-se de que o fluxo seja constante e de que os tubos não estejam com vazamentos.

Em seguida, conecte o aquecedor de solução em linha única ao tubo de saída da perfusão e ajuste a temperatura do tampão em fluxo para 37 graus Celsius. Depois, prepare a bomba de sucção. Conecte a tubulação, ligue a bomba e certifique-se de que o líquido está sendo aspirado.

Coloque a plataforma de imagem com os ilhotas sobre a platina do microscópio e conecte-a ao sistema de perfusão e à bomba de sucção. Em seguida, encha suavemente a câmara de imagem com a solução extracelular contendo três milimolares de glicose. Para realizar a imagem confocal, localize os ilhotas no campo do microscópio com baixa ampliação.

Uma vez focado nos ilhotas, mude para objetivas de maior aumento. Abra o software de aquisição e ative o modo de varredura residente. Selecione a imagem xyzt e, em seguida, para configurar as configurações de aquisição, ligue o laser de argônio e ajuste-o para 30% e então a linha de laser de 488 nanômetros, ajustando a potência do laser para cerca de 50% para excitação de pHluorin.

Colete a emissão em 505 a 555 nanômetros, utilizando o espectro de emissão do EGFP como referência. Escolha uma resolução de 512 por 512 pixels. Inicie a aquisição de imagens pressionando o botão de visualização em tempo real e ajuste os níveis de ganho.

Defina o início do z stack focando no topo do ilhotas e escolhendo "iniciar", depois mova-se até o último plano que pode ser focado e escolha "n". Escolha um tamanho de z stack de cinco micrômetros. Defina o intervalo de tempo para a aquisição de cada z stack próximo a 1,5 a 2 segundos e selecione a opção "adquirir até parar" para imageamento contínuo.

Em seguida, pressione o botão de início para inicializar a aquisição de imagens. Consulte o protocolo descrito no texto para os protocolos de estimulação que induzem a exocitose de grânulos. Utilizando o scanner integrado, imagens confocais da ilhota são adquiridas como gravações em lapso de tempo em menos de dois segundos.

Além disso, esta técnica pode ser combinada com corantes para imagem funcional, como corantes para potencial de membrana ou cálcio livre citosólico. Para determinar se a NP Y-pHluorina é realmente uma ferramenta adequada para monitorar a dinâmica das granulações de insulina, ilhotas infectadas foram imunomarcadas com anticorpos contra GFP para NP Y-pHluorina e os hormônios das ilhotas insulina, somatostatina ou glucagon. A maioria das células que expressavam NP Y-pHluorina eram células beta, pois também expressavam insulina.

Apenas algumas poucas células alfa positivas para glucagon ou células delta positivas para somatostatina foram marcadas com GFP. Importante, nas células infectadas, a fusão de NP Y co-localizou-se com insulina. Esta figura demonstra que o pHluorin é um sensor de pH eficaz.

Como o aumento do pH intracelular com cloreto de amônio 50 milimolar resultou em um aumento superior a 500% na fluorescência intracelular. À medida que o pH dentro do grânulo aumenta após a fusão com a membrana plasmática na abertura do poro de fusão, grânulos contendo NP Y-pHluorin tornam-se visíveis sob condições que estimulam a exocitose de insulina, como a despolarização da membrana com cloreto de potássio. Utilizando imagens confocais com lapso de tempo de ilhotas infectadas com NP Y-pHluorin, eventos secretórios individuais em células beta dentro de ilhotas intactas podem ser visualizados.

Esses ocorrem em resposta à despolarização direta da membrana com cloreto de potássio ou vários outros estímulos fisiológicos. Na concentração basal de glicose extracelular, observa-se pouca atividade secretora. No entanto, a fusão dos grânulos com a membrana plasmática é desencadeada em resposta à estimulação com alta concentração de glicose.

Após este procedimento, outros métodos como a imuno-histoquímica podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como por que a fusão de grânulos ocorre em regiões específicas da célula. Após seu desenvolvimento, esta técnica tem sido usada para explorar o padrão temporal da secreção de grânulos de insulina em populações de células beta, em ilhotas humanas.