Confocal da imagem latente do Neuropeptide Y-pHluorin: uma técnica para visualizar a exocitose de grânulo de insulina em ilhotas murino e humanas intactas

O objetivo geral deste ensaio é visualizar a exocitose do grânulo de insulina em tempo real em ilhotas pancreáticas intactas por microscopia confocal. Este método responderá a perguntas-chave no campo do diabetes. Por exemplo, o que regula a exocitose da insulina?

Isso é crítico porque a fusão de grânulos é o evento mais importante na vida de uma célula melhor. A principal vantagem desta técnica é que podemos usar ilhotas intactas, podemos ver eventos de fusão nas células dentro de seu ambiente nativo. Madina Mahkmutova, uma estudante de doutorado do nosso laboratório, demonstrará a técnica.

O início, após a chegada das ilhotas pancreáticas, transfere-as para tubos de falcão de 50 mililitros e centrifuga a suspensão das ilhotas a 1.000 rotações por minuto por cinco minutos. As ilhotas serão coletadas no fundo do tubo, transferirão as ilhotas em dois mililitros de meio de cultura CMRL para placas de Petri tratadas sem cultura de tecidos de 35 milímetros e as incubarão a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas antes da infecção viral. Após o isolamento, ressuspenda aproximadamente os equivalentes de ilhotas pancreáticas de camundongos em dois mililitros de meio de cultura CMRL e transfira-os para placas de Petri de cultura sem tecidos de 35 milímetros.

Incube o tecido a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas antes da infecção viral. Para realizar a infecção viral, adicione de cinco a 10 microlitros de vírus estoque a cada placa de Petri de 35 milímetros contendo ilhotas humanas ou de camundongos em dois mililitros de meio de cultura CMRL. Após 24 horas de cultura dos ilhéus, aspirar o meio e substituí-lo por dois mililitros de meio de cultura CMRL sem vírus.

Cultive as ilhotas por quatro a seis dias, substituindo o meio a cada três dias. Prepare a solução extracelular combinando os reagentes listados aqui e, em seguida, filtre e esterilize o tampão. Faça o meio de glicose basal para uma concentração final de glicose de três milimolares, adicionando 75 microlitros de estoque de glicose de dois molares a 50 mililitros de solução extracelular.

Em seguida, para preparar o meio hiperglicêmico para uma concentração final de glicose de 16 milimolares, adicione 400 microlitros de estoque de glicose de dois molares a 50 mililitros de solução extracelular. Dilua quaisquer estímulos adicionais e solução extracelular contendo glicose trimilimolar. Antes de iniciar um experimento, pré-trate as lamínulas com 30 microlitros de um miligrama por mililitro de solução de poli-d-lisina e incube por uma hora.

Em seguida, use água para enxaguar bem as lamínulas. Pelo menos uma hora antes do experimento, transferir um grupo de ilhotas para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo solução extracelular com glicose três milimolares. Mantenha as ilhotas restantes a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

30 minutos antes de iniciar um experimento, prenda a lamínula na câmara de imagem usando graxa de silicone para selá-la. Em seguida, fixe a câmara de imagem na plataforma de imagem. Em seguida, usando uma pipeta, transfira 20 a 30 ilhotas para a área tratada com poli-d-lisina da lamínula e deixe as ilhotas aderirem à superfície por 20 minutos.

Esta etapa é fundamental para o sucesso do experimento e coletamos aproximadamente 20 a 30 ilhotas em menos de 10 microlitros de tampão e aguardamos 20 minutos. É importante não deixar a cobertura secar completamente, para evitar danos às ilhotas. Enquanto as ilhotas estão aderidas à lamínula, prepare o sistema de perfusão usando água para enxaguá-lo bem.

Em seguida, adicione cada solução a um canal diferente, de acordo com esta tabela. Remova todas as bolhas do sistema abrindo cada canal separadamente e deixando a solução fluir por alguns minutos. Certifique-se de que o fluxo seja consistente e que a tubulação não esteja vazando.

Em seguida, conecte ao aquecedor de solução em linha único ao tubo de saída de perfusão e ajuste a temperatura do buffer de fluxo de saída para 37 graus Celsius. Em seguida, prepare a bomba de sucção. Conecte a tubulação, ligue a bomba e certifique-se de que o líquido está sendo aspirado.

Coloque a plataforma de imagem com as ilhotas no microscópio stage e conecte-a ao sistema de perfusão e à bomba de sucção. Em seguida, encha suavemente a câmara de imagem com a solução extracelular contendo glicose três milimolares. Para realizar imagens confocais, localize as ilhotas no campo do microscópio com baixa ampliação.

Uma vez focado nas ilhotas, mude para objetivas de maior ampliação. Abra o software de aquisição e ative o modo de digitalização residente. Selecione a imagem xyzt e, em seguida, para definir as configurações de aquisição, ligue o laser de argônio e defina-o para 30% e, em seguida, a linha de laser de 488 nanômetros, ajustando a potência do laser para cerca de 50% para excitação de pHluorin.

Coletar emissão de 505 a 555 nanômetros, usando o espectro de emissão EGFP como guia. Escolha uma resolução de 512 por 512 pixels. Inicie a geração de imagens pressionando o botão ao vivo e ajuste os níveis de ganho.

Defina a extremidade inicial da pilha z concentrando-se no topo da ilhota e escolhendo begin e, em seguida, movendo-se para o último plano que pode ser focalizado e escolhendo n. Escolha um tamanho de pilha z de cinco micrômetros. Defina o intervalo de tempo para aquisição de cada pilha z próximo a 1,5 a 2 segundos e escolha a opção adquirir até parar para imagens contínuas.

Em seguida, pressione o botão Iniciar para inicializar a imagem. Consulte o protocolo de texto para protocolos de estimulação para induzir exocitose de grânulos. Usando o scanner residente, as imagens confocais da ilhota são adquiridas como gravações em timelapse em menos de dois segundos.

Além disso, essa técnica pode ser combinada com corantes para imagens funcionais, como potencial membra ou corantes de cálcio livre citosólico. Para determinar se a NP Y-pHluorina é de fato uma ferramenta adequada para monitorar a dinâmica dos grânulos de insulina, as ilhotas infectadas foram imunomarcadas com anticorpos contra GFP para NP Y-pHluorina e os hormônios das ilhotas insulina, somatostatina ou glucagon. A maioria das células que expressam NP Y-pHluorina eram células beta, pois também expressavam insulina.

Apenas algumas células alfa positivas para glucagon ou células delta positivas para somatostatina foram marcadas com GFP. É importante ressaltar que em células infectadas, a fusão NP Y co-localizada com insulina. Esta figura demonstra que a pHluorina é um sensor de pH eficaz.

Como o aumento do pH intercelular com cloreto de amônio 50 milimolar resultou em um aumento superior a 500% na fluorescência intercelular. À medida que o pH dentro do grânulo aumenta após a fusão com a membrana plasmática na abertura do poro de fusão, os grânulos contendo NP Y-pHluorina tornam-se visíveis sob condições que estimulam a exocitose da insulina, como despolarização da membrana com cloreto de potássio. Usando imagens de lapso de tempo confocal de ilhotas infectadas com NP Y-pHluorin, eventos secretais únicos em células beta dentro de ilhotas intactas podem ser visualizados.

Estes ocorrem em resposta à despolarização direta da membrana com cloreto de potássio ou vários outros estímulos fisiológicos. Na concentração basal de glicose extracelular, observa-se pouca atividade secretária. No entanto, a fusão do grânulo com a membrana plasmática é desencadeada em resposta à estimulação com glicose alta.

Após este procedimento, outros métodos, como imuno-histoquímica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como por que a fusão de grânulos ocorre em regiões específicas da célula. Após seu desenvolvimento, esta técnica tem sido utilizada para explorar o padrão temporal de secreção de grânulos de insulina em populações de células beta, em ilhotas humanas.