In Vitro Caracterização das propriedades eletrofisiológicas das fibras aferentes do cólon em ratos

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar a metodologia para os registros eletrofisiológicos dos nervos sensoriais do colorreto in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da caneta in vitro, como a contribuição da sensibilidade dos eferentes periféricos externos para corrigir a hiperalgesia. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a distinção do colorreto da mesma forma que a distinção carotídea é realizada in vivo, em animais ou em pacientes.

A demonstração visual desse método é crítica porque localizar os gânglios e dissecar os nervos é relativamente difícil. Para iniciar este procedimento, exponha a cavidade abdominal de um rato profundamente anestesiado, realizando uma incisão na linha média da parede abdominal usando um bisturi. Depois, puxe o mesentério e outros tecidos para o lado para expor o colorreto.

Em seguida, coloque o animal sob o microscópio de dissecação. Por meio de uma dissecção cuidadosa, localize o gânglio pélvico esquerdo e identifique os nervos pélvicos e os nervos esplâncnicos lombares que se juntam a ele. Posteriormente, corte esses nervos a alguns milímetros de distância do gânglio pélvico.

Localizar o gânglio pélvico e dissecar os nervos é a etapa mais crítica e difícil desse procedimento. Em seguida, corte o osso da sínfise para expor o reto. Remova os tecidos acima do colorreto e tome cuidado para deixar o gânglio pélvico intacto.

Depois de sacrificar o rato por injeção intravenosa de uma overdose de pentobarbital, faça o transecto do cólon cerca de três centímetros acima do gânglio pélvico e remova o colorreto do animal usando uma pinça. Em seguida, transfira o colorreto para uma placa de Petri preenchida com solução de Krebs pré-resfriada. Remova as fezes lavando suavemente o cólon.

Em seguida, remova a bexiga urinária remanescente e outros tecidos com cuidado, sem comprometer o gânglio pélvico. Neste procedimento, coloque o cólon em uma câmara de registro e profusa o tecido continuamente com solução de Krebs carbogenada. Em seguida, canule o colorreto nas extremidades oral e anal, em seguida, inicie a infusão intraluminal do cólon com solução salina na direção oral para anal, depois disso, localize o gânglio pélvico principal sob o microscópio de dissecação e use alfinetes de insetos para expor o gânglio.

Com uma dissecção cuidadosa, encontre um ramo fino do nervo que emana do gânglio e corre em direção ao cólon e, em seguida, corte o nervo próximo ao gânglio. Antes da próxima etapa, ligue o banho de aquecimento e mantenha a solução de Krebs a 34 graus Celsius. Agora, inspecione uma pipeta de vidro pré-puxada sob o microscópio de dissecação.

Quebre a ponta do eletrodo com uma pinça para que fique de tamanho compatível com o diâmetro do nervo a ser registrado. Em seguida, chanfre a ponta colocando-a perto de um alargamento mais leve. Novo nesta metodologia também pode achar complicado chanfrar a ponta do eletrodo compatível com o tamanho do nervo.

Em seguida, coloque o eletrodo chanfrado no suporte do eletrodo e, em seguida, conecte uma seringa de 10 mililitros à porta lateral do suporte para a aplicação de pressão negativa ou positiva no eletrodo. Depois disso, conecte o suporte ao estágio principal do bio amplifier e monte o estágio principal em um manipulador. Em seguida, mova o eletrodo para o banho de tecido e encha o eletrodo com a solução de Krebs aplicando uma sucção suave até entrar em contato com o fio de prata do suporte.

Em seguida, coloque a ponta do eletrodo perto da extremidade cortada do nervo e aplique pressão negativa para sugar o nervo para dentro do eletrodo. Em seguida, aplique mais pressão negativa, de modo que cerca de um milímetro do nervo seja puxado para dentro do eletrodo e forme uma vedação hermética. Agora, ligue o bio amplificador e defina o filtro para 300 a três mil hertz.

Monitore o sinal no osciloscópio e registre o sinal nervoso e o sinal de pressão intraluminal no software de processamento de dados de pico. Em seguida, aplique a distensão de rampa do cólon fechando a torneira de três vias na cânula de saída enquanto infunde continuamente intraluminalmente. Monitore a pressão intraluminal até atingir 60 milímetros de mercúrio e, em seguida, abra a torneira de três vias na cânula de drenagem.

Repita este procedimento em intervalos regulares de quinze minutos e aplique drogas extra ou intraluminalmente para testar a sensibilidade química dos nervos aferentes. Aqui está a ilustração esquemática da configuração experimental para a preparação do colorreto do tubo ex vivo com uma gravação representativa de um nervo distal ao gânglio pélvico. Nas preparações de ratos normais, os nervos aferentes do cólon normalmente têm um baixo nível de atividade espontânea regular.

A distensão do cólon na rampa induz um aumento gradual na taxa de disparo. A propriedade mecanossensorial de cada nervo é representada pela plotagem da curva de resposta nervosa aferente da pressão intraluminal. Alternativamente, o registro pode ser feito a partir de um ramo dos nervos pélvicos proximal ao gânglio pélvico.

O perfil da atividade mecanossensorial dos nervos pélvicos proximais é geralmente semelhante ao observado no nervo distal ao gânglio pélvico. A análise de componentes principais das formas de onda dos potenciais de ação do registro de várias unidades pode ser feita para discriminar a atividade de uma única unidade. Aqui estão as formas de onda sobrepostas de dois aferens pélvicos individuais.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas se for executada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão da anatomia dos gânglios pélvicos principais e dos outros nervos e ser capaz de localizar os gânglios para dissecar os nervos e registrar a atividade aferente. Uma vantagem desse protocolo é que ele pode permitir a comparação das propriedades eletrofisiológicas e dos perfis farmacológicos dos nervos aferentes pélvicos e esplâncnicos.