Name: Um guia para a produção, cristalização e determinação da estrutura de IKK1 humana/α (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Aprenda a produzir, cristalizar e determinar a estrutura da IKK1 humana para compreender sua função de sinalização. Este método facilita o design racional de fármacos em biologia estrutural.

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Agradecemos os funcionários a 19ID de Luz Síncroton, 24ID e 13ID no Advanced Photon Source, Lemont, IL, pelo apoio durante a coleta de dados em vários cristais. Nós estamos gratos ao Dmitry Lyumkis, Instituto Salk para buscar-no mapa de cryo-EM baixa resolução em estágios iniciais EM mapa/modelo de edifício, que foi usado para construir o modelo de pesquisa de substituição molecular inicial do IKK1. A pesquisa que conduz a estes resultados recebeu financiamento de bolsas NIH AI064326, CA141722 e GM071862 para GG. SP é atualmente um Wellcome Trust DBT Índia intermediário companheiro.

<ol><li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB%2C+an+active+player+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+immunology+research%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li>
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<li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+meets+ubiquitination%3A+the+control+of+NF-%5Bkappa%5DB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li>
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<li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li>
<li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li>
<li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li>
<li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+%28IKK%29+contains+two+kinase+subunits%2C+IKKalpha+and+IKKbeta%2C+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li>
<li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li>
<li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+cloning+of+NEMO%2C+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li>
<li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+%28IKK%29+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li>
<li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li>
<li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li>
<li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li>
<li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+IKKalpha+of+a+second%2C+evolutionary+conserved%2C+NF-kappa+B+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li>
<li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li>
<li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li>
<li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+%28IKKalpha%29+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li>
<li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li>
<li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+%28NIK%29+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li>
<li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1%2C+cIAP2%2C+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li>
<li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li>
<li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li>
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</ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.

Solução de produção, cristalização e estrutura de duas proteínas IKK relacionadas Partimos para determinar a estrutura de cristal de raio-x de IKK1/α com a noção de que seria um exercício relativamente simples, dado a nossa experiência com a produção de proteína IKK2/β, cristalização e a determinação de estrutura. No entanto, nos surpreendemos altamente que essas duas proteínas relacionadas comportou-se muito diferentemente em relação a facilidade de cristalização. Apesar dos esforços de vários labora...

Atividades transcriptional da família NF-κB de factores de transcrição dimérica são necessárias para diversas funções celulares, variando de inflamação e imunidade a sobrevivência e a morte. Estas actividades são rigorosamente controladas em células e uma perda de regulamento conduz a diversas condições patológicas, incluindo doenças auto-imunes e câncer1,2,3. Na ausência de um estímulo, as atividades do NF-κB são mantidas inibidas pelo i-κB (inibidor da - κB) proteínas4. A fosforilação de resíduos específicos de EMISSAO SERIE sobre proteínas i κB marca-los para ubiquitination e degradação proteasomal subsequentes ou processamento seletivo5. As duas cinases Ser/Thr altamente homólogas, IKK2/β e IKK1/α, atuam como centrais reguladores das actividades do NF-κB realizando esses eventos de fosforilação6,7.
Interações entre um ligante e um receptor transduces um sinal através de uma série de mediadores, levando à ativação de fatores de NF-κB. O processo de sinalização do NF-κB pode ser classificado em duas vias distintas – canônica e não-canônicos (alternativo)8. A atividade de IKK2/β regula principalmente o NF-κB sinalização do percurso canônico que é essencial para inflamatória e inata respostas imunes9. Uma característica distinta deste percurso é uma ativação rápida e de curta duração de IKK2/β10 dentro de um complexo de IKK até então bioquimicamente descaracterizada — presume-se que seja composto de IKK1 e IKK2, bem como um componente regulamentar, NEMO (NF-κB modulador essencial )11,12,13. Entre as duas subunidades IKK catalíticas do complexo IKK, IKK2 é principalmente responsável14 para a fosforilação de resíduos específicos de protótipos IκBs (α - β e γ-) vinculado a NF-κB e também uma proteína i κB atípica, NF-κB1/p105, que é um precursor do NF-κB p50 subunidade5. Fosforilação induzido ubiquitination e degradação proteasomal de i κB (ou processamento de p105) leva à liberação e ativação de um conjunto específico de NF-κB dímeros15. Aberrante atividade do NF-κB devido a função mis regulamentada de IKK2 tem sido observada em muitos cânceres, bem como em doenças auto-imunes2,3,16.
Em contraste com IKK2/β, a atividade de IKK1/α regula NF-κB sinalização da via não-canônicos, que é essencial para o desenvolvimento e a imunidade. IKK1 fosforila resíduos específicos da NF-κB2/p100 em seu segmento IκBδ C-terminal, que leva ao seu processamento e geração de p52. A formação de p52:RelB transcricionalmente ativo heterodímero inicia uma resposta lenta e sustentada para sinais do desenvolvimento7,17,18,19,20. Curiosamente, a geração da central NF-κB fator p52 este percurso é criticamente dependente de outro fator,21,NF-κB induzindo quinase (NIK)22, mas não no IKK2 ou NEMO. Nas células de descanso, o nível de NIK permanece baixo devido a sua constante degradação proteossomo dependente23,24,25. Após estimulação das células por ligantes 'não-canônicos' e em certas células malignas, NIK torna-se estabilizada para recrutar e ativar IKK1 / α. atividades da quinase de NIK e IKK1 são essenciais para o processamento eficiente de p100 em p527. IKK1 e NIK fosforilar três serinas (Ser866, 870 e 872) da NF-κB2/p100 em seu segmento IκBδ C-terminal, levando para seu processamento e geração de p52. Aberrante ativação da via não-canônicos tem sido implicada em muitas Neoplasias, incluindo mieloma múltiplo de27,26,28.
Vários inibidores altamente eficientes e específicos para IKK2/β são conhecidos, embora nenhum até agora têm acabou por ser uma droga eficaz. Em contraste, os inibidores específicos/α-IKK1 são escassos. Isto pode se originar em parte de nossa falta de informações estruturais e bioquímicas na IKK1/α, que limita a nossa compreensão da base mecanicista da ativação do NF-κB pelo IKK1 em células e desenho racional de droga. As estruturas de raio-x de IKK2/β nos forneceram insights sobre o mecanismo de ativação de IKK2/β29; no entanto, essas estruturas não poderiam revelar como diferentes estímulos montante desencadear a ativação de IKK1/α ou β/IKK2 para regular a conjuntos distintos de NF-κB atividades 30,31. Para entender a base mecanicista subjacente a distinta função sinalização de IKK1/α e estabelecer uma plataforma para o projeto racional da droga, focamos na determinação da estrutura de IKK1/α.

<table><tbody><tr><td>Cellfectin/Cellfectin II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362100</td><td>Cellfectin foi descontinuado, substituído por Cellfectin II</td></tr><tr><td>Sf900 III Meio de célula de inseto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>Células SF9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12659017</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-IKK1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56704</td><td>Anteriormente vendido pela Imgenex</td></tr><tr><td>anticorpo anti-PentaHis</td><td>Qiagen</td><td>34460</td><td></td></tr><tr><td>membrana PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Nitrocelulose também pode ser usado</td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagente de ensaio</td><td>BioRad</td><td>500001</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 coluna</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>Amicon concentrador</td><td>Millipore</td><td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td><td></td></tr><tr><td>Composto A</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbiochem IKK-inhibitor XII</td><td>Calbiochem</td><td>401491</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>SIGMA</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>MLN120B</td><td>Millenium</td><td>Item</td><td></td>de presente</tr><tr><td>AMPPNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dextrano</td><td>SIGMA</td><td>51227, 42867, 31404,</td><td></td></tr> <tr><td>sulfato de dextrano</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62101</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>SIGMA</td><td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td><td>Alguns deles são novos Cat # no catálogo SIGMA. O que tínhamos era originalmente de Fluka que tinha Cat # diferente.</td></tr><tr><td>Telas de</td><td></td><td></td><td></td>cristalização</tr><tr><td>Crystal Screen I e II (Crystal Screen HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-130</td><td></td></tr><tr><td>Index HT</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-134</td><td></td></tr><tr><td>PEG/Ion e PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>PEGRX 1 e PEGRx 2 (PEGRx HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-086</td><td></td></tr><tr><td>SaltRx 1 e SaltRx 2 (SaltRx HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>Crystal monta</td><td>Hampton Research</td><td>HR8-188, 190, 192, 194</td><td></td></tr><tr><td>Síncrotron</td><td>A Fonte Avançada de Fótons (APS) no Departamento de Energia dos EUA' s Linha de</td><td>luz 19 do</td> Laboratório Nacional de Argonne <td>ID A Fonte Avançada de Fótons (APS) no Departamento de Energia dos EUA ' O Laboratório Nacional Argonne fornece feixes de raios-X gerados por anéis de armazenamento ultrabrilhantes e de alta energia para pesquisa em quase todas as disciplinas científicas.</td></tr></tbody></table>

um guia para a produção, cristalização e determinação da estrutura de ikk1 humana/α

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Uma classe de estímulos extracelulares requer ativação de IKK1/α para induzir a geração de uma subunidade de NF-κB, p52, através do processamento de seu precursor p100. P52 funciona como um homodímero ou heterodímero com outra subunidade de NF-κB, RelB. Esses dímeros regulam, por sua vez, a expressão de centenas de genes envolvidos na inflamação, sobrevivência da pilha e ciclo celular. IKK1/α permanece principalmente associado com IKK2/β e NEMO como um complexo ternário. No entanto, uma pequena piscina de também é observada como um complex(es) de baixo peso molecular. Desconhece-se a actividade de transformação de p100 é desencadeada por ativação de IKK1/α dentro a maior ou a menor piscina complexa. Atividade constitutiva de IKK1/α foi detectada em vários tipos de câncer e doenças inflamatórias. Para entender o mecanismo de ativação de IKK1/α e permitir a sua utilização como um alvo de drogas, manifestámos IKK1/α recombinante em sistemas de host diferentes, tais como Escherichia coli, inseto e células de mamíferos. Conseguimos expressar IKK1/α solúvel em baculovirus infectados células de inseto, obtenção de quantidades de mg de proteína altamente pura, cristaliza na presença de inibidores e determinar sua estrutura de cristal de raio-x. Aqui, descrevemos as etapas detalhadas para produzir a proteína recombinante, sua cristalização e sua determinação de estrutura de cristal de raio-x.

Clonagem e expressão de diferentes construções da IKK1/α Comprimento total que ikk1/α humano foi clonado no pFastBacHTa de vetor de expressão baculovirus dentro de seus sítios de restrição EcoRI e NotI para obter um N-terminal hexa-histidina marcados IKK1. A tag pode ser removida por digestão de protease TEV. Desde que o comprimento total IKK1/α contém regiões flexíveis em ambas as extremidades, e regiões flexíveis geralmente tornam uma proteína difícil cristalizar, nó...

I κB quinase 1/α (IKK1/α CHUK) é uma Ser/Thr proteína quinase que está envolvida em uma miríade de atividades celulares, principalmente através da ativação de fatores de transcrição NF-κB. Aqui, descrevemos as principais etapas necessárias para a produção e a determinação de estrutura de cristal desta proteína.

Um guia para a produção, cristalização e determinação da estrutura de IKK1 humana/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

O objetivo deste procedimento é orientar a produção, cristalização e determinação estrutural do IKK1-alfa humano, a fim de compreender a base mecanicista de sua função de sinalização e estabelecer plataformas para o design racional de drogas. Esse método deve ajudar os pesquisadores a determinar a estrutura do IKK1, que forneceria respostas às principais consultas no campo da sinalização imunológica. Esta técnica descreve um caminho simplificado para a obtenção de cristais de proteínas IKK, que são bastante refratários à cristalização e para fornecer várias informações críticas na superação de gargalos na determinação das estruturas.Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão, porque gerar quantidades miligramas de proteína solúvel e bem comportada requer sua expressão em células de insetos, e a cristalização pode ser feita sob apenas uma janela altamente estreita de condições. O procedimento de substituição molecular utilizado na determinação da estrutura do IKK1 também pode ser muito complicado, especialmente devido à má propriedade de deflexão dos cristais, não no local da unidade assimétrica contendo muitas moléculas IKK1 na ausência de modelos de busca adequados. Demonst

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Concepção de fármacos com base Estrutura desempenha um papel importante no desenvolvimento de medicamentos. Prosseguindo alvos múltiplos em paralelo aumenta a chance de sucesso para a descoberta de chumbo. O seguinte artigo destaca como o Seattle Center Structural Genomics para Doenças Infecciosas utiliza uma abordagem multi-alvo para determinação da influenza A subunidade PB2 gene-to-estrutura.

Abordagem de processamento paralelo multi-alvo para Gene-a-estrutura Determinação da polimerase da gripe PB2 Subunidade

Estrutura cristalina de complexos DNA-proteína pode fornecer informações sobre a função da proteína, mecanismo, assim como, a natureza da interacção específica. Aqui, nós relatamos como otimizar o comprimento, a sequência e as extremidades do DNA duplex para co-cristalização...

Iterativo Otimização de Duplexos de DNA para Cristalização de SEQA-Complexos de DNA

β proteínas da membrana externa (OMPs) servem a muitas funções dentro das membranas externas de bactérias Gram-negativas, mitocôndrias e cloroplastos. Aqui, esperamos aliviar um gargalo conhecido em estudos estruturais, apresentando protocolos para a produção de OMPs de β barril em quantidades suficientes para determinação de estrutura por cristalografia de raios-X ou espectroscopia de RMN.

A partir de construções de Cristais - Rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior Proteínas de Membrana

Descrevemos uma estrutura que incorpora análise bioquímica e computacional direta para orientar a caracterização e cristalização de grandes domínios de bobina enrolada. Essa estrutura pode ser adaptada para proteínas globulares ou estendida para incorporar uma variedade de técnicas de alto rendimento.

Combinando Wet and Dry técnicas de laboratório para orientar a cristalização de grandes espiral enrolada contendo proteínas

A prolina-prolina endopeptidase-1 (PPEP-1) é uma metaloprotease secretada e um alvo promissor do patógeno humano Clostridium difficile. Aqui descrevemos todos os métodos necessários para a produção e determinação da estrutura desta proteína.

Produção, cristalização e determinação da estrutura de<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via microdispersão e Zinco-SAD

Um protocolo é apresentado para cristalografia de raios X usando microcristais de proteína. São comparados dois exemplos de análise de microcristos criados em vivo após purificação ou em celulósio .

Microcristalografia de Cristais de Proteína e<em&gt; Em Cellulo</em&gt; Difração

Apresentamos abordagens para a caracterização estrutural e biofísica das glicoproteínas com a dobra de imunoglobulina por cristalografia de raios x, Calorimetria de Titulação Isotérmica e interferometria de biolayer.

Caracterização de Glicoproteínas com Dobra da Imunoglobulina por Cristalografia de Raios-X e Técnicas Biofísicas

Descrevemos protocolos para a determinação da estrutura do domínio ikk-obrigatório da NEMO por cristalografia de raios-X. Os métodos incluem expressão de proteína, purificação e caracterização, bem como estratégias para otimização de cristal bem-sucedida e determinação da estrutura da proteína em sua forma desvinculada.

Produção, cristalização e determinação da estrutura do domínio ikk-obrigatório da NEMO

O protocolo descreve métodos experimentais para obter substituições estáveis do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe I através de substituições potenciais β 2-microglobulina (β2m) de diferentes espécies. A comparação estrutural do MHC I estabilizada por homólogos e heteromaníacos β2m foram investigadas.

Estabilidade e Estrutura do Complexo de Histocompatibilidade Maior do Morcego Classe I com β Heterologous2-Microglobulina

Este artigo apresenta um método para gerar cristais proteicos derivados com I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic ácido) utilizando microseeding para gerar novas condições de cristalização em telas de matriz esparsas. As bandejas podem ser configuradas usando robôs de distribuição de líquidos ou à mão.

Derivatização de Cristais de Proteína com I3C usando Triagem de Matriz Microseada Aleatória

Esta contribuição descreve como configurar a cristalização de proteínas em dispositivos cristal sobre cristal e como executar a coleta automatizada de dados seriais à temperatura ambiente usando a plataforma de cristalização no chip.

Cristalização no chip e difração serial em larga escala à temperatura ambiente

Aprenda a produzir, cristalizar e determinar a estrutura da IKK1 humana para compreender sua função de sinalização. Este método facilita o design racional de fármacos em biologia estrutural.

Um guia para a produção, cristalização e determinação da estrutura de IKK1 humana/α

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