Cultivo In Vivo-gosto murino astrócitos usando o protocolo AWESAM rápida, simples e barato

O protocolo AWESAM descrito aqui é ideal para o cultivo de astrócitos murino em isolamento de outras células do cérebro de forma rápida, simples e barato. Astrócitos AWESAM exposição espontânea Ca^{2 +} sinalização, morfologia e gene expressão perfis semelhantes de astrócitos na vivo.

O objetivo geral deste procedimento é produzir monoculturas in vivo como astrócitos usando um método simples, rápido e econômico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da astroglibiologia, como qual é a economia da liberação ou absorção física dos astrócitos. A principal vantagem desta técnica é que as células resultantes se assemelham muito aos astrócitos in vivo pela morfologia, expressão de mRNA e proteínas e flutuações intercelulares de cálcio.

Para iniciar este procedimento, prepare a área de dissecção colocando duas placas de Petri de 10 cm cheias de meio de dissecção sobre gelo em uma capela de dissecção de fluxo laminar. Para cada área do cérebro a ser isolada, prepare um tubo de 15 mL cheio de 14 mL de meio de dissecção e mantenha no gelo. Em seguida, borrife as ferramentas de dissecção com etanol 70% e coloque-as ao lado do microscópio de dissecção no exaustor.

Se estiver trabalhando com tecido embrionário, primeiro remova os embriões do útero e abra os sacos embrionários. Imediatamente, corte as cabeças com uma tesoura. Quando todas as cabeças estiverem cortadas, transfira-as para um meio de dissecação pré-resfriado.

Uma vez que as cabeças estejam submersas no meio, abra a pele e o crânio com uma pinça e retire o cerebelo. Em seguida, alavancar cuidadosamente o resto do cérebro para cima e para fora do crânio. Depois disso, separe o córtex da estrutura subjacente do mesencéfalo.

Coloque a pinça dentro da fissura longitudinal entre os hemisférios e mova-a entre o córtex e as estruturas do mesencéfalo de um hemisfério para libertar cada hemisfério. Posteriormente, remova todas as meninges de cada hemisfério e separe os hipocampos. Se os astrócitos do hipocampo forem necessários, transfira cada hipocampo para um tubo de 15 mL cheio de 14 mL de meio de dissecção no gelo.

Depois disso, corte qualquer tecido cortical a ser usado para gerar astrócitos em pedaços não maiores que um mililitro cúbico. Em seguida, colete todos os pedaços de tecido cortical em um tubo separado de 15 mL cheio de meio de dissecção no gelo. Depois que todos os pedaços de tecido forem coletados, espere que eles se depositem no fundo do tubo.

Em seguida, aspire o máximo de meio possível. Em seguida, adicione 2-3 mL de EDTA 0,05% tripsen e incube as amostras em banho-maria a 37 graus Celsius por vinte minutos. Em seguida, aspire cuidadosamente o tripsen EDTA deixando pedaços de tecido em uma quantidade mínima de líquido no fundo do tubo.

Em seguida, adicione 5 mL de meio de dissecção pré-resfriado para lavar o tripsen EDTA restante e pipetar para o lado do tubo superior para obter a mistura dos pedaços de tecido. Em seguida, aspire o meio de dissecção e deixe os pedaços de tecido no mínimo de líquido possível. Repita esta etapa de lavagem com meio de dissecção pré-resfriado duas vezes.

Após a etapa final de lavagem, adicione 1 mL de D-Mem Plus em temperatura ambiente e triture o tecido pipetando para cima e para baixo sem introduzir bolhas. Os astrócitos são bastante sensíveis ao pH, por isso é importante evitar a produção de bolhas, pois isso pode alterar o pH da solução. Em seguida, coloque um filtro de célula de 100 mícrons na abertura de um tubo de 50 mL e pré-umedeça o filtro com 4.5 mL com D-Mem Plus pré-resfriado.

Pipete 1 mL da suspensão de tecido dissociado no filtro de células e adicione mais 4,5 mL de D-Mem Plus pré-resfriado para lavar as células através dele. No sétimo dia in vitro após a dissecção, coloque as placas de 10 cm com células em D-Mem Plus em uma coqueteleira na incubadora e agite as placas a 110 RPM por 6 horas. 20 a 30 minutos antes do final das seis horas de agitação, pré-aqueça 1 XPBS, D-Mem Plus, NB+H e 0,25% de tripsen EDTA a 37 graus no banho-maria.

Após 6 horas de agitação, retire as placas de cultura do shaker e substitua imediatamente o meio por 10 mL de 1 XPBS pré-aquecido por prato. Em seguida, remova o PBS e adicione 3 mL de EDTA tripsen pré-aquecido por prato. Em seguida, incube as amostras por quatro minutos a 37 graus Celsius.

Se estiver preparando amostras para Western Blot ou sequenciamento de RNA, não adicione Tripsen EDTA. Em vez disso, substitua o PBS por 12 mL de NB + H pré-aquecido, após o qual as culturas podem ser colocadas de volta na incubadora. Em seguida, adicione 5 mL de D-Mem Plus pré-aquecido a 3 mL de tripsen EDTA em cada prato.

Pipetar as células do prato e recolher a suspensão celular num tubo de 50 ml. Depois disso, centrifugue a suspensão celular a 3220 vezes G a 20 graus Celsius por 4 minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o palato celular em 1 mL de NB + H pré-aquecido.

Essas imagens mostram que os astrócitos ausam transduzidos pelo G-camp exibem eventos espontâneos de íons de cálcio em todas as redes de astrócitos, inclusive nos processos finos. Aqui, uma onda de íons de cálcio viaja por vários astrócitos da esquerda para a direita nas imagens de pontos de tempo distintos, onde a cor clara representa áreas de altas concentrações de íons de cálcio e as áreas pretas representam regiões extracelulares. Neste gráfico, a concentração de íons de cálcio muda nas regiões codificadas por cores ao longo do tempo, que são mostradas como traços de intensidade fluorescente do acampamento G, ilustrando como uma onda de sinalização de íons de cálcio se espalha por vários astrócitos.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora e quinze minutos se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como imagens de células vivas em combinação com experimentos de transfecção ou transdução viral, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais eventos ocorrem nas membranas dos astrócitos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como se preparar in vivo como culturas motoras de astrócitos de maneira simples, rápida e econômica.