Geração de um modelo de doença pulmonar obstrutiva crônica em ratos pela exposição repetida de ozônio

O objetivo geral deste experimento é induzir doença pulmonar obstrutiva crônica ou C-O-P-D via exposição ao ozônio, O-E em camundongos. Este novo modelo de OE pode acontecer na caracterização do mecanismo subjacente da DPOC e pode ser usado para a triagem de novos medicamentos. As principais vantagens desse modelo de OE são que ele recapitula os processos patológicos de pacientes com DPOC.

Pode ser gerado em apenas seis a oito semanas. Demonstrando o procedimento comigo estará Weijaian Sang, pesquisador do nosso grupo. Para gerar ozônio, use um gerador elétrico e um pequeno soprador de ar para soprar o ar de vedação da caixa de Perspex através de um tubo de ventilação conectado no interior e no exterior da caixa usando uma sonda de ozônio para monitorar a concentração de ozônio na caixa.

Quando a concentração de ozônio atingir 2,5 partes por milhão, coloque os ratos na caixa por 3 horas. No final da semana 7, obter imagens dos animais tratados com ozônio por microtomografia computadorizada de acordo com os protocolos padrão. Para testar as mudanças induzidas pelo ozônio e as capacidades funcionais, como fadiga pulmonar, primeiro aqueça os camundongos a uma velocidade de 10 metros por minuto em uma esteira.

Após 5 minutos, aumente a velocidade para 15 metros por minuto por um período de 10 minutos. Continue a aumentar a velocidade em cinco metros por minuto a cada 30 minutos até que os ratos não possam mais correr. Registar a distância total de corrida e o tempo de corrida de cada animal como distância de fadiga e tempo de fadiga, respetivamente.

Para medir a função pulmonar dos animais expostos ao ozônio, coloque um camundongo anestesiado em um pletismógrafo corporal conectado a um ventilador controlado por computador. Use ventilação controlada por pressão para impor uma frequência respiratória média de 150 respirações por minuto ao animal anestesiado até que um padrão respiratório regular e uma expiração completa em cada ciclo respiratório sejam obtidos. Em seguida, registre o volume expiratório forçado nos primeiros 25, 50 e 75 milissegundos de expiração, rejeitando quaisquer manobras abaixo do ideal.

Após a anestesia terminal, use um tubo endotraqueal de um milímetro de diâmetro para lavar os animais duas vezes com um mililitro de PBS por lavagem. Agrupe os aloquats de lavagem recuperados de cada animal para centrifugação e colete os sobrenadantes em nitrogênio líquido. Ressuspenda os pellets em PPS novo para contagem e equipe dois suportes por mouse com uma lâmina de microscópio, cartão de filtro e funil.

Adicione aproximadamente 100 a 125 microlitros das células ressuspensas a cada funil. Carregue os suportes em uma centrífuga cyto e gire as células nas lâminas. Em seguida, aplique a solução de coloração correta nas células de acordo com as instruções do fabricante e conte 200 células por camundongo com uma ampliação de 400 vezes.

Para amostragem de sangue cardíaco, colete aproximadamente 500 microlitros de sangue dos animais expostos ao ozônio por punção cardíaca. E adicione o sangue a tubos de 1,5 mililitro no gelo. Após 30 minutos no gelo, centrifugue as amostras de sangue e transfira os sobrenadantes de soro para novos tubos para armazenamento em nitrogênio líquido.

As amostras podem ser posteriormente descongeladas para a avaliação dos níveis séricos de expressão de citocinas por ELISA de acordo com protocolos padrão. Para análise morfométrica pulmonar, coloque o primeiro camundongo em decúbito dorsal após a amostragem cardíaca. Em seguida, abra a cavidade torácica e disseque o platisma e os músculos traqueais anteriores para acessar os anéis traqueais.

Colha os pulmões e a traqueia sem separar o coração dos pulmões. Em seguida, use um tubo de polietileno PE90 para conectar um cateter endotraqueal a uma seringa contendo formaldeído a 4% de potência e infle completamente os pulmões com aproximadamente 200 microlitros de paraformaldeído. Em seguida, coloque os pulmões em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de formaldeído fresco a quatro por cento de potência por pelo menos quatro horas.

Conforme avaliado por microtomografia computadorizada, os camundongos expostos ao ozônio exibem um volume pulmonar total significativamente maior e porcentagem de área de baixa atenuação do que os animais de controle expostos ao ar ambiente. O fenótipo do enfisema também é evidenciado pelos alvéolos pulmonares aumentados e pelo aumento das interceptações lineares médias. A avaliação da função pulmonar por pletismógrafo demonstra que todos os parâmetros que diminuem em camundongos expostos ao ozônio são consistentes com os defeitos funcionais pulmonares típicos observados em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica.

Além disso, a exposição ao ozônio diminui significativamente o tempo de fadiga e a distância de fadiga em testes de tolerância ao exercício. Os animais tratados com ozônio também apresentam aumento significativo nas células inflamatórias, incluindo macrófagos e neutrófilos, bem como uma diminuição significativa na IL-10 e um aumento na IL-1 beta e TNF alfa, demonstrando que o modelo de exposição ao ozônio recapitula os sintomas da doença pulmonar obstrutiva crônica humana. Seguir este procedimento em outras linhagens de camundongos, como os camundongos C57 BR6, pode ser usado para gerar este modelo OE Após seu desenvolvimento, esta técnica abre caminho para pesquisadores no campo da doença pulmonar explorarem os mecanismos subjacentes da DPOC.

Não se esqueça de que trabalhar com o paraformaldeído pode ser perigoso e que precauções como usar luvas, óculos de segurança e usar a solução dentro da hotte devem sempre ser tomadas ao trabalhar com este reagente.