Name: Na Vivo Detecção e análise de SUMOylation de proteína Rb em células humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprenda a detectar SUMOilação da proteína Rb em células HEK293 humanas sob condições endógenas e exógenas. Este método avança o estudo de modificações proteicas e regulação celular.

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Este estudo foi suportado por doações da ciência e tecnologia Comissão de Xangai (Grant no. 14411961800) e Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant no. 81300805).

1. deteção de Rb endógena SUMOylation na fase inicial do G1 <ol><li>celular sincronização entre cultura e ciclo celular.
	<ol><li>HEK293 manter as células em um meio contendo Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 1% caneta-Strep e 10% fetal de soro bovino (FBS) a 37 ° C e 5% CO 2 em uma incubadora.</li>
		<li>Sincronizar as células HEK293 na fase G0.
		<ol><li>a contagem das células HEK293 usando um hemocytometer e sementes ~1.5 x 10 7 células em um 15 cm do prato com 25 ml de meio de crescimento por 24 h antes do tratamento. Depois de atingir uma confluência de aspirado de 70-80%, a médio e a lavagem das células duas vezes com 5 mL pré-aquecido tampão fosfato salino (PBS).</li>
			<li>Adicionar 25 mL DMEM contendo 1% penicilina-estreptomicina e incube as celulas a 37 ° C por 72 h. lavar as células no prato usando 3 mL PBS gelado. As células de transferência para um novo tubo de 5 mL.</li>
			<li>Assunto uma pequena porção de células para análise de ciclo celular por citometria de fluxo (etapa 1.2); recolher a maioria remanescente das células por centrifugação a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente e em seguida, armazene-os em um freezer de ultra baixa temperatura até análise de Rb SUMOylation.</li>
		</ol></li> <li>Para obter a fase G1 células, no final do processo de sincronização de G0, remover o DMEM e adicionar meio de crescimento volta fresca, permitindo assim que as células HEK293 para re-introduzir o ciclo celular. Em seguida, recolher as células em diferentes fases do G1 (G1 início: 30 min; G1: 2 h) para o ciclo celular, análise e sumô mais ensaio.</li>
		<li>Sincronizar as células HEK293 na fase S, usando o método de bloco duplo-timidina.
		Células <ol><li>células HEK293 crescer para uma confluência de 50% e lavagem com PBS escaldadas. Em seguida, adicione o meio de cultura suplementado com timidina de 2,5 mM para 18 h (primeiro bloco).</li>
			<li>Remover o meio contendo timidina e depois lavar as células duas vezes com PBS escaldadas. Adicionar o meio de cultura fresco para 14 h liberar as células.</li>
			<li>Descartar o meio com uma pipeta e adicionar o meio de cultura suplementado com timidina de 2,5 mM para outro 18 h (segundo bloco) antes de realizar uma análise do ciclo celular e Rb SUMOylation.</li>
		</ol></li> <li>Sincronização para o G2/M, placa ~1.5 × 10 7 HEK293 as células para um prato de 15 cm com 25 mL de meio de crescimento por 24 h. Em seguida, adicione nocodazole ao meio, até à obtenção de uma concentração final de 400 ng/mL. Finalmente, Incube as celulas para 16 h antes de realizar a análise do ciclo celular e Rb SUMOylation.</li>
	</ol></li> <li>Análise de ciclo celular por citometria de fluxo.
	<ol><li>Re-suspender o HEK293 sincronizado em PBS e então consertar a suspensão de células usando etanol a 70% gelado por 2 h em 4 ° C. Observe que para minimizar a célula de clustering, a suspensão de célula Adicionar gota a gota o etanol 100% gelada para obter uma concentração final de etanol a 70% enquanto suavemente num Vortex.</li>
		<li>Centrifugar as células por 5 min a 500 x g, então, cuidadosamente, desprezar o sobrenadante e lavar as células duas vezes com PBS. Repita a etapa centrifuga.</li>
		<li>Adicionar 500 µ l de PBS contendo 50 µ g/mL ácido nucleico mancha iodeto de propidium, 0.1% Triton X-100 e 1 µ g/mL RNase A para as células e misture bem. Incubar as células durante 15 minutos a 37 ° C.</li>
		<li>Armazenar as amostras em 4 ° C até análise por citometria de fluxo.</li>
	</ol></li> <li>Imunoprecipitação da proteína endógena Rb.
	Lisados celulares de <ol><li>preparar a HEK293.
		<ol><li>Lyse as células HEK293 sincronizadas, gentilmente re-suspendendo-os em 1 mL de tampão de lise de ensaio (RIPA) rádio-imunoprecipitação gelada (tabela 1) contendo recém adicionado 20 mM N-proteÃ, um inibidor de isopeptidase que poderia bloquear proteases de sumô e estabilizar o cojugado sumô.</li>
			<li>Mais homogeneizar as células no gelo por homogenizacao homogeneização, sonication ou simplesmente passando por 10 vezes através de uma agulha 21G anexada em uma seringa de 2 mL. Incubar em seguida, as células no gelo por 5 min. 
			Nota: O aniônico detergente Dodecil sulfato de sódio (SDS) no buffer de RIPA é crucial para a posterior determinação do Rb-sumô, como ele poderia eliminar o sinal de sumô inespecíficos que é derivado da interação entre a proteína Rb e outros não-covalente SUMÔ-espécie de não-Rb.</li>
		</ol></li> <li>Centrifugar os lisados celulares a 18.000 x g durante 30 min a 4 ° C. transferir os sobrenadantes para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. 
		Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As proteínas podem ser armazenadas a-80 ° C durante pelo menos 6 meses.</li>
		<li>Para preparar o controle de entrada de cada amostra para posterior Western blot, salvar uma pequena porção do líquido sobrenadante descritas acima para um novo tubo e conservar a -80 ° C.</li>
		<li>Para os sobrenadantes acima, adicionar 1 µ g de rato específico da imunoglobulina G (IgG) da mesma espécie e isotype como o anticorpo monoclonal de Rb e 20 µ l de pasta de um/G-sepharose 50% proteína. Em seguida, incubar durante 1 h a 4 ° C, com rotação suave.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 3.000 x g por 3 min a 4 ° C. cuidadosamente coletar os sobrenadantes sem perturbar os grânulos e transferi-los para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Para cada uma das amostras, adicione 5 anticorpo primário da Rb µ l e 40 µ l de 50% de proteína um/G-sepharose chorume. Em seguida, incubar durante uma noite a 4 ° C, com rotação suave.</li>
		<li>Recolher os grânulos por centrifugação a 3.000 x g, durante 3 min a 4 ° C e remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem. Observe que, para evitar perda de talão, não Aspire o seco grânulos.</li>
		<li>Lave os grânulos quatro vezes com 1 mL de tampão de RIPA. Sempre, misturar os tubos bem pela rotação-los a 4 ° C, durante 15 min. recolher os grânulos por centrifugação de baixa velocidade a 3.000 x g durante 3 minutos a 4 ° C e em seguida, descartar os sobrenadantes.</li>
		<li>Após retirar sobrenadantes da lavagem final, re-suspender as contas em 30 µ l 1 x amortecedor do carregamento do sódio Dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida gel de eletroforese (SDS-PAGE) (tabela 1) e misture bem.
		<ol><li>Incubar os tubos a 100 ° C, em um calor bloqueiam por 10 min. Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 1 min granular os grânulos. Cuidadosamente coletar os sobrenadantes sem perturbar os grânulos e transferi-los para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		</ol></li> <li>Analisar as amostras por 4% - 20% gradiente SDS-PAGE gel e Western blot ou armazená-los em-20 ° C para uso posterior.</li>
	</ol></li></ol> 2. Análise de 6XHis-tag exógena Rb SUMOylation em células humanas <ol><li>cultura e transfecção celular.
	<ol><li>Semente ~ 6 × 10 6 HEK293 células em um de 10 cm do prato e incubam por 24 h no meio de crescimento sob condições de cultura celular normal para adquirir 75% - 85% confluentes. Antes de transfeccao, remover o meio de crescimento e adicionar 6 mL de meio de escaldadas soro reduzida (ver Tabela de materiais) e, em seguida, coloque os pratos para a incubadora.</li>
		<li>Ensaio de SUMOylation constitutivo para o Rb, adicione µ g 15 cada do 6XHis-tag Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT e plasmídeos Ubc9-C93S 500 médio / µ l soro reduzida em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, respectivamente.
		<ol><li>Para analisar a sumô-conjugação de tipo selvagem Rb e seu mutante SUMOylation com defeito, misture 10 µ g de qualquer plasmídeo com tag 6XHis Rb-WT ou Rb-K720R juntamente com GFP-SUMO1 (10 µ g) em 500 µ l reduzida média de soro em microcentrífuga de 1,5 mL tubos de 13.</li>
		</ol></li> <li>Enquanto isso, em um tubo separado, misturar o reagente de Transfeccao de 50 µ l (veja a Tabela de materiais) em 500 µ l reduzida média de soro e incubar a temperatura ambiente por 5 min.</li>
		<li>Totalmente combinar os dois tubos separados descritos acima e incubar a temperatura ambiente por 15 min. Adicionar o transfeccao complexos de reagente/plasmídeo para as células e continuar a cultura para 8 h em 5% de CO 2 e 37 ° C.</li>
		<li>Substituir soro reduzida medium com meio de cultura e incube as células sob condições normais de cultura durante 48 h depois do transfection.</li>
	</ol></li> <li>Níquel afinidade puxa para baixo da proteína Rb com tag 6XHis.
	<ol><li>Lisar as células HEK293 transfectadas e extrair as proteínas totais como descrita seção 1.3.1.</li>
		<li>Centrífuga os lisados celulares a 18.000 x g durante 30 min à 4 ° C. cuidadosamente coletar os sobrenadantes e transferi-los para limpos tubos. 
		Nota: A proteína pode ser congelada neste momento por mais de 6 meses a -80 ° C.</li>
		<li>Para preparar o controle de entrada de cada amostra para posterior Western blot, salvar uma pequena porção dos sobrenadantes descrito acima para um novo tubo e conservar a -80 ° C.</li>
		<li>Lavagem de 25 µ l de 50% de níquel nitrilotriacético ácidos grânulos de agarose (Ni-NTA) com buffer de RIPA duas vezes em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para cada amostra. Recolher os grânulos por centrifugação a 3.000 x g por 3 min a 4 ° C.</li>
		<li>Imidazol adicionar 1 M para cada amostra para obter uma concentração final de 10 mM. Em seguida, adicione cada amostra para o tubo contendo os grânulos de agarose preparados Ni-NTA.</li>
		<li>Incubar os grânulos e os lysates durante 2 h a 4 ° C, com rotação suave. Girar os grânulos a 3.000 x g por 3 min a 4 ° C e Retire cuidadosamente os sobrenadantes pipetando. Para evitar perda de talão, não Aspire o seco grânulos.</li>
		<li>Lave os grânulos com 1 mL de tampão de lavagem contendo imidazole 20mm (tabela 1). Cada vez, misturar os tubos bem pela rotação a 4 ° C, durante 15 min. coletar os grânulos girando a 3.000 x g por 3 min a 4 ° C e descartar os sobrenadantes.</li>
		<li>Após a lavagem final, adicionar 30 µ l de eluição do buffer contendo imidazole 250 mM (tabela 1) para cada amostra e agite para misturar. Em seguida, incubar por 20 min a 4 ° C para eluir as proteínas.</li>
		<li>Misturar cada amostra com tampão de carregamento 6 × SDS-PAGE (tabela 1). Em seguida, incubar os tubos a 100 ° C, em um bloco de calor durante 10 min.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g por 1 min granular os grânulos. Cuidadosamente coletar os sobrenadantes sem perturbar os grânulos e transferir as amostras para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. As amostras podem ser analisadas por Western blot ou armazenadas a-20 ° C para uso posterior.</li>
	</ol></li></ol> 3. Western Blot <ol><li>carregar a imunoprecipitação ou puxar para baixo as amostras obtidas das etapas anteriores para gradientes geles de SDS-PAGE 4-20%. Realizar a eletroforese em 120 V para 90 min separar as proteínas.</li>
	<li>Transferir as proteínas do gel para uma membrana (PVDF) de difluoreto de polivinilideno por eletroblotting a 300 mA para 90 min a 4 ° C, usando o método de transferência do tanque. Bloquear a membrana PVDF no buffer do bloco que contém leite desnatado 5% (tabela 1) por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar a membrana com anticorpo primário em tampão de diluição de anticorpo contendo 3% albumina de soro bovino (BSA) (tabela 1) durante a noite a 4 ° C. Para os anticorpos primários, usar uma concentração de trabalho de 0,5 µ g/mL (anticorpo anti-SUMO1), ou uma diluição de 1: 2000 (anticorpos anti-Rb e antitubulina) ou 1:5,000 (anti-GFP e anticorpo antisua).</li>
	<li>Lavar a membrana 3 x por 10 min cada tempo usando 1x tris salino com buffer Tween (TBST) (tabela 1). Incube a membrana com espécie específica de anticorpos secundarios conjugados a HRP Peroxidase de rábano 1:5,000 diluído em tampão de bloco contendo leite desnatado 5% (tabela 1). Lavar a membrana 3 x por 10 min cada vez usando 1 buffer x TBST.</li>
	<li>Incubar a membrana com quimioluminescência reforçada (ECL) solução de trabalho. Cobrir a membrana com o envoltório plástico e expô-la a película de raio x, dependendo da força do sinal.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este artigo descreve um protocolo para detectar e analisar as SUMOylation endógena de Rb em células humanas. Como esse método é especificamente orientado para a proteína endógena Rb sem qualquer alternância de sinal global de sumô-relacionados, é uma importante ferramenta para a investigação de modificação de Rb-sumô sob circunstâncias fisiológicas completamente naturais.
Para atingir este objectivo, é importante ter em mente que: 1) apesar de sumô compreende quatro isoformas (SUMO1-4, cada um...

O controle exato da progressão do ciclo celular em células eucarióticas é baseado em uma rede reguladora apertada, que garante que determinados eventos ocorrem em uma forma ordenada1,2. Um dos principais intervenientes nesta rede é a proteína do retinoblastoma (Rb), o primeiro tumor clonado supressor1,3. A proteína Rb é pensada para ser um regulador negativo da progressão do ciclo celular, especialmente para o G0/G1 para transição de fase S e tumor crescimento4,5. Falha da função de Rb também diretamente leva à malignidade intraocular mais comum em crianças, retinoblastoma, ou contribui para o desenvolvimento de muitos outros tipos de câncer5. Além disso, Rb está envolvido em muitos caminhos celulares incluindo diferenciação celular, cromatina remodelação e apoptose mediada por mitocôndrias3,6,7.
Modificações borne-translational desempenham um papel crucial na regulação da função de RB8,9. A fosforilação é a uma tal modificação, e geralmente leva à inactivação de Rb. Nas células quiescentes de G0, Rb está ativo com um nível baixo de fosforilação. Como células de progresso por fase G0/G1 Rb é sequencialmente hiperfosforilada por uma série de quinases proteína cyclin-dependente (CDKs) e ciclinas, como ciclina E/CDK2 e ciclina D/CDK4/6, que inactivate Rb e eliminar sua capacidade de reprimir o ciclo celular relacionados ao gene expressão4,10. RB também pode ser modificado por pequenas relacionadas à ubiquitina modificador (SUMO)11,12,13.
SUMÔ é uma proteína do ubiquitin-como que é covalentemente ligada a uma variedade de proteínas do alvo. É crucial para diversos processos celulares, incluindo a regulação do ciclo celular, transcrição, a localização da proteína celular e degradação, transporte e DNA reparo14,15,16, 17 , 18. caminho de conjugação o sumô consiste a enzima ativando dimérica sumô E1 SAE1/UBA2, a única enzima de conjugação E2 Ubc9, múltiplas E3 ligases e proteases específicas sumô. Em geral, proteínas de sumô nascentes devem ser processadas proteoliticamente para gerar a forma madura. O sumô maduro é ativado pelo heterodímero E1 e em seguida, transferido para a enzima E2 Ubc9. Finalmente, a glicina C-terminal do sumô é covalentemente conjugada com o lisina de destino de um substrato, e este processo é geralmente facilitado pela E3 ligases. A proteína de sumô pode ser removida do substrato modificado por proteases específicas. Um estudo anterior pelos autores deste trabalho revelou que SUMOylation de Rb aumenta sua ligação a CDK2, levando a hiperfosforilação na fase inicial do G1, um processo que é necessário para a progressão de ciclo celular13. Também demonstramos que a perda de Rb SUMOylation provoca uma proliferação de diminuição da célula. Além disso, recentemente foi demonstrado que o SUMOylation de Rb protege a proteína Rb proteasomal volume, aumentando assim o nível de proteína Rb em células19. Portanto, SUMOylation desempenha um papel importante na função de Rb em vários processos celulares. Para um estudo mais aprofundado a consequência funcional e relevância fisiológica do Rb SUMOylation, é importante desenvolver um método eficaz para analisar o status de sumô de Rb em células ou tecidos doentes.
SUMOylation é um processo reversível, altamente dinâmico. Assim, é geralmente difícil de detectar as proteínas modificadas de sumô em condições completamente endógenas. Este trabalho apresenta um método para detectar endógena Rb SUMOylation. Além disso, ele mostra como detectar exógena Rb SUMOylation do selvagem-tipo Rb e sua mutação de sumô-deficientes11. Em particular, Jacobs et al descreveram um método para aumentar a modificação de sumô de um determinado substrato especificamente por fusão-dirigido Ubc9 SUMOylation (UFDS)20. Com base neste método, este protocolo descreve como analisar o SUMOylation forçada de Rb e suas consequências funcionais. Tendo em conta que centenas de substratos de sumô têm sido descritas anteriormente e foram identificados mais substratos de sumô putativos de muitos ensaios baseados em proteômica, este protocolo pode ser aplicado para analisar a sumô-modificação destas proteínas em células humanas.

<table><tbody><tr><td>Meio de Águia Modificado (DMEM) da Dulbecco,</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Timidina</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>iodeto de propídio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>N-Etilmaleimida</td><td>Sigma</td><td>E3876&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)</td><td>AMRESCO</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Substituto (NP-40)</td><td>AMRESCO</td><td>M158</td><td></td></tr><tr><td>inibidor de protease</td><td>Roche</td><td>5892970001</td><td></td></tr><tr><td>Imunoglobulina G de camundongo (IgG)</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Rb anticorpo</td> Tecnologia <td>de sinalização celular</td><td>#9309</td><td></td></tr><tr><td>Proteína A/G-Sepharose Beads</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Níquel Ácido Nitrilotriacético (Ni-NTA) Grânulos de Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% Gradiente SDS-PAGE</td><td>Gel BIO-RAD</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de Difluoreto de Polivinilideno (PVDF)</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>AMRESCO</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de tubulina</td><td>Abmart</td><td>M30109</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo SUMO1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-2044</td><td></td></tr><tr><td>GFP anticorpo</td><td>Abmart</td><td>M20004</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase de rábano (HRP) anticorpo secundário</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>kit de quimioluminescência aprimorada (ECL)</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>32106</td><td></td></tr></tbody></table>

na vivo detecção e análise de sumoylation de proteína rb em células humanas

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

As modificações pós-tradução de proteínas são essenciais para a regulação adequada da transdução do sinal intracelular. Entre estas modificações, pequeno modificador ubiquitin-relacionados (SUMO) é uma proteína de ubiquitina-como que é covalentemente ligada aos resíduos de lisina de uma variedade de proteínas do alvo para regular os processos celulares, tais como a transcrição do gene, reparo do DNA, proteínas interação e degradação, transporte subcelular e transdução de sinal. A abordagem mais comum para detectar proteínas SUMOylation baseia-se na expressão e purificação de proteínas recombinantes marcadas em bactérias, permitindo uma em vitro reação bioquímica que é simples e adequada para endereçamento mecanicista perguntas. No entanto, devido à complexidade do processo de SUMOylation na vivo, é mais difícil de detectar e analisar proteínas SUMOylation em células, especialmente quando sob condições endógenas. Um estudo recente dos autores deste trabalho revelou que a proteína endógena retinoblastoma (Rb), um supressor de tumor que é vital para a regulação negativa da progressão do ciclo celular, é especificamente SUMOylated na fase inicial do G1. Este artigo descreve um protocolo para a detecção e análise de Rb SUMOylation sob condições endógenas e exógenas em células humanas. Este protocolo é apropriado para a investigação fenotípica e funcional da SUMO-modificação do Rb, bem como muitos outras sumô-alvo proteínas, nas células humanas.

Para detectar endógena Rb SUMOylation durante a progressão do ciclo celular, este estudo primeiro sincronizado células HEK293 em cinco diferentes fases do ciclo celular (G0, cedo G1, G1, S e G2/M) conforme descrito na seção de protocolo deste documento. A qualidade de sincronização foi confirmada usando a mancha de ácido nucleico com iodeto de propidium seguido por análise de citometria de fluxo (Figura 1). Em seguida, as células foram coletadas e lysed por d...

Família proteínas pequenas relacionadas à ubiquitina modificador (SUMO) são conjugadas aos resíduos de lisina das proteínas alvo regular de vários processos celulares. Este artigo descreve um protocolo para a detecção da proteína do retinoblastoma (Rb) SUMOylation sob condições endógenas e exógenas em células humanas.

Na Vivo Detecção e análise de SUMOylation de proteína Rb em células humanas

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

O objetivo geral deste experimento é detectar a SUMOilação de proteínas de retinoblastoma em condições endógenas e exógenas em células humanas. As proteínas da família do modificador semelhante à ubiquitina, ou SUMO, são conjugadas aos resíduos de lisina de proteínas-alvo para regular diversos processos celulares. Normalmente, é mais desafiador iniciar a SUMOilação de uma proteína em células devido à complexidade da SUMOilação in vivo.Este experimento detecta a SUMOilação de proteínas Rb endógenas e exógenas. Embora este método possa fornecer informações sobre a SUMOilação de proteínas Rb, ele também é adequado para a detecção de muitas outras proteínas-alvo da SUMO em células. Para começar, adicione 25 mililitros de DMEM contendo um por cento de penicilina-estreptomicina e incube as células HEK293 a 37 graus Celsius por 72 horas.Lave as células da placa utilizando três mililitros de PBS gelado. Em seguida, transfira as células para um novo tubo de cinco mililitros. Para obter células na fase G1 ao final do processo de sincronização em G0, remova o DMEM e adicione novamente meio de crescimento fresco, permitindo que as células HEK293 reingressem no ciclo celular.Em seguida, colete as células em diferentes fases G1 para análise do ciclo celular e ensaio SUMO adicional. Para sincronizar as células HEK293 na fase S, utilize o método de bloqueio duplo com timidina. Primeiro, cultive as células HEK293 até atingirem uma confluência de 50%. Depois, lave as células com PBS pré-aquecido.Adicione meio de crescimento suplementado com timidina 2,5 milimolar por 18 horas como o primeiro bloqueio. Remova o meio contendo timidina e lave as células duas vezes com PBS pré-aquecido. Adicione meio de crescimento fresco por 14 horas para liberar as células do bloqueio.Após liberar as células do primeiro bloqueio, descarte o meio com uma pipeta. Em seguida, adicione meio de crescimento suplementado com timidina 2,5 milimolar por mais 18 horas como segundo bloqueio, antes de realizar uma análise do ciclo celular e da SUMOilação de Rb. Para a sincronização na fase G2 ou M, plaque aproximadamente 15 milhões de células HEK293 em uma placa de 15 centímetros com 25 mililitros de meio de crescimento e cultive por 24 horas.Em seguida, adicione nicotisol ao meio até se obter uma concentração final de 400 nanogramas por mililitro. Por fim, incube as células por 16 horas antes de realizar a análise do ciclo celular por citometria de fluxo conforme descrito no protocolo textual. Lisar as células HEK293 sincronizadas mediante re-suspensão suave em um mililitro de tampão de lise RIPA (ensaio de radioimunoprecipitação) gelado, contendo inibidor de isopeptidase recém-adicionado para bloquear as proteases SUMO e estabilizar os conjugados SUMO.Homogeneíze ainda mais as células em gelo passando-as por uma agulha de 21 gauge acoplada a uma seringa de dois mililitros 10 vezes. Em seguida, incube as células em gelo por cinco minutos. A seguir, centrifugue os lisados celulares a 18000 ×g por 30 minutos a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, transfira os sobrenadantes para novos tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro. Aos sobrenadantes, adicione um micrograma de imunoglobulina G de camundongo não específica da mesma espécie e isotipo do anticorpo monoclonal Rb. Adicione também 20 microlitros de suspensão de protein AG sepharose a 50 por cento e, em seguida, incube a mistura por uma hora a quatro graus Celsius com rotação suave.Centrifugue as amostras a trinta mil vezes g durante três minutos a quatro graus Celsius. Colete cuidadosamente os sobrenadantes sem perturbar as microesferas e transfira-os para novos tubos microcentrífugos de um ponto cinco mililitros. A cada uma das amostras, adicione cinco microlitros do anticorpo primário rb e 40 microlitros de suspensão de protein ag sepharose a 50 por cento, em seguida incube as amostras durante a noite a quatro graus Celsius com rotação suave.Após a centrifugação, lave as esferas com um mililitro do tampão rifa. Misture bem os tubos por rotação a quatro graus Celsius durante 15 minutos. Em seguida, recolha as esferas por centrifugação de baixa velocidade, como antes, e descarte os sobrenadantes.Após realizar a lavagem quatro vezes, re-suspenda os grânulos em 30 microlitros de tampão de carga para eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio a uma x e misture bem. Incube os tubos a 100 graus celsius em um bloco térmico por 10 minutos. Centrifugue as amostras a 12 mil vezes g por um minuto para sedimentar os grânulos.Por fim, colete cuidadosamente os sobrenatantes sem perturbar as microesferas e transfira-os para tubos microcentrífugos de um vírgula cinco mililitro. Realize a transfeção de culturas celulares e a lise de células HEK293 conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, lave 25 microlitros de microesferas de ágarose de níquel nitrilotriacético a 50 por cento com tampão RIPA em um tubo microcentrífugo de um vírgula cinco mililitro para cada amostra.Recolha as microesferas por centrifugação a trinta mil vezes g durante três minutos a quatro graus Celsius. Adicione um molar de emytozol a cada amostra para obter uma concentração final de 10 milimolar. Em seguida, adicione cada amostra ao tubo contendo as microesferas de agarose preparadas.Incube as esferas e os lisados por duas horas a quatro graus Celsius com rotação suave. Em seguida, centrifugue as esferas a três mil vezes g por três minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova cuidadosamente os sobrenadantes por pipetagem.Para evitar a perda de microesferas, não aspire completamente o líquido das microesferas. Em seguida, lave as microesferas com um mililitro de tampão de lavagem contendo 20 milimolares de emytozol. Misture bem os tubos por rotação a quatro graus Celsius durante 15 minutos antes de recolher as microesferas por centrifugação.Após a última lavagem, adicione 30 microlitros do tampão Eleusian contendo 250 milimolares de emitozol a cada amostra e agite levemente para misturar. Em seguida, incube as amostras por 20 minutos a quatro graus Celsius para eluir as proteínas. Misture cada amostra com tampão de carga para eletroforese SDS-PAGE 6x.Em seguida, incubar os tubos a 100 graus celsius em um bloco térmico por 10 minutos. Após a centrifugação, carregar as amostras de imunoprecipitação ou "pull-down" em géis de gradiente SDS-PAGE de quatro a vinte por cento. Realizar a eletroforese a 120 volts por 90 minutos para separar as proteínas.Após a sincronização do ciclo celular e a imunoprecipitação das espécies endógenas de rb, a presença do sinal SUMO foi detectada especificamente por um anticorpo anti-SUMO1 na fase inicial de G1. Os resultados representativos mostram a SUMOilação forçada da proteína rb pela fusão direta da enzima E2 SUMO, UBC9, ao seu terminal C. Observe a proteína rb SUMOilada com mobilidade eletroforética mais lenta.Ao utilizar o mutante deficiente em SUMO da rb, K720R, a presença de SUMOilização da rb em células é ainda mais confirmada. Assim, neste procedimento, muitas outras proteínas-alvo da SUMO podem ser analisadas em células cultivadas. Na maioria dos casos, apenas uma porção muito pequena de um substrato é SUMOilada; portanto, ao realizar este procedimento, é importante otimizar a eficiência da imunoprecipitação.

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Biologia

Este vídeo demonstra o método in vitro para SUMOilação de proteínas de substrato usando uma cascata enzimática sequencial. Além disso, o status SUMOilado da proteína é identificado usando a técnica de eletroforese e immunoblotting.

Ensaio de SUMOilação: Uma Técnica In Vitro para Detectar o Status de SUMOilação de Proteínas de Substrato por Immunoblotting

Beacons bimoleculares proporcional (RBMBs) pode ser usado para imagens simples transcrições de RNA projetados em células vivas. Aqui, nós descrevemos a preparação e purificação de RBMBs, entrega de RBMBs em células de formação de microporos e de imagem fluorescente de transcritos de ARN em tempo real.

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Este manuscrito descreve a detecção de sumoylation e ubiquitinação de proteínas cinetócoro, Ndc10 e Ndc80, na levedura Saccharomyces cerevisiae brotamento.

Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

As interações proteína-proteína podem ocorrer tanto no núcleo quanto no citoplasma de uma célula. Para investigar essas interações, a co-imunoprecipitação tradicional e o ensaio moderno de ligação de proximidade são aplicados. Neste estudo, comparamos esses dois métodos para visualizar a distribuição das interações NF90-RBM3 no núcleo e no citoplasma.

Visualização de interação proteína-proteína em Citoplasmáticas frações nucleares e por co-imunoprecipitação e<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Assay

Descreveremos um protocolo para identificar proteínas RNA-obrigatórias e mapear suas regiões de ligação de RNA em células vivas, usando photocrosslinking UV-mediada e espectrometria de massa.

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Ao contrário da ubiquitina ligases, foram identificados alguns ligases E3 sumô. Este modificado em vitro protocolo SUMOylation é capaz de identificar o romance sumô E3 ligases por um ensaio de reconstituição em vitro .

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Inibição de proteína inducible e reversível dominante-negativo (DN)

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Localização de proteínas SUMO-modificadas usando proteínas de captura de sumo fluorescentes

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Entidades vinculantes ao SUMO (SUBEs) como ferramentas para enriquecimento, isolamento, identificação e caracterização do Proteome SUMO em Câncer de Fígado

Este protocolo visa estabelecer proteomas específicos de ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls), a fim de identificar alterações desse tipo de modificações pós-translacional (PTMs), associadas a uma condição específica, como tratamento ou fenótipo.

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Esses protocolos fornecem a metodologia utilizada para avaliar a atividade enzimática de membros individuais da família de proteínas metiltransferase (PRMT) nas células. Diretrizes detalhadas sobre a avaliação da atividade prmt usando biomarcadores endógenos e exógenos, anticorpos de reconhecimento de metila-arginina e compostos de ferramentas inibidoras são descritos.

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Aprenda a detectar SUMOilação da proteína Rb em células HEK293 humanas sob condições endógenas e exógenas. Este método avança o estudo de modificações proteicas e regulação celular.

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