O c. elegans intestino como um modelo para intercelular Lumen morfogênese e In Vivo biogênese de membrana polarizada no nível de célula única: rotulagem por anticorpos, RNAi perda--função de análise e de imagem

O objetivo geral desta combinação de métodos padrão é demonstrar como o intestino de C. elegans pode ser usado para a análise in vivo da biogênese da membrana polarizada e da morfogênese do lúmen no nível unicelular e subcelular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos de polaridade e biogênese, como como os domínios da membrana apical versus basolateral e outras assimetrias subcelulares são estabelecidas e mantidas durante e após a morfogênese. A principal vantagem deste sistema modelo é que esta camada única transparente de apenas 20 células pode sobreviver in vivo câmara de tecido para dissecar a membrana polarizada de célula única e a biogênese do lúmen.

As técnicas podem ser estendidas para a análise de outros fenótipos de morfogênese de C.Elegans, o foco aqui está na análise da biogênese da membrana, especificamente na biogênese da membrana apical e do lúmen. Os procedimentos incluem técnicas de imagem refinadas em animais fixos e vivos para distinguir domínios de membrana e componentes subcelulares e para identificar fenótipos de morfogênese de lúmen em um intestino de C. elegans. Este vídeo sobre a tubulogênese intestinal é acompanhado por um vídeo sobre a tubulogênese do canal excretor, modelos mutuamente informativos, onde a análise in vivo da biogênese da membrana polarizada.

No que diz respeito à marcação, a geração de animais transgênicos com proteínas de fusão marcadas com fluorescência para imagens ao vivo é descrita no vídeo que acompanha a análise da tubulogênese do canal excretor. Esses animais podem ser usados diretamente em experimentos de RNAi. A terceira geração é normalmente o primeiro passo nessa combinação de procedimentos.

Este vídeo começa com o método alternativo de rotulagem coloração de anticorpos para o qual os animais devem ser corrigidos. Os diferentes procedimentos de marcação podem ser combinados com imuno-histoquímica normalmente usada para a análise final de imagem. Este protocolo também possui exemplos de marcadores de membrana específicos do intestino, promotores e outros recursos úteis para ambos os procedimentos de rotulagem.

Depois de demonstrar a imuno-histoquímica, este vídeo usa uma cepa transgênica que marca a membrana apical intestinal com ERM-1 GFP para pesquisar fenótipos de polaridade e morfogênese do lúmen usando RNAi. Primeiro prepare um slide para consertar os vermes. Pipete 30 microlitros de poli-L-lisina em uma lâmina e, em seguida, coloque uma segunda lâmina na outra e coloque-as juntas para espalhar a solução uniformemente em ambas.

Agora separe as duas lâminas e deixe-as secar ao ar por 30 minutos. Em seguida, coloque um bloco de metal plano em um recipiente cheio de nitrogênio líquido. Lave as placas com solução M9 e transfira cerca de 10 microlitros de M9 contendo os vermes.

Como alternativa, escolha as minhocas e adicione M9 ao slide. Uma vez que os vermes são transferidos, solte suavemente uma lamínula, cruze sobre eles, de modo que a lamínula fique pendurada em uma borda. Em seguida, pressione suavemente a lamínula sem fazer movimentos laterais.

Agora transfira imediatamente a lâmina para o bloco de metal em nitrogênio líquido e deixe congelar. Após cinco minutos, retire a lamínula usando a borda saliente. Faça isso rapidamente para obter a rachadura adequada da cutícula.

Em seguida, mergulhe a lâmina em um frasco de vidro Coplin cheio de metanol a menos 20 graus Celsius. Após cinco minutos, transfira a lâmina para um frasco de vidro Coplin cheio de acetona por mais cinco minutos na mesma temperatura. As lâminas podem ser coradas diretamente ou armazenadas a menos 20 graus Celsius.

Remova a lâmina da acetona e deixe secar ao ar em temperatura ambiente. Em seguida, marque o local de uma parede circular de vaselina na parte inferior do slide e construa a parede de gelatina. Não esfregue a geléia durante este procedimento.

Em seguida, prepare uma câmara úmida em uma lixeira com toalhas de papel molhadas e coloque a lâmina em uma prateleira dentro. Não deve haver contato entre as toalhas e o escorregador ou entre os escorregadores adjacentes. Agora pipete PBS suficiente no círculo de gelatina para cobrir a área.

Coloque suavemente uma ponta de pipeta na borda do círculo e deixe o fluido se dispersar suavemente sobre os vermes. Em seguida, feche a tampa e aguarde cinco minutos. Após cinco minutos, incline a lâmina e aspire lentamente o PBS, tomando cuidado para não perder vermes da lâmina.

Em seguida, preencha cuidadosamente o círculo de gelatina com solução de bloqueio recém-preparada. E deixe a lâmina incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Após 15 minutos, substitua a solução de bloqueio por uma solução de bloqueio que contenha o anticorpo primário.

E incube o slide a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, remova o anticorpo primário e lave a lâmina aplicando e removendo a solução de bloqueio três vezes. Deixe cada aplicação de bloco incubar por 10 minutos.

Em seguida, adicione o anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio e incube a lâmina por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, lave a lâmina duas vezes com solução de bloqueio e depois uma vez com PBS. Em seguida, remova o máximo possível do PBS sem permitir que a amostra seque e remova cuidadosamente a geléia ao redor da amostra.

Aplique uma gota de meio de montagem na amostra, seguida de uma lamínula e um selo de esmalte. Em seguida, armazene as lâminas no escuro a quatro graus Celsius. Transfira a placa de biblioteca de RNAi de menos 80 graus Celsius para gelo seco.

Remova a fita de vedação. E transfira o clone de interesse para o sem-fim seletivo. Em seguida, risque o clone e cultive a bactéria durante a noite.

Antes de retornar a placa da biblioteca ao freezer de 80 graus Celsius negativos, aplique uma nova fita de vedação. No dia seguinte, inocular as colônias da placa em alíquotas de um mililitro de meio líquido contendo ampicilina. Em seguida, agite-os por cerca de 14 horas a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, semeie 200 microlitros por clone em placas de RNAi separadas. Deixe as placas secarem e induza a produção de RNAi com uma incubação noturna em temperatura ambiente. Um dia depois, transfira cinco vermes do estágio L4 para cada placa de RNAi marcada com o gene específico que é alvo.

Em seguida, transfira as placas para uma incubadora normalmente a 20 graus Celsius. Primeiro, examine os animais de controle versus RNAi sob luz brilhante em baixa e alta ampliação. Em seguida, examinar os animais de controlo versus RNAi sob luz fluorescente sob os filtros adequados.

Escaneie sistematicamente uma placa com animais de RNAi do canto superior esquerdo para o canto inferior direito de toda a placa em busca de fenótipos. Procure animais de interesse. Para um exame mais detalhado dos fenótipos de RNAi selecionados, concentre-se no intestino e use o zoom para avaliar os fenótipos de tubulogênese e morfogênese do lúmen.

Para examinar os vermes de interesse sob microscopia confocal, primeiro monte e imobilize-os manualmente, faça um círculo fino de graxa a vácuo ou vaselina em uma lâmina de vidro. A camada de graxa deve ser fina, não mais espessa que 0,1 milímetro. Em seguida, adicione cerca de 3,5 microlitros de azida sódica 10 milimolares no meio do círculo.

Em seguida, escolha rapidamente os vermes de interesse na solução sob um microscópio de dissecação antes que a solução seque. Em seguida, aplique suavemente uma lamínula e faça uma imagem dos animais em 30 minutos. Use uma pressão moderada e, sob o microscópio, verifique se os vermes não estão flutuando na solução.

Sob o microscópio confocal, encontre os vermes sob baixa potência e foco. Em seguida, use uma objetiva de imersão em óleo de 60 ou 100X para visualizar e visualizar o intestino. Em seguida, examine o animal sob luz fluorescente com o canal apropriado para selecionar áreas que exibem o defeito celular de interesse.

Mova-se rapidamente para evitar o branqueamento da foto. Em seguida, mude para a varredura a laser e restrinja a imagem ao intestino, definindo limites de varredura em seu lado dorsal e ventral. Capture uma série de imagens e depois mescle as imagens em uma única imagem de projeção.

Este protocolo descreve como analisar molecularmente e dissecar visualmente a biogênese da membrana polarizada no intestino de C. elegans em desenvolvimento, onde a morfogênese da membrana apical e do lúmen coincidem. Os domínios da membrana apical e basolateral, as junções associadas à membrana e o lúmen intestinal podem ser resolvidos e sua relação entre si pode ser examinada ao longo do desenvolvimento. Esses componentes subcelulares podem ser marcados por anticorpos marcados com fluorescência ou proteínas de fusão fluorescentes para marcação dupla ou tripla, conforme descrito no artigo que acompanha.

Defeitos macroscópicos do lúmen podem ser rapidamente escaneados usando um microscópio de fluorescência de dissecação. O ligante de citoesqueleto de membranas apicais ERM-1 acoplado a GFP é um marcador robustamente expresso útil para uma triagem de RNAi. Uma série de novos fenótipos de morfogênese e polaridade do lúmen intestinal, juntamente com seus defeitos genéticos subjacentes, foram descobertos ao usar esse marcador.

Em seguida, imagens de maior ampliação adquiridas por uma varredura a laser confocal foram usadas para examinar mais cuidadosamente os fenótipos para entender melhor os defeitos subjacentes. Alguns fenótipos podem ser quantificados. A quantificação foi usada para comparar esses defeitos e acompanhar sua progressão ao longo do desenvolvimento.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular a membrana intestinal e os compartimentos da membrana endo por imunocoloração e como analisar os fenótipos de RNAi de função da membrana polarizada e da biogênese do lúmen.