Name: O Canal de Excretory c. elegans como modelo para intracelular Lumen morfogênese e Vivo na biogênese de membrana polarizada em uma única célula: rotulagem por GFP-fusões, tela de interação de RNAi e Imaging (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda a analisar a biogênese de membrana polarizada in vivo usando o canal excretor de C. elegans como modelo unicelular. Este método combina técnicas de RNAi e imagem para estudar tubulogênese e morfogênese do lúmen intracelular.

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Agradecemos a M. Buechner (Universidade de Kansas, Kansas, EUA), K. Nehrke (Universidade de Rochester Medical Center, Rochester, Nova Iorque, EUA) e o centro de genética Caenorhabditis , financiado pelo National Institutes of Health, escritório de infra-estruturas de investigação Programas (OD010440 P40). Este trabalho foi apoiado por subsídios GM078653 NIH, MGH é 224570 e 223809 de SAA a V.G.

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Versatilidade genética dos c. elegans , transparência, plano de corpo simples e linhagem de células invariável fazem um excelente modelo para a análise da morfogênese. Este protocolo descreve como combinar padrão manipulações genéticas e a imagem latente estudos para aproveitar a 2 mícrons fina c. elegans canais excretores para estudar a membrana polarizada e biogênese intracelular lúmen em um tubo de célula única.
Rotulagem C. elegans excretoras ...

Todos os órgãos internos são compostos de tubos, cruciais para suas muitas funções diferentes, tais como o transporte e a troca de gases, líquidos e nutrientes e a excreção de resíduos metabólicos. Seu caráter polarizado, com distintas membranas apicais e lumenal, é adaptado para essas funções específicas, e defeitos na biogênese dos seus sistemas de endo - e membrana plasmática são uma causa frequente de doença humana1,2. A maioria dos tubos da vasculatura e dos órgãos internos é pluricelulares e forma um lúmen intercellularly; no entanto, tubos unicelulares, que formam o lúmen intracelular, podem, por exemplo, representar tanto quanto 30 – 50% dos leitos de capilares humano2. As membranas polarizadas de multi - e tubos unicelulares são similares na composição, embora seus microdomains podem variar com base na função específica do tubo (por exemplo, canalículos canal excretor contra microvilli intestinal em Caenorhabditis elegans; Veja que acompanham o papel de c. elegans tubulogenesis intestinal)3. Os princípios da biogênese de membrana polarizada e tubulogenesis são conservados entre metazoários, e uma máquina molecular semelhante direciona-los1,2,4.
O sistema excretor de c. elegans consiste de cinco células: a célula excretor (CE), célula de duto (DC), pore celular (PC) e duas células da glândula. Ablação do CE, DC ou PC faz com que o acúmulo de líquido na cavidade do corpo e os animais morrem em um início de fase larval5. Curiosamente, estes três tubos unicelulares criar seus lúmens de três maneiras diferentes: por célula esvaziamento (CE); envolvimento de célula juntamente com formação de junção autocellular (PC); e pelo envolvimento da célula, juntamente com autofusion (DC); diferentes mecanismos da morfogênese lúmen que são todas conservadas filogeneticamente6,7. O CE, localizado na lateral esquerda do bulbo posterior da faringe, envia duas extensões laterais do que os quatro canais ramificam-se para estender-se anteriormente e posteriormente (ambos do lado direito e esquerdo) para a ponta do nariz do worm e cauda , respectivamente (Figura 1)5,6,8. O CE estende-se desde aproximadamente 1 µm a 2 x 1.000 µm, tornando-se a célula maior no animal. Em um nível subcelular, o canal excretor é um tubo simples, gerado a partir de uma membrana basal, dirigida para a Trochozoa e um túnel por uma membrana lumenal (endotube). A membrana lumenal canal conecta-se à membrana lumenal adesiva em sua junção só intercelular; os canais são outra forma junctionless ao longo de seu comprimento (Figura 1). A membrana lumenal canal excretor e sua submembraneous citoesqueleto são apicais, definido por sua composição molecular que se assemelha a composição da membrana apical e submembraneous citoesqueleto de tubos multicelulares, tais como o intestino, e de outros epitélios (por exemplo, plana). Organelas citoplasmáticas, incluindo CDDP vesicular e outro (por exemplo, Golgi) endomembranes são distribuídos ao longo do comprimento do canal. Além disso, várias vesículas canaliculares - ligado à membrana lumenal, e/ou interligados ou isolada - são rosqueadas através do canal citoplasma7,8,9,10 . Esta conexão de plasma-membrana/canaliculares dinâmico mais expande sistema de membrana do canal e contribui para ambos lúmen morfogênese e osmoregulação10. O canal excretor assim consiste quase inteiramente de endo - e membranas de plasma, proporcionando um excelente modelo para a análise de biogênese de membrana polarizada e o Regulamento do endo-a interface da membrana plasmática. A dramática expansão da membrana apical durante a morfogênese do canal - neste sistema de célula única coincidente com extensão de lúmen – também permite analisar os problemas arquitectónicos decorrentes da necessidade de estabilizar e centralizar uma membrana lumenal intracelular . Este protocolo centra-se na análise da morfogênese estrutural do tubo canal e do lúmen e a dinâmica da membrana intracelular necessária para este processo, em vez dos sinais que dirigem o movimento da célula que geram a posição da CE na sistema excretor e construir suas intrincadas conexões com outros elementos celulares (revistos em6).
Uma vantagem adicional do sistema de célula única canal c. elegans para a análise da membrana polarizada e biogênese intracelular lúmen é sua capacidade de separar, no tempo do desenvolvimento, a geração de diferentes componentes de suas membranas e entroncamentos. A CE é nascida no momento do encerramento ventral e resolve ventro-lateral da faringe durante meados embriogênese5,6,8, durante o qual a extensão de tempo canal lateral e ramificação ocorrerem. Isto é seguido pela extensão do canal ântero-posterior durante a embriogênese atrasado, um processo que continua para o estágio larval de L1 (Figura 1). Em uma larva recém-eclodidos, a ponta do canal posterior atinge aproximadamente no meio do worm, totalmente estendendo-se até a cauda no final da fase L1, após o que o canal se alonga juntamente com o worm8. Crescimento do canal ativo a uma velocidade superior do crescimento do animal assim termina a primeira fase larval, no entanto, ainda mais o crescimento ocorre em paralelo com o crescimento do animal inteiro durante os estágios larvas adicionais (L2 – 4). Essa configuração fornece a oportunidade de analisar as diferentes etapas da biogênese de membrana de novo polarizada independente da divisão de células polarizada ou migração. Além disso, permite a separação deste processo da Assembleia dos cruzamentos (que ocorrem no embrião antes do início do lúmen); sua exigência exata na polarização de membrana é ainda uma questão em aberto no campo de polaridade. Finalmente, excepcionalmente separa apical de expansão de membrana basal, o último processo precede o anterior nos canais excretores10. O modelo de canal excretor de c. elegans , portanto, é um complemento particularmente informativo para o modelo intestinal que compartilha um número dessas vantagens para a análise de biogênese de membrana polarizada, mas executa-lo em uma configuração multicelular (ver o livro acompanhando sobre a tubulogenesis intestinal3).
Embora o selvagem-tipo canais são túbulos ultrafinos neste pequeno verme, seus lúmens podem ser visualized diretamente pela óptica Nomarski neste animal transparente. Na verdade, morfologias mutante canal cístico podem ser caracterizadas em animais sem rótulo usando baixa ampliação dissecando microscopia, que tem sido usada com grande efeito nas telas de genéticas para a frente para identificar genes envolvidos na tubulogenesis11. Melhor visualização da morfologia dos canais e distinção de suas membranas polarizadas, componentes do citoesqueleto, diferentes organelas intracelulares e outras estruturas subcelulares, no entanto, exige a rotulagem e superior de energia fluorescente microscopia confocal e dissecação. Embora a estrutura de fina dos canais coloca uma série de dificuldades para a rotulagem e microscopia, membranas e componentes subcelulares podem ser distinguidos através das moléculas específicas exclusivas para cada compartimento, e animais podem ser montados com segurança para microscopia, por se certas precauções para evitar a introdução de artefatos (ver protocolo e discussão). Rotulagem pode ser feito por imuno-histoquímica em amostras fixas, ou através da geração de vermes transgênicos expressando proteínas da fusão fluorescente sob o controle de suas próprias ou excretoras promotores de canal específico para a imagem latente na vivo . Este protocolo descreve a última técnica de rotulagem (tubulogenesis intestinal para anticorpo que mancha3ver o papel de acompanhamento).
A habilidade de combinar estudos de perda ou ganho-de-função na vivo com na vivo de imagem análise na célula única nível ao longo do desenvolvimento faz o canal excretor de c. elegans um modelo particularmente forte para o molecular e análise celular de tubulogenesis unicelulares. Avanço ou retrocesso telas genéticas podem ser executadas iniciando com um animal transgénico selvagem-tipo ou etiquetado para identificar fenótipos de morfogênese de canal (por exemplo, cistos) e seus defeitos genéticos subjacentes. Alternativamente, tais telas podem começar com um fenótipo mutante (por exemplo, um canal cístico) e identificar supressores ou potenciadores deste fenótipo para identificar genes que interagem funcionalmente com o gene causando o fenótipo mutante. O defeito genético causando o fenótipo mutante pode induzir uma perda (por exemplo, através do apagamento do gene) ou um ganho (por exemplo, através de uma mutação de ativação ou através da introdução de cópias do gene em excesso) da função investigada. Encaminhar mutagênese ou RNAi sistemática telas são sem preconceitos em função dos genes e permitirem a identificação imparcial de genes envolvidos na função de interesse. Tendo em conta a disponibilidade de todo o genoma de RNAi alimentação bibliotecas, quase cada gene pode ser facilmente derrubado por RNAi em c. elegans, tal que qualquer único gene de interesse ou qualquer grupo de genes (por exemplo, em telas de alvo) pode também ser rapidamente analisado por seu efeito em uma abordagem genética reversa. Para demonstrar uma possível combinação de abordagens, aqui descrevemos uma tela de interação alvo RNAi, começando com um mutante de ganho-de-função cística canal excretor, rotulado com proteína de canal citoplasmática verde fluorescente (GFP). O fenótipo mutante foi gerado pela superexpressão de erm-1, um altamente conservadas c. elegans ortholog da família de vinculador de membrana-actina Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), que tem sido implicados na morfogênese do lúmen e membrana organização em muitas espécies12. C. elegans ERM-1 localiza-se às membranas lumenal dos órgãos internos, tais como o canal excretor e intestino e é necessário para a formação do lúmen em ambos13. MTC-1 superexpressão recrutas excesso actina e vesículas para a membrana lumenal canal, aumentando o fluxo no lúmen e gerando um curto canal cístico e uma membrana lumenal frisada com actina espessada subpêlo9. O protocolo descreve como gerar cepas transgênicas com canal excretor-expressa rotulado fusão proteínas (ou outras proteínas); como executar alvo RNAi telas começando com essas estirpes, para identificar os modificadores de um fenótipo de canal; e como analisar visualmente os resultados de tais telas por dissecação e confocal a microscopia de fluorescência, incluindo maneiras simples de quantificar fenótipos tubulogenesis informativo. Alternativa de rotulagem técnicas e detalhes de RNAi, ajustado para os genes tubulogenesis frequentemente letal, encontram-se no livro de acompanhamento sobre tubulogenesis intestinal3. Todos os métodos podem ser usados em várias combinações para a investigação de outras perguntas no canal tubulogenesis.

<table><tbody><tr><td>Cloning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo pPD95.75</td><td>Addgene</td><td>Cat. No. 37464</td><td></td></tr><tr><td>Kit PCR</td><td>Qiagen</td><td>Cat. No. 27106</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ligadura</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat. Não. Marcador de DNA E2611L</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat. Não. SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Grau de DNA de agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. Não. BP164-100</td><td></td></tr><tr><td>Células competentes</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat. Não. C2987H</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Gato Científico</td><td>. Não. BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>Cat. Não. ED-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. Não. A38S-500</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. Não. BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Equipamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>máquina PCR&nbsp;</td><td>MJ Research</td><td>Cat. Não. PTG-200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>gato. No. 5415C</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Precision Scientific&nbsp;</td><td>gato. Nº 666A3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de corrida em gel</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. No. 09-528-165</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação de gel Fisher</td><td>Scientific</td><td>Cat. No. 45-000-465</td><td></td></tr><tr><td>Gerador de Imagens Moleculares Sistema Gel Doc XR</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat. No. 1708195EDU</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Espectrofotômetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat. Não. ND1000</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans related1</td><td></td><td></td><td>1consulte a referência19 para procedimentos padrão de cultura e manutenção de C. elegans.</td></tr><tr><td>LB Médio e placas2</td><td></td><td></td><td>2consulte referência19 para protocolos.</td></tr><tr><td>Triptona&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>Cat. no. 611845000</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de Levedura</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat. no. 212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>Cat. no. S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat. nº 214040</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>Cat. nº A0116</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. nº. BP912</td><td></td></tr><tr><td>M9 Medium2</td><td></td><td></td><td>2consulte a referência19 para protocolos.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>Cat. nº S7653</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>Cat. nº P0662</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>Cat. nº S7907</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>Cat. nº M2773</td><td></td></tr><tr><td>NGM placas 2</td><td></td><td></td><td>2consulte referência19 para protocolos.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>Cat. no. S7653</td><td></td></tr><tr><td>Peptone&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat. no. 211677</td><td></td></tr><tr><td>Triptona&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>Cat. no. 611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat. no. 214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>Cat. no. M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2Sigma</td><td></td> <td>Cat. no. C3881</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat. nº C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat. nº P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>Cat. nº P0662</td><td></td></tr><tr><td>placas de RNAi3</td><td></td><td></td><td>3consulte a referência21 para protocolos.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>Cat. no. S7653</td><td></td></tr><tr><td>Peptone&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat. no. 211677</td><td></td></tr><tr><td>Triptona&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>Cat. no. 611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat. no. 214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>Cat. no. M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2Sigma</td><td></td> <td>Cat. no. C3881</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat. nº C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat. nº P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>Cat. nº P0662</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>US Biological</td><td>Cat. no. I8500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. no. BP2648</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. no. SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Hipoclorito de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. nº 50371500</td><td></td></tr><tr><td><forte>Bactérias</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 bactérias</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bactérias HT115</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Bibliotecas de RNAi em todo o genoma</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biblioteca de alimentação de RNAi em todo o genoma da Ahringer (ref21,58,59)</td><td>Fonte: BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans Biblioteca de alimentação ORF-RNAi (ref60)</td><td>Fonte: BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Relacionado a imagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>MP Biomedicals,LLG</td><td>Cat. no. 193917</td><td></td></tr><tr><td> Materiais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graxa a Vácuo Silicone</td><td>Beckman</td><td>Cat. no. 335148</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat. no. 4448</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos, 6 poços&nbsp;</td><td>Corning Inc.</td><td>Cat. nº 08-772-33</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ-U microscópio de dissecação (Nikon)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação SZX12 (Olympus), equipado com um acessório de fluorescência estéreo de alta potência (Kramer Scientific), câmera CCD com software de captura Q e lâmpada fluorescente X-Cite (Photonic Solutions).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser TCS SL (Leica Microsystem)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal de varredura a laser C2 montado em um microscópio invertido ECLIPSE Ti-E (Nikon)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

o canal de excretory c. elegans como modelo para intracelular lumen morfogênese e vivo na biogênese de membrana polarizada em uma única célula: rotulagem por gfp-fusões, tela de interação de rnai e imaging

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

Os quatro canais excretores de c. elegans são tubos estreitos estendidos através do comprimento do animal, de uma única célula, com quase igualmente longe estendido endotubes intracelular que construir e estabilizar o lúmen com uma membrana e submembraneous citoesqueleto de caráter apical. Excretor célula expande seu comprimento aproximadamente 2.000 vezes para gerar esses canais, fazendo com que este modelo exclusivo para a avaliação na vivo de biogênese de membrana de novo polarizada, morfogênese lúmen intracelular e unicelulares tubulogenesis. O protocolo apresentado aqui mostra como combinar o padrão de rotulagem, ganho e perda-de-função genética ou RNA de interferência (RNAi)-e abordagens microscópicas usar este modelo para dissecar visualmente e funcionalmente analisar esses processos em um nível molecular. Como um exemplo de uma abordagem de rotulagem, protocolo descreve a geração de animais transgénicos com proteínas da fusão fluorescente para análise ao vivo de tubulogenesis. Como um exemplo de uma abordagem genética, destaca pontos-chave de uma tela de interação baseada em RNAi visual projetado para modificar um fenótipo de ganho-de-função canal cístico. Os métodos específicos descritos são como: etiqueta e visualizar os canais expressando proteínas fluorescentes; construir uma biblioteca de alvo RNAi e strategize RNAi triagem para a análise molecular da morfogênese de canal; visualmente, avaliar as modificações dos fenótipos de canal; Pontuação deles dissecando a microscopia de fluorescência; caracterizar componentes subcelulares canal com resolução mais alta pela microscopia confocal; e quantificar parâmetros visuais. A abordagem é útil para o investigador que está interessado em aproveitar o canal excretor de c. elegans para identificar e caracterizar os genes envolvidos nos processos filogeneticamente conservados de lúmen intracelular e unicelulares morfogênese de tubo.

Este protocolo descreve como usar os canais excretores de c. elegans visualmente e molecularmente analisar tubulogenesis unicelulares e morfogênese lúmen intracelular em uma única célula. Durante sua extensão da época do meio da embriogênese até a idade adulta, os quatro canais excretores continuam a expandir seus basolateral e apical/lumenal membranas juntamente com seu sistema endomembranoso canalicular e CDDP, fornecendo um modelo exclusivo para a análise na vivo ...

O canal excretor de c. elegans é um exclusivo modelo de célula única para a análise visual na vivo de biogênese de membrana de novo polarizada. Este protocolo descreve uma combinação de padrão genético/RNAi e abordagens, adaptávelas para a identificação e caracterização de moléculas dirigindo tubulogenesis unicelulares e apical da membrana e lúmen biogênese de imagem.

O Canal de Excretory c. elegans como modelo para intracelular Lumen morfogênese e Vivo na biogênese de membrana polarizada em uma única célula: rotulagem por GFP-fusões, tela de interação de RNAi e Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

O objetivo geral dessa combinação de procedimentos padrão é demonstrar como o canal excretor de C.elegans pode ser utilizado para a análise in vivo de tubo unicelular, luz intracelular e biogênese de membrana polarizada de novo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de tubulogênese e polaridade, como a forma pela qual uma luz intracelular alongada é estabelecida ou quais moléculas são necessárias para expandir uma membrana apical. A principal vantagem desse sistema modelo é que uma enorme expansão de 2000 vezes da membrana apical em relação à membrana lateral basal pode ser visualmente verificada in vivo na célula única.De modo geral, indivíduos novos neste modelo terão dificuldades porque o canal excretor de C.elegans é muito fino e sensível ao estresse osmótico e a qualquer manipulação necessária para a obtenção de imagens. Este vídeo sobre tubulogênese do canal excretor é acompanhado por um vídeo sobre tubulogênese intestinal, modelos mutuamente informativos para a análise in vivo do desenvolvimento de membranas polarizadas. Em relação à marcação, o vídeo complementar sobre tubulogênese intestinal descreve o procedimento alternativo de marcação, que envolve a coloração de componentes celulares com anticorpos marcados fluorescentemente.Essa técnica também é aplicável ao canal excretor. Este vídeo descreve a análise de imagem em tempo real utilizando animais com proteínas de fusão marcadas com fluorescência. O texto descreve como construir um plasmídeo contendo um gene de interesse ligado à GFP e como gerar animais transgênicos que expressem uma proteína de fusão.O protocolo também apresenta exemplos de marcadores de membrana específicos para o canal excretor, marcadores de organelas e promotores. Outros recursos para ambos os procedimentos de marcação também são fornecidos. Neste vídeo, uma linhagem transgênica que marca o citoplasma do canal com GFP e apresenta um fenótipo de canal cístico é analisada em busca de modificadores utilizando RNAi.O fenótipo é causado pela superexpressão de ERM-1, um gene de morfogênese do lúmen. A partir de um crescimento noturno de bactérias expressando RNAi em placas de ampicilina mais tetraciclina, escolha colônias e inócu-las em 600 microlitros de meio LB líquido com ampicilina. Incube esses tubos a 37 graus Celsius em agitador durante seis horas.A partir dos cultivos líquidos, semeie alíquotas de 70 microlitros nas cavidades de placas de RNAi de seis poços em conjuntos duplicados ou triplicados. Em seguida, incube as placas de RNAi durante a noite a 20-22 graus Celsius. Na manhã seguinte, selecione três vermes em estágio L4 e coloque-os em cada cavidade das placas de RNAi.Cada um deve parecer saudável, bem alimentado e expressar o marcador apropriado no canal excretor. Em seguida, incubar as placas a 20 a 22 graus Celsius por três dias. Após três dias consumindo bactérias de RNAi, examinar os fenótipos do canal nas proles F1 em um microscópio estereoscópico de fluorescência.Para pontuar a extensão do canal, examine vermes na fase larval L3 L4. Para este procedimento, tenha uma folha de pontuação para a análise que inclua todos os fenótipos possíveis. Vários fenótipos do canal são descritos no protocolo textual.Analise sistematicamente os poços, começando por um controle, como vermes alimentados com bactérias de RNAi de vetor vazio. Primeiro, utilize luz brilhante com baixa magnificação e, em seguida, com alta magnificação para identificar fenótipos gerais, como letalidade embrionária, esterilidade, aparência clara e aparência achatada. Na ficha de pontuação, registre essas observações.Em segundo lugar, sob luz fluorescente, examine os fenótipos do canal excretor, primeiro em ampliação menor e depois em ampliação maior. Aproxime a imagem e avalie fenótipos quantificáveis, como o comprimento do canal, a largura da luz ou o tamanho dos cistos. Plasmídeos marcadores, como role, podem ser úteis para a obtenção de imagens, mantendo os animais no local em vez de se moverem para frente.E também pode fornecer uma visualização melhorada do fenótipo com o animal girando sobre si mesmo. Avalie pelo menos 100 animais por placa para uma análise quantitativa que leve em consideração fenótipos com menor penetrância. Realize esses experimentos em triplicata.Durante este processo, adquira imagens dos fenótipos predominantes de pelo menos três animais diferentes utilizando uma câmera CCD e um software de captura de imagens. Em seguida, adquira imagens em magnificações tanto mais baixas quanto mais altas. Para analisar os vermes de interesse por microscopia confocal, primeiro monte e imobilize-os.Manualmente, faça um círculo fino de graxa de vácuo ou vaselina em uma lâmina de vidro. A camada de graxa não deve ter mais do que 0,1 milímetros de espessura. Em seguida, adicione cerca de seis microlitros de solução de lidocaína a cinco por cento no centro do círculo.Em seguida, colete rapidamente os vermes de interesse na solução sob um microscópio estereoscópico, antes que a solução seque. Depois, coloque suavemente uma lamínula sobre o círculo de graxa e permita que ela assente sob seu próprio peso. Verifique a imobilidade sob um microscópio estereoscópico.Os vermes devem estar intactos e aderidos à lâmina, não flutuando na solução. Agora, coloque uma gota de óleo sobre a lamínula e foque os vermes sob luz clara com uma objetiva de 10x em um microscópio confocal. Em seguida, mude cuidadosamente para uma objetiva de imersão a óleo e troque para luz de fluorescência para visualizar os canais excretores marcados.Agora, examine os fenótipos celulares e subcelulares dos canais excretores para encontrar um espécime adequado para imagem. Trabalhe rapidamente para evitar o desbotamento pela luz. Observe a forma da luz, o diâmetro da luz e o tamanho e a forma dos cistos.Além disso, examine os componentes subcelulares marcados para análise, como a membrana apical, a membrana basal, o citoplasma, as vesículas ou organelas. Utilizando o controle do software, ajuste a intensidade do laser e adquira as imagens. Para a melhor resolução, utilize um ganho baixo, não abra muito o diafragma e use cerca de quatro médias por imagem.Além disso, não sature excessivamente a intensidade da cor. Primeiro, adquira uma imagem de uma única seção e, em seguida, adquira uma imagem de múltiplas seções ao longo do eixo z. Geralmente, de 15 a 20 seções são suficientes.Ao criar uma moldura em uma região específica do canal excretor na área de varredura no painel de controle, é possível ampliar uma área do canal. Para canais dupla ou múltipla marcados, é essencial usar a varredura sequencial para evitar vazamento entre canais. Caso contrário, os estudos de co-localização dos sinais não serão precisos.Concomitantemente, adquira imagens DIC Nomarski correspondentes para quantificar o comprimento do canal ou os diâmetros da luz em relação ao comprimento e diâmetro do corpo do verme. Posteriormente, sobreponha as imagens de fluorescência e Nomarski para demonstrar as referências anatômicas. Este protocolo descreve como utilizar os canais excretores de C. elegans para analisar visual e molecularmente a tubulogênese unicelular e a morfogênese da luz intracelular em uma única célula.Componentes subcelulares, como membranas apicais, citoplasma e vesículas endossomais versus canalículares, podem ser visualizados e diferenciados na mesma célula, utilizando proteínas de fusão fluorescentes específicas para cada componente. Um verme que superexpressava uma molécula associada à membrana apical chamada ERM-1 foi alimentado com bactérias de RNAi para triagem de modificações em seu fenótipo único do canal excretor. Supressores e potencializadores foram identificados utilizando um microscópio estereoscópico fluorescente.Muitos aspectos subcelulares dos fenótipos modificados poderiam ser examinados em detalhes com maior aumento por microscopia confocal. Eles incluíam membranas anormais, cistos luminais em vez de vacúolos citoplasmáticos, localização de canalículos intracelulares, lúmen descontínuo com morfologia anormal da ponta do canal, defeitos na extensão do lúmen versus canal e recrutamento de componentes subcelulares para o lúmen. Muitos dos efeitos dos supressores e potenciadores do fenótipo induzido por ERM-1 também poderiam ser quantificados, como o tamanho do cisto, o comprimento do canal e componentes subcelulares marcados com fluorescência.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como combinar procedimentos padrão de RNAi e ERM para caracterizar fenótipos dos canais excretores de C. elegans em microscópios estereoscópicos fluorescentes e confocais. Usando essas técnicas, você deverá ser capaz de investigar a biogênese de membranas polarizadas de novo e a tubulogênese em uma única célula em animais vivos.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

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Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

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Visualizando neuroblasto Cytokinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogênese

Aqui é mostrado como rastrear e quantificar os processos de desenvolvimento em C. elegans. Os métodos apresentados são baseados em ferramentas de código aberto que podem ser facilmente implementadas. É demonstrado como reconstruir modelos 3D de forma celular, como rastrear manualmente estruturas subcelulares e como analisar o fluxo contrátil cortical.

Rastreamento e quantificação processos de desenvolvimento em<em&gt; C. elegans</em&gt; Como usar as ferramentas de código aberto

O transparente c. elegans intestino pode servir como uma"em vivo câmara de tecido" para estudar a biogênese de membrana e lúmen apicobasal nível unicelular e subcellular durante tubulogenesis multicelulares. Este protocolo descreve como combinar padrão de rotulagem, genética/perda--função de RNAi e abordagens microscópicas para dissecar esses processos em um nível molecular.

O c. elegans intestino como um modelo para intercelular Lumen morfogênese e In Vivo biogênese de membrana polarizada no nível de célula única: rotulagem por anticorpos, RNAi perda--função de análise e de imagem

Este protocolo demonstra como controlar uma translocação nuclear da proteína sob estresse de calor, usando uma fluorescência verde (GFP) de proteína proteína da fusão como um marcador e 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) coloração. O DAPI protocolo de coloração é rápido e preserva os sinais de Localização subcellular GFP e proteína.

Detectar a localização Subcellular da proteína por marcação de proteína de fluorescência verde e 4' 6-Diamidino-2-phenylindole de coloração em Caenorhabditis elegans

Aqui, nós apresentamos uma aproximação combinatória usando a microscopia de alta resolução, as ferramentas computacionais, e a rotulagem da único-pilha em embriões vivos de C. elegans para compreender a única dinâmica da pilha durante o neurodevelopment.

Microscopia de folha de luz isotrópica e análise de linhagem de células automatizadas para catalogar Caenorhabditis elegans Embryogenesis com resolução subcelular

Este trabalho descreve um protocolo semi-alta de supressão que permite imagens simultâneas de lapso de tempo 3D de embriaênese embrionária em embriões de 80-100 C. elegans em uma única corrida noturna. Além disso, as ferramentas de processamento e visualização de imagens são incluídas para simplificar a análise de dados. A combinação destes métodos com tensões personalizadas do repórter permite a monitoração detalhada do embryogenesis.

Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans

Foi apresentado um protocolo para a imagem dos microtúbulos dinâmicos in vivo usando proteína de ligação final rotulada fluorescente. Descrevemos os métodos para rotular, imagem e analisar os microtúbulos dinâmicos no neurônio de microtúbulo lateral posterior (PLM) de C. elegans.

In vivo Avaliação da Dinâmica e Orientação em Caenorhabditis elegans Neurônios

O protocolo descreve um projeto de chip microfluídico simples e metodologia de microfabricação usada para cultivar C. elegans na presença de um suprimento contínuo de alimentos por até 36 h. O dispositivo de crescimento e imagem também permite imagens intermitentes de alta resolução a longo prazo de processos celulares e subcelulares durante o desenvolvimento por vários dias.

Um chip microfluídico simples para crescimento a longo prazo e imagem de Caenorhabditis elegans

Este protocolo descreve imagens de lapso de tempo de C. elegans baseadas em microfluídica em todo o desenvolvimento pós-embrionário.

Imagens de C . elegans de alta resolução em todos os estágios larvais

Aprenda a analisar a biogênese de membrana polarizada in vivo usando o canal excretor de C. elegans como modelo unicelular. Este método combina técnicas de RNAi e imagem para estudar tubulogênese e morfogênese do lúmen intracelular.

O Canal de Excretory c. elegans como modelo para intracelular Lumen morfogênese e Vivo na biogênese de membrana polarizada em uma única célula: rotulagem por GFP-fusões, tela de interação de RNAi e Imaging (Vídeo) | JoVE Journal

O Canal de Excretory c. elegans como modelo para intracelular Lumen morfogênese e Vivo na biogênese de membrana polarizada em uma única célula: rotulagem por GFP-fusões, tela de interação de RNAi e Imaging

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