Stereological estimativa do número de neurônios Dopaminergic na substância negra do Mouse usando o fracionador óptico e equipamento padrão de microscopia
1 de setembro de 2017
Este trabalho apresenta um protocolo passo a passo para a estimativa stereological imparcial de números de celular neuronal dopaminérgicos na substância negra do mouse usando o equipamento padrão de microscopia (i.e., um microscópio de luz, uma tabela de objetos motorizado (x, y, z avião) e software de domínio público para análise de imagem digital.
O objetivo geral deste protocolo é descrever a estimativa estereológica baseada em design do número de células dopaminérgicas no SN do camundongo usando equipamento de microscopia padrão. Este método é útil para estimar o número de neurônios dopaminérgicos na substância negra do camundongo para pesquisa pré-clínica da doença de Parkinson usando estereologia imparcial baseada em design. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser realizada com equipamento de microscopia padrão sem a necessidade de uma configuração de estereologia completa disponível comercialmente.
Demonstrando o procedimento estará Louisa Friez, uma técnica do meu laboratório. Comece colocando um cérebro de camundongo fixo com paraformaldeído em uma matriz cerebral e fazendo um corte mais 0,74 milímetros de bregma. Transfira a parte caudal do cérebro, incluindo o SN, para 4% PFA em 0,1 molar e fixe durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, troque o PFA por 30% de sacarose em PBS 0,1 molar e incube por mais dois dias a quatro graus Celsius para proteger a amostra crio. Após dois dias, quando o cérebro afundou na sacarose, coloque o tecido em um Cryomold preenchido com composto de temperatura de corte ideal e congele lentamente o tecido em isopentano resfriado com gelo seco líquido. Use um criostato para cortar em série seções criogênicas de 30 mícrons no plano coronal.
Marque o hemisfério direito perfurando um pequeno orifício na região superior do tronco cerebral. Colete quatro séries de seções começando em menos 2,46 milímetros de bregma e terminando em 4,04 milímetros de bregma. Transfira cada série de seções para um tubo cheio de crioprotetor e armazene a menos 20 graus Celsius.
Capture imagens digitais de seções de SN coradas imuno-histoquimicamente com tirosina hidroxilase usando um software de imagem acoplado a um microscópio. Comece determinando a montagem real e a espessura das seções em três locais de contagem selecionados aleatoriamente por seção. Primeiro clique no deslocamento superior da vista para definir o topo da seção.
Em seguida, clique em parar vista superior. Depois disso, clique no deslocamento inferior da vista e, em seguida, clique em parar a parte inferior da vista. Anote a espessura da seção.
Calcule a zona de proteção subtraindo três mícrons do deslocamento superior e digite o resultado na caixa de deslocamento superior. Em seguida, subtraia a altura de 13 mícrons do dissector óptico do número de deslocamento superior e digite o resultado na caixa de deslocamento inferior. Selecione os seguintes parâmetros, etapas 14, tamanho 1,00.
Selecione o diretório para salvar o arquivo. Clique na sequência para iniciar a aquisição. Após a aquisição das imagens, clique em processamento e selecione os seguintes parâmetros, todos os planos da sequência, montagem e as caixas rápidas e de costura com sobreposição de imagem de 10%Comece a costurar as imagens clicando em iniciar.
Isso gerará imagens de pilha para análise. Para começar, abra a imagem clicando em arquivo e abra. Defina a escala da imagem usando o comando analyze and set scale.
A partir desta etapa, altere o tamanho definido de pixels para mícrons. Selecione os plug-ins, depois o comando grid e depois o comando grid type lines para inserir aleatoriamente uma grade. Marque a caixa de deslocamento aleatório.
Defina o tamanho de um quadrado dentro da grade como 130 mícrons por 130 mícrons para igual a 16.900 mícrons quadrados. Altere o tipo de imagem de 16 bits para cor RGB clicando na imagem e digite a cor RGB. Localize a substância negra pars compacta.
Circunde a região com a ferramenta pincel usando uma largura de pincel de 11. Desfaça o comando set scale clicando em analyze then set scale then click to remove scale to calculate in pixels instead than microns. Faça uma captura de tela, salve o arquivo de imagem e abra o novo arquivo com o ImageJ.
Selecione o pincel e uma largura de pincel de 25. Marque cada quadrado de grade que entra em contato com o SN para colocação de um dissector óptico. Selecione um quadrado de grade que inclua partes do SN. Meça o canto superior esquerdo do quadrado com o cursor em ImageJ para definir as coordenadas x e y iniciais.
Selecione o modelo de planilha intitulado posição do dissector óptico e calcule a posição do dissector óptico. Em seguida, estime o número de células usando a planilha de cálculo de contagem de células, conforme descrito na parte escrita do protocolo. Esta imagem de baixa potência mostra uma seção do cérebro do camundongo após a coloração TH para neurônios dopaminérgicos.
A ampliação mais alta representa neurônios dopaminérgicos TH positivos. A inserção mostra a região encaixotada com maior ampliação. Esta imagem mostra uma série de seções SN coradas com TH cobrindo todo o SN do camundongo, de rostral a caudal.
Cada seção é separada da seção consecutiva por 120 mícrons. O número de neurônios TH positivos no SN do camundongo direito e esquerdo foi estimado usando o método mostrado neste vídeo e usando um sistema de estereologia disponível comercialmente. Como visto aqui, ambos os métodos resultaram em contagens de células comparáveis e não houve diferenças significativas entre os conjuntos de dados.
Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de proteção individual, como luvas de proteção, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma estimativa estereológica imparcial do número de neurônios dopaminérgicos na substância negra do camundongo usando o método da fração óptica e o equipamento de microscopia padrão.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para a estimativa estereológica imparcial da contagem de células neuronais dopaminérgicas na substância negra de camundongos, utilizando ferramentas padrão de microscopia. O método tem como objetivo facilitar a pesquisa pré-clínica na doença de Parkinson, fornecendo uma abordagem confiável para a quantificação celular sem a necessidade de sistemas estereológicos especializados.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa sobre a Doença de Parkinson
Contexto
- Os neurônios dopaminérgicos são essenciais para o controle motor.
- A substância negra é uma região-chave afetada na doença de Parkinson.
- A estereologia imparcial fornece um método quantitativo robusto.
- O equipamento padrão de microscopia torna a técnica acessível.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um protocolo passo a passo para a quantificação neuronal.
- Utilizar a estereologia imparcial baseada em delineamento em modelos de camundongos vivos.
- Permitir estudos pré-clínicos que examinem a perda de neurônios dopaminérgicos.
Métodos Utilizados
- Microscopia padrão, incluindo microscopia de luz e software de análise de imagens digitais.
- Substância negra de camundongo como modelo biológico.
- Fixação detalhada, crioproteção e corte de tecido cerebral de camundongo.
- Imagem digital e técnicas específicas de imunohistoquímica.
- Medições e cálculos cuidadosos para determinar a contagem neuronal.
Resultados Principais
- Demonstrou estimativa precisa de neurônios dopaminérgicos na SN.
- Métodos padrão e avançados produziram contagens neuronais comparáveis.
- Ênfase importante na confiabilidade do método utilizando ferramentas padrão.
Conclusões
- Este estudo apresenta uma abordagem viável para quantificar populações neuronais em pesquisas.
- Amplia a compreensão da perda neuronal na doença de Parkinson.
- Utiliza ferramentas de fácil acesso, promovendo uma aplicação mais ampla em estudos de neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação precisa da perda de neurônios dopaminérgicos na substância negra é um ponto final crítico na pesquisa pré-clínica da doença de Parkinson, informando diretamente a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas de estratégias neuroprotetoras. Este protocolo permite uma estimativa estereológica confiável e imparcial utilizando equipamentos microscópicos convencionais, reduzindo a dependência de sistemas especializados de estereologia e aumentando a acessibilidade para fluxos de trabalho de biologia de descoberta. Ao fornecer dados quantitativos e reprodutíveis de contagem celular, o método reforça a confiança preditiva em testes iniciais de hipóteses sobre alvos e decisões de priorização de portfólios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao fornecer quantificação imparcial da sobrevivência de neurônios dopaminérgicos em modelos pré-clínicos da doença de Parkinson.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da estereologia baseada em delineamento, que minimiza o viés do observador e a variabilidade técnica em estudos de engajamento de alvo.
- Valor Preditivo: Gera dados quantitativos de contagem neuronal que auxiliam na avaliação da eficácia da modulação do alvo e no apoio a decisões de avançar ou não avançar no estágio inicial de descoberta.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Produz resultados histológicos padronizados e quantitativos adequados para validar acertos em triagens que visam preservar a integridade dos neurônios dopaminérgicos.
- Reprodutibilidade: Fornece medidas consistentes de contagem celular entre cortes e animais, apoiando a padronização do ensaio para avaliação de compostos em etapas subsequentes.
- Escalabilidade: Compatível com microscopia padrão e softwares de análise de imagem, permitindo maior adoção em diversas plataformas de descoberta sem necessidade de equipamentos especializados.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela diretamente a perda de neurônios dopaminérgicos na substância negra, uma característica patológica central da doença de Parkinson, aumentando a validade translacional.
- Continuidade Pré-clínica: Oferece uma ponte quantitativa entre triagem de descoberta e validação pré-clínica, fornecendo dados comparáveis aos sistemas comerciais de estereologia.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite decisões objetivas e baseadas em dados sobre a progressão de compostos com base em métricas estatisticamente robustas de sobrevivência neuronal.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a identificação de compostos promissores e a avaliação de eficácia pré-clínica, oferecendo uma leitura quantitativa de histologia que contribui para a compreensão mecanicista e a confiança no alvo.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a quantificação de populações de neurônios dopaminérgicos como leitura funcional da modulação de vias em modelos pré-clínicos.
- Triagem: Gera resultados quantitativos reprodutíveis baseados em imagens, permitindo comparações confiáveis dos efeitos de compostos sobre a sobrevivência neuronal.
- Análises: Fornece dados numéricos de contagem celular e comparabilidade estatística entre grupos experimentais, facilitando comparações de condições orientadas por dados.
- Pesquisa Translacional: Correlaciona-se com a patologia da doença de Parkinson ao medir a perda de neurônios em uma região cerebral relevante para a doença, apoiando a validação pré-clínica alinhada a biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e acessível de estereologia que pode ser aplicado em diversos programas de descoberta em neurociência sem exigir equipamentos de alto custo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio da quantificação estereológica imparcial baseada em delineamento.
- Valor Operacional: Aprimora a reprodutibilidade e a padronização entre laboratórios ao utilizar ferramentas amplamente disponíveis de microscopia e análise de imagens.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao eliminar a necessidade de sistemas especializados de estereologia, mantendo a comparabilidade dos dados com plataformas comerciais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos pré-clínicos com base em dados quantitativos e validados histologicamente de preservação de neurônios dopaminérgicos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em histologia, imuno-histoquímica e princípios estereológicos para o preparo preciso de tecidos e identificação de regiões.
- Depende de equipamento microscópico motorizado com controle no eixo z e software de montagem de imagens para análise sistemática de cortes.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de coloração, espessura dos cortes e regras de contagem para garantir reprodutibilidade entre os locais.
- A adaptação a outras regiões cerebrais ou tipos de neurônios pode exigir ajustes nos parâmetros de coloração, tamanho da grade e dimensões do dissector óptico.
- As limitações práticas incluem a dependência da qualidade dos cortes e a necessidade de treinamento rigoroso para manter a precisão na contagem e evitar viés de amostragem.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
- Valor Científico: A replicação em múltiplas seções e animais leva em conta a variabilidade biológica e técnica, aumentando a confiança de que as contagens observadas de neurônios refletem efeitos experimentais reais e não artefatos de amostragem.
- Valor Operacional: Protocolos de amostragem consistentes reduzem a variabilidade entre operadores e apoiam a padronização entre laboratórios, o que é essencial para projetos de descoberta em múltiplos locais.
