Horizontal Whole Mount: um protocolo de processamento e imagem de Novel para secções transversais grossas de tecidos tridimensionais
August 2nd, 2017
Este trabalho apresenta um novo protocolo de processamento e imagem para análises de seção transversal de tecido grosso e tridimensional que permitem a exploração completa das modalidades de imagem confocal. Este protocolo preserva a antigenicidade e representa um sistema robusto para analisar histologia da pele e potencialmente outros tipos de tecido.
O objetivo geral deste protocolo histológico e de imagem é apresentar um sistema robusto que preserve a antigenicidade do epítol e a integridade estrutural da pele, o que permite a exploração total das modalidades de imagem confocal. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave onde há um requisito para examinar a natureza de qualquer tipo de célula dentro de uma arquitetura de tecido tridimensional complexa. A principal vantagem dessa técnica em comparação com as técnicas histológicas padrão é que ela é robusta e fácil de executar.
Além disso, o protocolo complementa perfeitamente a análise tridimensional em microscopia confocal. Comece aparando a pele colhida da região dorsal medial de um camundongo em pedaços retangulares. Cada peça deve ser dimensionada para caber na parte inferior de um criomolde.
Uma área de um centímetro quadrado de pele dorsal que se encaixa em um criomold de 22 milímetros por 30 milímetros por 20 milímetros é demonstrada aqui. Após a fixação, empurre a pele lavada para o fundo do molde preenchido com OCT para que fique nivelado com o fundo. Marque a orientação do folículo piloso no criomolde, pois isso determina a orientação do corte do criomolde.
Transfira os blocos criogênicos para uma placa de metal em um freezer de 80 graus negativos para evitar a flutuação e o deslocamento do tecido. Monitore o processo de congelamento para manter a orientação da pele na parte inferior do criomolde, pois bolhas de ar invisíveis podem fazer com que a pele suba à superfície do criomolde. Comece fixando um criobloco congelado no estágio de um criostato com a orientação do folículo piloso, conforme indicado no criomold ao longo do plano de secção.
O ajuste adequado da orientação exata do folículo piloso no criostato é fundamental, uma vez que esta etapa determina o plano de corte que gera fatias de pele com todo o comprimento dos folículos pilosos intactos. Use o criostato para cortar uma seção de 100 mícrons. Segure a OCT ao redor do pedaço de pele embutido com uma pinça e transfira a seção do criostato para a cultura de 100 milímetros preenchida com PBS.
À temperatura ambiente, o PBS dissolverá a OCT, deixando fatias de pele fáceis de manusear com fórceps. Após o seccionamento, use uma pinça para transferir as seções de pele flutuante para o poço de uma placa de 12 poços contendo 2,5 mililitros de PBS. Comece a marcação imunofluorescente adicionando primeiro 500 microlitros de tampão PB aos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro marcados.
Use cuidadosamente uma pinça para transferir as fatias de pele da placa de 12 poços para os tubos para bloqueio. Certifique-se de que todas as fatias de pele estejam totalmente submersas. Coloque os tubos da microcentrífuga em um balancim de serra a 10 oscilações por minuto ou menos, por uma hora em temperatura ambiente.
Rotule tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro separados para cada fatia de pele e adicione 500 microlitros de tampão PB contendo a quantidade apropriada de anticorpo primário. Após uma hora de bloqueio, transfira as fatias de pele para os tubos recém-preparados contendo os anticorpos. Incube as fatias a quatro graus Celsius durante a noite em baixa velocidade em um balancim.
No dia seguinte, transfira as fatias para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de PBS e lave por uma hora em temperatura ambiente em um balancim. Em seguida, transfira as fatias para tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de tampão PB com a concentração apropriada de anticorpos secundários e DAPI. Incube em temperatura ambiente por uma hora com balanço, se desejado, as amostras podem ser armazenadas por até quatro dias a quatro graus Celsius até processamento posterior.
Antes da imagem, transfira as fatias de pele para tubos de microcentrífuga separados contendo 500 microlitros de PBS para lavar os anticorpos secundários e DAPI. Em seguida, coloque uma lamínula de 22 mililitros por 50 mililitros sobre um fundo escuro sob um microscópio de dissecação. Em seguida, use uma pipeta de 1.000 microlitros com a ponta da ponta cortada, para adicionar uma gota de glicerol a 100% na lamínula.
Transfira a fatia de pele do tubo de microcentrífuga para a gota de glicerol. Em seguida, enquanto olha pelo microscópio de dissecação, use uma pinça pontiaguda para desenrolar cuidadosamente as fatias de pele que estão enroladas, persuadindo-as a voltar à sua forma natural enquanto flutuam em glicerol. Não force o endireitamento não natural da fatia, pois isso pode causar danos ao tecido.
Uma vez que todo o comprimento da seção esteja devidamente orientado e achatado na lamínula. Monte o tecido em uma lâmina de microscópio comum, esta etapa irá endireitar ainda mais a fatia da pele. Imagem das seções de pele montadas em glicerol nos próximos dois dias.
Esta imagem mostra uma seção criogênica de pele obtida classicamente com 10 mícrons de espessura marcada com integrina alfa seis e integrina alfa oito, para visualizar o compartimento epidérmico e os músculos pili direcionários, respectivamente. Esta seção transversal de tecido 3D de 100 mícrons de espessura foi rotulada da mesma maneira. A imagem mostrada é a projeção máxima de uma pilha z grande.
Os detalhes de ambas as imagens são comparados lado a lado aqui, nas seções congeladas clássicas, a maioria dos folículos pilosos visualizados com integrina alfa seis não foram seccionados ao longo de todo o comprimento, gerando folículos pilosos predominantemente incompletos por seção, em comparação com montagens inteiras horizontais. Os folículos pilosos intactos e os músculos eretores do pelo intactos foram quantificados nas seções de montagem doméstica clássica e horizontal. Uma seção para replicação biológica foi quantificada, como visto aqui, toda a seção de montagem tem uma proporção maior de folículos intactos e músculos eretores do pêlo.
Uma vez dominada, esta técnica de crioseccionamento pode ser realizada a velocidades de mais de 15 seções por minuto, ao mesmo tempo em que obtém amostras perfeitamente orientadas se a montagem for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como processar e analisar seções transversais de tecido espesso em um ambiente tridimensional.
Visão Geral
Este trabalho apresenta um novo protocolo de processamento e imagem para análise de seções transversais de tecido tridimensional espesso que permite a exploração completa de modalidades de imagem confocal. Este protocolo preserva a antigenicidade e representa um sistema robusto para analisar a histologia da pele e potencialmente outros tipos de tecido.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Histologia
- Técnicas de Imagem
- Microscopia Confocal
Fundo
- As técnicas histológicas padrão podem não preservar a integridade estrutural dos tecidos.
- A imagem confocal permite uma análise tridimensional detalhada.
- Protocolos robustos são necessários para uma análise eficaz dos tecidos.
- Este estudo concentra-se no tecido da pele como modelo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo que mantenha a antigenicidade e a integridade estrutural da pele.
- Facilitar a análise da arquitetura tecidual tridimensional complexa.
- Melhorar as técnicas histológicas existentes.
Métodos Utilizados
- Cortar e fixar amostras de pele de camundongos.
- Usar um criostato para secionar o tecido em fatias de 100 mícrons.
- Marcação imunofluorescente com anticorpos primários e secundários.
- Imagem das seções teciduais usando microscopia confocal.
Principais Resultados
- O novo protocolo permite a visualização intacta dos folículos capilares e músculos arrectores dos pelos.
- Seções de montagem total mostram uma proporção maior de estruturas intactas em comparação com seções clássicas.
- A técnica pode ser realizada rapidamente, atingindo mais de 15 seções por minuto.
- Demonstra a eficácia da análise tridimensional em histologia.
Conclusões
- Este protocolo é um avanço significativo no processamento de tecido para imagem confocal.
- Ele melhora a capacidade de estudar estruturas teciduais complexas.
- As futuras aplicações podem se estender além da pele para outros tipos de tecido.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Robust three-dimensional tissue imaging is critical for accurate target validation and mechanistic de-risking in early-stage dermatological and tissue biology research. The horizontal whole mount protocol enables high-fidelity visualization of intact skin microarchitecture, supporting predictive confidence in phenotypic and cellular analyses. This capability strengthens translational continuity from discovery through preclinical model development in skin and potentially other tissue systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular and structural targets within preserved three-dimensional tissue architecture.
- Supports biological de-risking by maintaining antigenicity and structural integrity for functional target validation.
- Improves predictive confidence in the assessment of mesenchymal and epithelial cell populations.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated thick tissue sections for downstream immunofluorescence and confocal imaging workflows.
- Enhances assay reproducibility and standardization by preserving intact tissue structures across samples.
- Provides quantitative outputs for intact hair follicles and arrector pili muscles, enabling reliable comparative analyses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant tissue models by preserving complex skin microenvironments for translational biomarker studies.
- Supports continuity from discovery imaging to preclinical validation of tissue-based endpoints.
- Reduces risk of artifactual findings by maintaining native tissue context in thick sections.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling high-content imaging and quantitative analysis of tissue architecture for target validation and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling visualization of intact cellular structures.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs suitable for comparative studies and assay development.
- Analytics: Provides measurable endpoints such as intact follicle and muscle counts for statistical analysis.
- Translational Research: Maintains disease-relevant tissue context for biomarker alignment and preclinical model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol adaptable to various tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in tissue-based studies.
- Operational Value: Streamlines sample preparation, enhances reproducibility, and supports high-throughput sectioning.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, quantitative imaging data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on high-quality tissue analysis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning and immunofluorescent labeling for optimal results.
- Demands access to confocal microscopy and compatible analytical infrastructure.
- Benefits from cross-team standardization of sectioning and imaging protocols.
- Adaptable to other tissues with similar structural and antigenic preservation needs.
- Section thickness and orientation must be carefully controlled to ensure data consistency.
