Name: Contagem de proteínas em células únicas com gotículas endereçável Microarrays (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Aprenda a quantificar proteínas em células únicas usando microarranjos de gotículas endereçáveis (ADMs). Este método revela a heterogeneidade da expressão proteica em linhagens de células cancerígenas humanas.

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ASR projetado experimentos, desenvolveu protocolos e analisados dados. SC e PS realizaram experimentos de tamanho de célula. ASR e OC escreveram o manuscrito. Os autores desejam reconhecer com gratidão o apoio do Prof David R. Klug para fornecer acesso a equipamentos. Os autores desejam agradecer a faculdade Imperial de Hackspace avançada para acesso às instalações de prototipagem e fabricação.

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Endereçáveis da gota de Microarrays são um método sensível e extensível para determinar quantitativamente o número absoluto de cópia da proteína dentro de uma única célula.
Limitar o nível de ligação não-específica (NSB) é fundamental no âmbito do protocolo para alcançar tão baixo limite de detecção como possível. Proteínas e outras espécies bioquímicas não especìfica podem ligar para um número de interfaces presentes dentro das gotas — a superfície de lamela, o anticorpo local e interface óle...

O objetivo desse método é determinar a variação em abundância de uma proteína do alvo em uma população celular com resolução de célula única. Análise única célula fornece uma série de benefícios que não estão disponíveis com métodos bioquímicos tradicionais ensemble. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 em primeiro lugar, trabalhando no nível da célula única pode capturar a heterogeneidade rica de uma população de células que seria perdida caso contrário calculando a média do que ocorre com técnicas bioquímicas ensemble tradicional. A maioria dos métodos bioquímicos de cavalo de trabalho funciona com a maior parte, exigindo, como muitas vezes, milhões de células para produzir um resultado. Claro, as consequências da avaliação das populações de célula inteira depende de uma série de fatores, por exemplo, a heterogeneidade na expressão da proteína, onde algumas características importantes da distribuição de abundância de proteína podem ser perdidas. Do ponto de vista prática, a sensibilidade necessária de técnicas única célula torná-los capazes de trabalhar com quantidades de material biológico que é insuficiente para nem as técnicas em massa mais sensíveis funcionar. Um exemplo chave é o estudo dos tipos de células raras como circulantes de células de tumor (CTC) onde menos de 10 CTC pode estar presentes no sangue único 7,5 mL desenhar mesmo para pacientes com uma perspectiva de prognóstico pobre. 6 aqui apresentamos a metodologia necessária para realizar as medições de proteína de célula única usando um volume reduzido, ensaio baseado em anticorpos empregando gotículas de óleo-tampado impresso em um microarray do anticorpo.
Plataformas de gotículas microfluídicos são alto throughput, capaz de gerar milhares de gotas por segundo e capaz de isolar e até mesmo cultivo, células únicas em gotículas individuais para executar uma ampla gama de ensaios bioquímicos. Técnicas baseadas em gotículas são adequadas para a análise da única célula,7,8,9 com notáveis exemplos recentes incluindo DropSeq10 e inDrop11, que tem sido grandemente ajudado pelo poder de técnicas de amplificação. A quantidade limitada de material e não métodos de amplificação para proteínas tornam única célula proteomics especialmente desafiador.
As gotas podem ser analisadas por um número de métodos e microscopia de fluorescência tem sido amplamente utilizada. Técnicas de molécula como a microscopia de fluorescência (TIRF) de reflexão interna total permite moléculas fluorescentes ser visualizado com incomparável relação sinal-ruído. 12 devido ao decaimento exponencial do campo evanescente, apenas fluorophores alta próximo à superfície (ordem de 100nm) são excitadas fazendo TIRF uma boa estratégia na detecção de pequenas quantidades de uma molécula-alvo em uma mistura complexa. A força de corte óptica inerente de TIRF também ajuda a evitar as etapas de lavagem e ensaio de limites de tempo e complexidade. No entanto, TIRF requer superfícies planas e exemplos de microscopia TIRF aplicado em gotículas no fluxo envolvem a formação de uma superfície plana, de que a imagem. 13 para este fim, técnicas de proteomic única célula frequentemente projetar chips microfluídicos em torno de agentes de superfície-imobilizado captura em um formato de microarray. 4 , 14
As gotas, eles mesmos, podem ser formadas em matrizes em superfícies planas, chamados gotículas microarrays. 15 , 16 , 17 organizar espacialmente gotículas em matrizes permite-lhes ser convenientemente indexados, facilmente monitorados ao longo do tempo, individualmente abordados e, se necessário, obtida. Microarrays da gota pode alcançar uma elevada densidade de microreatores com milhares de elementos por chip que são free-standing ou suportadas por estruturas de microplacas. 18 , 19 , 20 eles podem ser formados pela deposição sequencial por robôs de manipulação de líquidos, observadores de jato de tinta, entre em contato com microarrayers21,22,23,24,25, 26 , ou eles podem montar auto em superfícies como superhydrophillic pontos estampados em uma superfície de superhydrophobic. 27 , 28 , 29
Com estas considerações em mente, endereçável Droplet Microarrays (ADMs) foram projetados para combinar a versatilidade, capacidade de endereçamento espacial e volumes reduzidos de microarrays da gota com a sensibilidade de microscopia TIRF única molécula para quantitativamente medir a abundância de proteínas. 5 ADMs permitem análise única célula formando um microarray de gotículas contendo células únicas sobre um microarray do anticorpo, que é então coberto com óleo para evitar a evaporação. Os volumes das gotas são discretos para evitar perda de amostra, que caso contrário seria alcançada em-microplaqueta válvulas em microfluídica de fluxo contínuo. 30 a quantidade absoluta de proteína do alvo de uma única célula é extremamente pequena; no entanto, o reduzido volume de gotas permite a concentração local relativamente alta a fim de que eles são detectados usando um sanduíche ensaio de anticorpo - anticorpo é imobilizada em uma região distinta, ou local, sobre uma superfície que capta a proteína, que por sua vez vincula para um anticorpo de detecção fluorescente etiquetado presente no volume da gota. Como uma rótulo abordagem livre (ou seja, proteínas alvos não precisa ser rotulado diretamente), ADMs são geralmente aplicável ao analisar células a partir de fontes primárias, tais como o sangue processado, bem preciso aspirados e biópsias de tumor dissociadas, bem como células de cultura e os lisados.
Medindo a variação em abundância de proteínas através de uma população celular é importante na determinação da heterogeneidade na resposta, por exemplo, para uma droga e vai ajudar no fornecimento de insight funções celulares e vias, avaliando subpopulações e seus comportamento, bem como identificar eventos raros que caso contrário poderia ser mascarados por métodos em massa. Este protocolo descreve como produzir e usar gota endereçável microarrays para determinar quantitativamente a abundância do fator de transcrição p53 em células cancerosas humanas e pode ser usado para investigar o papel de p53 em resposta a quimioterápicos. A proteína alvo é determinada pela escolha dos anticorpos de captura e deteção e pode ser modificada para incluir mais ou diferentes destinos. As instruções são fornecidas para construir um aparato simples, incorporando um bocal concêntrico de consumíveis de laboratório geral de matriz manualmente 10 gotas de nL tampadas com óleo. O processo completo experimental é descrito por meio de que cada gota é então carregada com uma única célula, que é então lysed e a expressão da proteína, determinada com resolução única molécula usando microscopia TIRF.

<table><tbody><tr><td><forte>Cultura de células</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM de alta glicose</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td>Frascos de cultura de células <td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>SIAL0639</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcontact Arrayer</td><td>DigiLab, Reino Unido</td><td>OmniGrid Micro</td><td></td></tr><tr><td>Micro pino</td><td>ArrayIt, Lamínulas USA</td><td>946MP2</td><td></td></tr><tr><td>(Nexterion)</td><td>Schott, Europa</td><td>1098523</td><td>Tamanho (mm): 65.0 x 25.0; Espessura (mm) 0.17</td></tr><tr><td>anticorpo de captura p53</td><td>Enzo</td><td>ADI-960-070</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo de detecção p53, Alexa Fluor 488 rotulado</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>concentração de estoque 200&mu; g / mL</td></tr><tr><td>Tampão de citrato de soro fisiológico</td><td>Gibco</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Betaína</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dodecil de sódio</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 384 poços (baixo volume)</td> <td>Sigma</td><td>CLS4511</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de gás nitrogênio</td><td>BOC</td><td>Grau industrial, livre</td><td></td> de oxigênio</tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Droplets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP2</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor Manual</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram Vario</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>Origio, Dinamarca</td><td>MBB-FP-L-0</td><td></td></tr><tr><td>Bombas de seringa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-210</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; Seringa L</td><td>Hamilton</td><td>81020</td><td>Estanque a gás, PTFE Luer lock</td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>Hamilton</td><td>81327</td><td>Estanque a gás, PTFE Luer lock</td></tr><tr><td>Isolador de silicone</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A-0.5</td><td>Isolador de silicone de 6x4 poços com adesivo</td></tr><tr><td>Cortador a laser</td><td>VersaLASE</td><td>VLS2.30 CO2 Laser 3W</td><td>para corte a laser de isoladores personalizados</td></tr><tr><td>Folha</td> <td>de acrílico de 1 mm de espessuraWeatherall-UK</td><td>Clarex Precision Sheet 001</td><td>para corte a laser de isoladores personalizados</td></tr><tr><td>Folha adesiva</td><td>3M</td><td></td><td>usada para aderir isoladores personalizados a lamínulas microdispostas</td></tr><tr><td>Super cola</td><td>Loctite</td><td>LOCPFG3T</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu; m ID/360 &mu; tubo de sílica fundida m OD</td><td>IDEX</td><td>FS-115</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/1/16" Tubulação OD PFA</td><td>IDEX</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>0.014" Identificação / 0,062 " Tubulação de PTFE OD</td><td>Kinesis</td><td>008T16-100</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/2,0 mm OD FEP tubulação</td><td>IDEX</td><td>1673</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Água ultrapura</td><td>Millipore, Alemanha</td><td>MilliQ</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td> Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Microscopia & Microscópio óptico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF com platina XY codificada</td><td>Nikon, Japão</td><td>Nikon Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Andor Technologies, Irlanda</td><td>IXON DU-897E</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de excitação a laser</td><td>Vortran, EUA</td><td>Stradus 488-50</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de laser de lise óptica</td><td>Continuum, EUA</td><td>Microscópio Surelite SLI-10</td><td></td></tr><tr><td> cubo de filtro para TIRF</td><td>Chroma, EUA</td><td>z488bp</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro de microscópio para laser de lise óptica</td><td>2000, Reino Unido</td><td>LPD01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Open Source</td><td></td><td>Software de análise de imagem</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>versão 7.14 ou superior</td><td>Software de análise de imagem</td></tr></tbody></table>

contagem de proteínas em células únicas com gotículas endereçável microarrays

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Muitas vezes celular comportamento e respostas celulares são analisadas a nível de população onde as respostas de muitas células são agrupadas como um resultado médio, mascarando o comportamento de ricos única célula dentro de uma população de complexo. Tecnologias de deteção e quantificação de proteínas de célula única têm feito um impacto notável nos últimos anos. Aqui nós descrevemos uma plataforma de análise de prático e flexível única célula baseada em microarrays endereçável da gota. Este estudo descreve como o número de cópias absoluta de proteínas do alvo pode ser medido com resolução de célula única. O tumor supressor p53 é o gene mais comumente mutado em câncer humano, com mais de 50% dos casos de câncer total, exibindo um padrão de expressão de p53 não-saudável. O protocolo descreve as etapas para criar 10 gotas de nL, dentro do qual as células de câncer humano único são isoladas e o número de cópia da proteína p53 é medido com resolução única molécula determinar com precisão a variabilidade na expressão. O método pode ser aplicado a qualquer tipo de célula incluindo material primário para determinar o número de cópia absoluta de qualquer proteínas alvo de interesse.

O número de cópia absoluta proteína basal de p53 foi determinado com resolução única célula em uma linhagem de células de câncer de cólon humano, células BE. Demonstramos como expressão de p53 pode variar ao longo de várias ordens de grandeza e mostrar uma correlação positiva fraca entre número de cópia tamanho e proteína celular dentro da população de célula BE descanso.
Endereçável Droplet Microarrays formam-se quando gotícula...

Aqui nós apresentamos gotículas endereçável microarrays (ADMs), um método de matriz com base gota capaz de determinar a abundância absoluta de proteínas em células únicas. Podemos demonstrar a capacidade de ADMs caracterizam a heterogeneidade na expressão do tumor supressor p53 de proteína em uma linhagem de células cancerosas humanas.

Contagem de proteínas em células únicas com gotículas endereçável Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

O objetivo geral deste experimento é determinar o número absoluto de cópias de uma proteína-alvo com resolução em nível de célula única. Técnicas de célula única permitirão uma melhor compreensão do comportamento de uma proteína em relação ao dogma central e contribuirão para a quantificação precisa da expressão gênica regulada. Trabalhar no nível de célula única pode capturar a rica heterogeneidade da população celular, que de outra forma seria perdida devido à média resultante das técnicas bioquímicas tradicionais.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido à sensibilidade dos ensaios de única célula ou à quantidade limitada de proteína em cada célula. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando desejávamos realizar um ensaio de proteína em única célula que pudesse ser facilmente amostrado para análises posteriores. Inicie este procedimento fabricando chips e imprimindo microarranjos de anticorpos conforme descrito no protocolo textual.Para preparar o aparelho, insira um segmento de 100 milímetros de comprimento de tubo de sílica fundida com diâmetro interno de 150 mícrons e diâmetro externo de 360 mícrons em um segmento de 40 milímetros de comprimento de tubo PFA com diâmetro interno de 1 milímetro e diâmetro externo de 1/16 de polegada, até que protruda dois milímetros. Isso formará o bico concêntrico. Aplique uma fina camada de cola de cianoacrilato na extremidade de uma ponteira de pipeta de 10 microlitros e insira-a no segmento de 40 milímetros de tubo PFA.Se necessário, reposicione o tubo de sílica fundida para manter uma saliência de 2 milímetros na ponteira antes que o adesivo endureça. Insira a outra extremidade do capilar de sílica fundida na extremidade de um tubo de PTFE com 200 milímetros de comprimento e diâmetro interno de 014 polegadas e diâmetro externo de 062 polegadas. Conecte-o a uma seringa Hamilton de 100 microlitros preenchida com quatro por cento de albumina sérica bovina em solução salina tamponada com fosfato.Em seguida, insira um trecho de 400 milímetros de comprimento de tubo FEP com diâmetro interno de 1 milímetro e diâmetro externo de 2 milímetros em uma ponteira de pipeta de 200 microlitros até formar um selo. Aplique uma fina camada de cola de cianoacrilato em outra ponteira de pipeta de 200 microlitros, então empurre esta ponteira dentro da primeira para fixar o tubo no lugar. Em seguida, conecte a extremidade aberta do tubo FEP a uma seringa Hamilton de 1 mililitro preenchida com óleo mineral.Insira o conjunto da ponteira de pipeta de 200 microlitros na ponteira de pipeta de 10 microlitros do bico concêntrico. Em seguida, encha a seringa de 100 microlitros com solução bloqueadora de PBSA a 4 por cento. Reconecte e lave o tubo aquoso com a solução bloqueadora.Repita duas vezes, para um total de três lavagens. Em seguida, encha a seringa de 100 microlitros com anticorpo de detecção a 0,125 microgramas por litro em PBSA a 4% e reconecte o tubo. Substitua a solução bloqueadora no tubo dispensando 25 microlitros da solução de anticorpo de detecção.Enxágue o tubo de óleo com óleo mineral até que todo o tubo e o bico estejam cheios de óleo. Em seguida, reabasteça a seringa de 1 mililitro com óleo mineral e reconecte o tubo. Por fim, fixe o conjunto do tubo e do bico a um manipulador XYZ.Para formar gotículas endereçáveis, fixe o chip na platina do microscópio. Registre as coordenadas da platina do microscópio de cada ponto na matriz usando o software de controle automatizado do microscópio. Em seguida, configure o manipulador XYZ na platina do microscópio.Coloque as seringas em bombas de seringa separadas, pois elas precisarão ser operadas de forma independente. Posicione a ponteira em um ângulo de 50 a 60 graus. Em seguida, configure a bomba de seringa aquosa para dispensar 10 nanolitros a 100 microlitros por minuto e configure a bomba de seringa de óleo para dispersar 5 microlitros a 100 microlitros por minuto.Dispense a solução aquosa até que uma gota de fluido fique visível na extremidade do bico. Toque levemente a gota com um lenço livre de partículas para removê-la. Utilizando o software de controle automatizado do microscópio, defina as coordenadas da platina do microscópio para um ponto de anticorpo na matriz e foque na superfície da lamínula.Ao alinhar o bico, tenha cuidado para não perturbar o ponto de anticorpo. Tenha cuidado extra e certifique-se de observar a aproximação da ponta da pipeta de vidro por meio de um microscópio. Com cuidado para não perturbar o ponto, use o manipulador XYZ para alinhar a ponta da pipeta de vidro do bico concêntrico ao lado do ponto de anticorpo.Uma vez alinhado, dispense 10 nanolitros de solução aquosa. Sem mover as plataformas, dispense cinco microlitros de óleo para selar a solução aquosa. Levante lentamente o bico, afastando-o do gotículo, e mova-se para o próximo poço.Repita este passo para todas as manchas de anticorpos na matriz. Após 30 minutos, image todas as manchas na matriz utilizando o software de controle do microscópio automatizado para determinar o fundo de moléculas individuais ligadas a cada mancha de anticorpo antes do carregamento das células. Para carregar as gotas endereçáveis com células, suspendemos as células em uma solução de anticorpo de detecção a 0,125 microgramas por mililitro em meio L-15 com 10 por cento de FDS.Filtre a solução celular por meio de um estrangulador de células com malha de 40 micrômetros para garantir uma suspensão de células isoladas. Carregue as células isoladas nos microgotas endereçáveis a partir do reservatório de células utilizando o micromanipulador e a microcapilar. Observando por meio de uma objetiva de 10x, use o microinjetor para aspirar uma única célula para dentro da microcapilar a partir do reservatório de células.Trabalhando manualmente com um joystick, despeje automaticamente utilizando a função de ejeção do estágio do manipulador eletrônico. Rejeite a micropipeta movendo-a para cima, superando a altura de 1 milímetro do chip. Defina as coordenadas do estágio para as de uma gota endereçável usando o software de controle automatizado do microscópio.Injete a micropipeta retornando-a à posição Z armazenada. Realize este procedimento manualmente com o joystick ou automaticamente, se estiver usando um estágio com manipulador eletrônico. Os processos mecânicos decorrentes da lise induzida por laser podem criar uma emulsão na borda da gota, que energias de pulso mais altas podem interromper completamente.Garanta que as energias dos pulsos de lise sejam mantidas no mínimo necessário e que as células não sejam depositadas exatamente na borda das gotículas. Dispense as células na gotícula endereçável utilizando o microinjetor. Imagem as células nas gotículas usando microscopia de campo claro, incluindo qualquer imagem de fluorescência.Também realize imagens de todas as manchas na matriz utilizando microscopia TIRF de molécula única. Foque na célula em uma gota endereçável. Obtenha lise óptica completa ao focalizar um único pulso a laser de 6 nanossegundos próximo à localização da célula.Observe o horário em que cada célula é lisada. Adquira imagens de moléculas individuais usando microscopia TIRF de todos os pontos a cada dez minutos durante os primeiros 30 minutos, depois a cada 20 minutos por mais 60 minutos. Se estiver interessado apenas na quantidade de proteína ligada no equilíbrio, capture imagens de todos os pontos após incubar o chip por 90 minutos à temperatura ambiente.Para realizar a contagem de moléculas individuais em qualquer ponto de anticorpo não congestionado, carregue a imagem de fundo adquirida antes da lise. No Fiji, selecione a imagem de fundo. No menu imagem, selecione duplicar para copiar a imagem de fundo.Em seguida, selecione a imagem duplicada e, na guia processar filtros, escolha desfoque gaussiano e especifique um raio de 50 pixels. Navegue até processar e selecione calculadora de imagens. Lá, especifique a operação divisão, as imagens necessárias e, em seguida, marque as opções criar nova janela e resultado de 32 bits.Subtraia um de cada pixel da imagem. Em seguida, selecione uma área de 50 pixels por 50 pixels em qualquer um dos quatro cantos da imagem plana de fundo. Meça o desvio padrão da intensidade dos pixels selecionando analisar e medir.Em ajuste de imagem, selecione limiar e defina o nível de limiar inferior como três desvios padrão. Na máscara de imagem segmentada SM, defina os valores de intensidade dos pixels como zero para quaisquer objetos que não tenham um tamanho entre quatro e nove pixels quadrados e uma circularidade entre 0,5 e 1. Para isso, selecione analisar seguido de analisar partículas e especifique o tamanho e a circularidade.Para os mesmos pontos de anticorpo, carregue e repita as etapas de análise de dados para todos os quadros de imagem capturados como uma série temporal obtida após a lise. Em resultados representativos de imagens de molécula única, o sinal nas imagens de fundo mostra o baixo nível de ligação inespecífica do anticorpo de detecção marcado com fluoróforo à superfície e ao ponto de anticorpo. A imagem ampliada em destaque mostra moléculas individuais destacadas com setas vermelhas.Também é mostrada uma imagem típica de um retaguarda de p53 em células de carcinoma de cólon humano BE. Esta sequência de imagens mostra o acúmulo da proteína p53 no ponto do anticorpo. Uma curva de calibração obtida com concentrações conhecidas da proteína recombinante é usada para converter as contagens de moléculas individuais em cada ponto no número de proteínas-alvo no volume de análise e sugere o número de cópias em nível de célula única.A linha vermelha tracejada horizontal indica o nível de ligação inespecífica. A expressão proteica basal de p53 em células cancerígenas de BE mostra uma distribuição alongada semelhante à gama, na qual a expressão da proteína p53 em algumas células é significativamente maior do que o valor modal. Aqui, a expressão da proteína p53 é representada como uma função do volume celular, calculado a partir do diâmetro celular medido antes da lise.Os resultados indicam que uma concentração mínima da proteína p53 é mantida nessas células. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a abundância de uma proteína-alvo com resolução em nível de célula única. Ao trabalhar com células biológicas, é importante lembrar que as proteínas podem se degradar.Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em até quatro horas se realizada corretamente, e pode ser incorporada a protocolos que analisam amostras primárias de pacientes. Técnicas de célula única podem ajudar a fornecer informações sobre a função e o comportamento celular, além de identificar eventos raros que de outra forma seriam perdidos por ambos os métodos. Embora este método possa fornecer insights sobre a biologia de linhagens celulares de p53 e câncer de mama, ele também pode ser aplicado a outros estudos de doenças sem a necessidade de marcação, o que é benéfico ao estudar células primárias provenientes de amostras de pacientes.Após este procedimento, outros métodos como a PCR com pontos quânticos podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como determinar se a expressão do RNA e da proteína alvo estão correlacionadas. A medição do número absoluto de cópias de uma proteína será atrativa para biomatemáticos e cientistas computacionais no apoio a seus modelos biológicos.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Gota plataformas baseadas microfluídicos são candidatos promissores para a experimentação de alto rendimento, uma vez que são capazes de gerar picolitros, auto-compartimentada vasos barata a taxas kHz. Através da integração com rápido, sensível e de alta resolução de fluorescência métodos espectroscópicos, a grande quantidade de informações geradas nesses sistemas podem ser eficientemente extraído, aproveitada e utilizada.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

Neste artigo apresentamos um chip microfluídico para análise única célula. Ele permite a quantificação de proteínas intracelulares, enzimas, co-factores, e os segundos mensageiros, por meio de ensaios fluorescentes ou imunoensaios.

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

Descrevemos um ensaio digital de ponto final para quantificar ácidos nucléicos com uma leitura simplificada (analógica). Medimos a fluorescência em massa de ensaios digitais baseados em gotículas usando uma máquina de qPCR padrão em vez de instrumentação especializada e confirmamos nossos resultados por microscopia.

Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

Este protocolo descreve o fabrico de uma grande escala, o ADN ou o anticorpo matriz bidimensional multiplexado, com aplicações potenciais em estudos de sinalização de células e detecção de biomarcador.

Flow-padrão Fabrication guiada de alta densidade Barcode Antibody Microarray

Um método sensível e preciso para quantificação de microRNAs livres de células usando uma química baseada em corante e tecnologia de PCR digital de gotículas é descrito.

Circulando MicroRNA Quantificação Usando DNA de ligação Dye Química e Gota Digital PCR

Vamos demonstrar uma tecnologia de chip de snap para a realização de imunoensaios sanduíche multiplexado cross-reactivity-livre simplesmente estalar dois slides. Um aparelho de pressão é usado para transferência fiável de reagentes de microarray-para-microarray. O chip de pressão pode ser usado para qualquer reações bioquímicas que exigem colocalization de diferentes reagentes sem contaminação.

Snap o Chip para imunoensaios livre de Cross-reactivity e Spotter sanduíche multiplexado

Este protocolo descreve os processos gerais e controle de qualidade verifica necessário para a preparação de células simples mamíferos adultas saudáveis para preparações de RNA-Seq de célula única baseada em gotículas, alta taxa de transferência. Parâmetros de sequenciamento, alinhamento de leitura e análise de bioinformatic a jusante de célula única também são fornecidos.

Transcriptomics de célula única baseada em código de barras da gota de tecidos de mamíferos adultos

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a homogeneidade de rotulagem para cada espécie de proteína em uma amostra de proteína complexa a nível da molécula.

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

O objetivo geral do protocolo é preparar mais de um milhão de gotículas femtoliter ordenadas, uniformes, estáveis e biocompatíveis em um substrato planar de 1 cm2 que pode ser usado para síntese proteica sem células.

Uma matriz de gotícula femtoliter para síntese de proteínas massivamente paralelas de moléculas de DNA único

Aqui apresentamos um protocolo para medir o número absoluto de cópias mitocondriais (mt)DNA e os níveis de heteroplasmia de deleção do mtDNA em células únicas.

Medindo o Número de Cópias de DNA Mitocondrial de Célula Única e a Heteroplasmia Usando a Reação em Cadeia da Polimerase de Gotículas Digitais

Este método quantifica a abundância microbiana usando um formato de placa de 96 poços para unidades formadoras de colônias de placas (UFCs) e é aplicado ao microbioma Drosophila em amostras inteiras de homogeneização de moscas. As CFUs são contadas com um software automatizado de análise de imagens fornecido aqui.

Contagem rápida de unidades formadoras de colônias em formato de placa de 96 poços aplicada ao microbioma de Drosophila

Aprenda a quantificar proteínas em células únicas usando microarranjos de gotículas endereçáveis (ADMs). Este método revela a heterogeneidade da expressão proteica em linhagens de células cancerígenas humanas.

Contagem de proteínas em células únicas com gotículas endereçável Microarrays

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