Name: Criopreservação de Zebrafish espermatogónias por toda agulha testículos imersos refrigeração ultra rápida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Aprenda a vitrificação por imersão em agulha de testículos inteiros de zebrafish para criopreservação de espermatogônias. Este método validado em cinco linhagens simplifica o isolamento de células germinativas.

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Este estudo foi suportado pelo nacionais de investigação, desenvolvimento e inovação escritório da Hungria (grant 116912 ÁH), o escritório de custo (alimentação e agricultura custo ação FA1205: AQUAGAMETE), o programa de bolsas do Hungaricum (grant para ZM) e o novo Húngara nacional excelência Predoctoral Fellowship (grant Para EK).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela lei húngara de bem-estar Animal.
1. preparação do reagente
<ol><li>Soluções conservadas em estoque<ol>
<li>Prepare 1 M trealose adicionando 0,378 g de trealose di-hidratado em 1 mL de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente.</li>
		<li>Prepare-se 1 M de sacarose adicionando 0,342 g de sacarose em 1 mL de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente.</li>
		<li>Prepare 1 M HEPES adicionando 0,238 g de HEPES a 1 mL de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente.</li>
		<li>Prepare a colagenase 20 mg/mL (290 U/mg) pela adição de 100 mg para 5 mL de PBS. Misture bem até que se dissolva. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota de 50 μL em 0,2 mL PCR tubos e congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparar a tripsina de 15 mg/mL (~ 10000 U/mg) adicionando-se 75 mg a 5 mL de PBS. Misture bem até que se dissolva. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota de 50 μL em 0,2 mL PCR tubos e congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Prepare-se 1 mg/mL DNase eu (~ 3000 U/mg) pela adição de 5 mg a 5 mL de PBS. Misture bem até que se dissolva. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota de 50 μL em 0,2 mL PCR tubos e congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Prepare-se 0,4% trypan azul adicionando-se 40 mg de azul de Tripan a 10 mL de PBS. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota 1 mL em tubos de 1,5 mL.</li>
		<li>Preparar a 200 mg/L de MS-222 (sulfonato de metano tricaina) adicionando-se 200 mg de MS-222 em 1 L de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente. Além disso, o MS-222 tampão com bicarbonato de sódio para um pH neutro de 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluções para vitrificação<ol>
<li>Preparar a solução de equilíbrio (ES): preparar 2 mL de ES misturando 121.5 µ l de metanol (MeOH; 1,5 M), 220 µ l de propilenoglicol (PG; 1,5 M), 200 µ l de FBS (10%), 200 µ l da solução estoque de trealose (0,1 M), 50 µ l de solução-mãe de HEPES (25 mM) e 1208.5 µ l de L-15 em um 2 tubo mL.</li>
		<li>Preparar a solução de vitrificação (VS): preparar 2 mL de VS misturando 439 µ l de PG (3 M), 426 µ l de dimetil sulfóxido (Me2então; 3 M), 200 µ l de FBS (10%), 200 µ l de solução-mãe de trealose (0,1 M), 50 µ l de HEPES estoque solução (25 mM) e 685 µ l de L-15 em um tubo de 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluções para o aquecimento<ol>
<li>Preparar a solução de aquecimento 1 (WS1): preparar 1,5 mL de WS1 em um tubo de 2 mL misturando 150 µ l de FBS (10%), 450 µ l de solução de sacarose (3M) e 900 µ l de L-15.</li>
		<li>Preparar a solução de aquecimento 2 (WS2): preparar 1,5 mL de WS2 em um tubo de 2 mL misturando 150 µ l de FBS (10%), 150 µ l de solução de sacarose (1 M) e 1200 µ l de L-15.</li>
		<li>Preparar a solução de aquecimento 3 (WS3): preparar 1,5 mL de WS2 em um tubo de 2 mL por mistura de 150 µ l FBS (10%) e 1350 µ l de L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar a solução de digestão: para cada amostra prepare 500 µ l da solução de digestão, misturando-se 50 µ l de solução colagenase (2 mg/mL), 50 µ l de solução tripsina (1,5 mg/mL), 10 µ l de DNase I (20 µ g/mL) e 390 µ l de L-15 em um 2 mL do tubo.</li>
	<li>Obter ferramentas de dissecação: tesoura, micro-tesouras, pinças, pinças curvas e agulhas de acupuntura.</li>
</ol>2. testículos coleção
<ol><li>Eutanásia o peixe, colocando-o em um prato contendo 200 mg/L de MS-222 (pH = 7). Antes de continuar com a dissecação, certifique-se que as brânquias têm parou de se mexer e pelo menos 10 min se passaram desde aquele momento para garantir a morte por hipóxia.</li>
	<li>Seque o peixe, acariciando-o em uma toalha de papel e coloque-o de lado dorsal em uma esteira de dissecação.<ol>
<li>Em primeiro lugar, corte as barbatanas peitorais e pélvicas para dissecação mais fácil.</li>
		<li>Horizontalmente, cortar a pele na barriga do peixe entre as barbatanas peitorais e cortar a pele e o músculo subjacente ao longo da barriga até a nadadeira anal.</li>
		<li>Abra a cavidade do corpo do peixe e fixar a parede corporal esquerda e direita para o tapete de dissecação com agulhas. Nota: Os testículos estão localizados acima os órgãos gastrointestinais em ambos os lados da natação bexiga (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para evitar contaminação, não retire os órgãos gastrointestinais, mas suavemente empurrá-los para um lado e retire o testículo do lado oposto. Os testículos estão ligados à parede do corpo então remova-os cuidadosamente e cortar o ligação peritônio por micro-tesouras.</li>
	<li>Além disso, a fim de evitar a contaminação, em primeiro lugar esterilizar os testículos colocando-os em etanol a 70% por 2 s e depois coloque-os em L-15 em uma placa de 96 poços no gelo. Nota: Se for necessário, testículos limpos de tecido adiposo e grandes vasos sanguíneos precisamente sob o microscópio estereoscópico</li>
</ol>3. ultrarápido arrefecimento do tecido Testicular
<ol><li>Agulhas de Mark com Etiquetas apropriadas, dependendo do exemplo digite e preparem a equilibração (ES) e soluções de vitrificação (VS).</li>
	<li>Transferi os testículos para uma placa bem maior ou prato e pino dois ou três testículos (ou mais dependendo do tamanho da agulha) em uma agulha estéril de acupuntura.<ol>
<li>Em primeiro lugar, posição do testículo no topo curvas pinças. Coloque a ponta da agulha no meio do testículo e puxe cuidadosamente o testículo para cima, com a pinça.</li>
		<li>Após a punção do testículo, gentilmente puxe-o para cima em direção ao topo da agulha. Certifica-se de que os testículos são separados uns dos outros e que não estão caindo ou deslizar para baixo.</li>
		<li>Lugar cheio de agulhas com testículos fixados em um tubo de 2 mL com L-15 até vitrificação (em 25 ˚ c; tempo de armazenamento não deve exceder 1 h). Nota: Condecorando os testículos a agulha deve ser feito rapidamente para evitar que os testículos de secar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir a agulha com testículos para a solução de equilíbrio e incubar durante 5 min à 25˚C.</li>
	<li>Transferir a agulha para a solução de vitrificação e incube por 30 s em 25˚C.</li>
	<li>Retire a agulha a partir da solução de vitrificação, rapidamente e suavemente absorver o restante da solução do tecido por uma toalha de papel estéril. Tome cuidado para evitar os testículos degola para a toalha de papel ou cair.</li>
	<li>Rapidamente Coloque a agulha no nitrogênio líquido, colocado em uma caixa de isopor. Nota: Fazer este passo rapidamente para evitar a exposição do tecido para o vapor de nitrogênio líquido. Use volumes baixos de nitrogênio líquido para evitar a contaminação das amostras.</li>
	<li>Manter a agulha em nitrogênio líquido em uma caixa de isopor fechada por 5-10 min.</li>
	<li>Precool um criotubo abriu 4,5 mL e sua tampa na mesma caixa.</li>
	<li>Após 5-10 min, transfira cada agulha em um separado criotubo sob a superfície do nitrogênio líquido e fechar o criotubo. Atenção: Sempre use roupas de proteção (como luvas isoladas) quando trabalhar com nitrogênio líquido como exposição pode levar a graves queimaduras.</li>
	<li>Coloque o criotubo com um bastão de metal e colocá-lo no recipiente do cryobank mais rápido possível. Armazenar as amostras em um armazenamento de cilindro dewar até utilização posterior.</li>
</ol>4. procedimento de aquecimento
<ol><li>Cada agulha quente separadamente. Todas as soluções de aquecimento devem ser a 25 ° C.</li>
	<li>Desanexe o criotubo da cana-de-metal e mergulhá-lo no nitrogênio líquido armazenado em uma caixa de isopor.</li>
	<li>Abra o criotubo no vapor de nitrogênio líquido (usando fórceps) e liberar a agulha para o nitrogênio líquido.</li>
	<li>Transferir a agulha muito rápido para a primeira solução de aquecimento e incubar durante 1 min (a 25 ° C). Certifique-se de transferir a agulha rapidamente para evitar o seu aquecimento no ar durante a transferência.</li>
	<li>Transferir a agulha para a segunda solução de aquecimento e incube por 3 min (a 25 ° C).</li>
	<li>Transferir a agulha para a terceira solução de aquecimento e incubar durante 5 min (a 25 ° C).</li>
	<li>Libere os testículos da agulha deslizando-as para baixo com uma pinça curvada. Lugar cada testículo aquecido individualmente em um poço separado (placa de 96 poços) repleto de 250 µ l de L-15 suplementado com 10% FBS. Certifique-se que os poços são rotulados de acordo com a amostra. Manter a placa bem no gelo até que todas as amostras são aquecidas e até trabalhos futuros.</li>
</ol>5. tecido digestão
<ol><li>Prepare-se para cada amostra em tubos separados 2 mL 500 µ l da solução de dissociação. Etiquete os tubos de acordo com o código da amostra. Incube a solução preparada de dissociação por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione o tecido aquecido para a solução de digestão e corte em pedaços pequenos pelo menos 30 movimentos de tesoura pequena.</li>
	<li>Incube o tecido cortado em uma placa de agitação durante 90 minutos a 25 ˚ c.</li>
	<li>Parar o processo de digestão, adicionando a 400 µ l de L-15 e 100 µ l de FBS (FBS 10% v/v). Brevemente, agitar a solução e incubar durante 1 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Filtre a solução obtida através de 50 µm de filtros em um tubo de 1,5 mL. Rotule os tubos em conformidade.</li>
	<li>Centrifugue a solução filtrada em 200 × g por 10 min a 25 ˚ c.</li>
	<li>Retire o sobrenadante cuidadosamente e resuspenda o pellet em 20 µ l de L15 suplementado com 10% FBS. Manualmente, agite o tubo até a pelota é completamente dissolvida. Manter a suspensão de células no gelo ou no 4 ˚ c até nova utilização.</li>
</ol>6. viabilidade avaliação e contagem de células
<ol><li>Mistura de 5 µ l de suspensão de células e 5 µ l de solução de azul de Tripan 0,4% em um tubo PCR apropriadamente rotulado 0,2 mL. Se forem usados diferentes volumes, certifique-se de que a razão de diluição de 1:1 permanece.</li>
	<li>Incube a esta suspensão para 1 a 3 min à temperatura ambiente (25 ° C).</li>
	<li>Verifica a viabilidade de cada amostra em um hemocytometer sob o microscópio.</li>
	<li>Conte o número de células vivas (inocente por trypan blue) em 15 campos. Calcule o número total de células em 20 µm da suspensão celular. A suspensão está agora pronta para qualquer aplicação a jusante. Nota: Ao otimizar o procedimento para as outras espécies com maior tamanho corporal, use fragmentos de testículo de peso igual. Use os testículos de um indivíduo para todos os grupos experimentais a fim de evitar a variabilidade individual nos resultados. No caso de zebrafish, tiramos proveito do fato de que esquerda e direito testículo deve conter um número igual (ou muito semelhante) de células germinativas13 (Ver os resultados do representante). O testículo esquerdo foi mantido como um controle enquanto o testículo direito foi vitrificados/aquecido. Porcentagem de viabilidade foi calculada o número de células isoladas de testículo vitrificados/aquecido em relação ao número de células isoladas de testículos frescos.</li>
</ol>

<ol><li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research%3A+Importance%2C+impact%2C+status%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li>
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<li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22CryoLetters%22%5BJournal%5D)">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li>
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<li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nati.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso ultra rápido refrigeração procedimento desenvolvido para espécies de mamíferos e aviária10,11,12 para a criopreservação do testículo de peixe (zebrafish como modelo organismo). A maioria dos estudos anteriores sobre criopreservação dos recursos genéticos de zebrafish concentraram-se principalmente na criopreservação de esperma de zebrafish2<...

Novas tendências na ciência e biotecnologia levaram à criação de milhares de novas linhas de mutantes de camundongos, drosófila, zebrafish e outras espécies utilizadas como organismos modelo em biomédicas e outras ciências1. Além disso, como novas tecnologias são desenvolvidas e se tornam disponíveis, os números das linhas mutantes constantemente aumentam2. Isto leva à necessidade para um armazenamento seguro dos recursos genéticos, além de práticas comuns de manter colônias de reprodução. Como um método que permite a armazenagem segura dos recursos genéticos por um período indefinido de tempo, criopreservação oferece muitas vantagens, tais como extensão da temporada reprodutiva, contorna a necessidade de manutenção contínua dos reprodutores, e é mais custo - e eficiência do trabalho2.
Protocolos de criopreservação de espermatozoides desenvolvidos durante os últimos vários anos2,3,4 oferecem a oportunidade para armazenamento bem sucedida do zebrafish material genético masculino. No entanto, criopreservação de ovos ou embriões de peixe ainda não é possível devido à sua estrutura complexa e grandes quantidades de material de gema. Recentemente, a prática do transplante de células germinativas primordiais (PGCs) ou células-tronco das espermatogónias (SSCs) oferece um desvio para essa barreira, desenvolvendo-se em ovos e esperma funcional após transplante5. Portanto, a criopreservação de SSCs oferece uma nova fronteira na conservação dos recursos genéticos raros e valiosos.
Apesar de criopreservação oferece muitas vantagens, o processo de congelação lenta-taxa gera várias condições que podem levar a célula danos2. Estes incluem a formação de gelo intracelular e extracelular, desidratação, toxicidade crioprotetoras e outros. Gelo intracelular danifica as células, gelo extracelular pode levar ao esmagamento mecânico das células, enquanto a difusão de água das células durante a lenta taxa de congelamento pode levar a desidratação6. Recentemente, foi aplicada na criopreservação de gâmetas de peixe a7,8,9vitrificação como uma técnica que previne os efeitos negativos da formação de gelo. Apresenta uma técnica de resfriamento ultra rápida através do qual os meios de comunicação internos e externos se transformar em um estado amorfo/vítreo sem reveladores em gelo7,10. Bem sucedida vitrificação de tecido ovariano e testicular tem sido evidenciada na espécie aviária e mamíferos10,11,12, abrindo assim as possibilidades de sua aplicação em peixes, também.
Neste estudo, apresentamos o processo de vitrificação (NVI) agulha imergido para a criopreservação de testículos de zebrafish toda. Vamos demonstrar um método confiável para o isolamento do zebrafish estágio inicial de pilhas de germe sem contaminação e um processo de criopreservação que produz relativamente grandes quantidades de células germinativas de fase inicial com uma baixa presença de outras células, especialmente de espermatozoides. O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a demonstrar um protocolo detalhado visualizado para refrigeração ultra rápida de tecido gonadal de peixe e as células da linha germinal do zebrafish. Além disso, a repetibilidade do método é demonstrada no cinco estirpes diferentes zebrafish: AB tipo selvagem, casper (roy- / -; nácar- / -), leopardo (leo,t1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linha de transgénicos Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].

<table><tbody><tr><td>Meios de Leibovitz (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>suplementado com L-glutamina</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine metanossulfonato (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trealose</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Dihydrate</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Propilenoglicol</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Reanal</td><td></td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Comprimidos para preparação de 200 ml de solução PBS</td></tr></tbody></table>

criopreservação de zebrafish espermatogónias por toda agulha testículos imersos refrigeração ultra rápida

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

As tendências atuais na ciência e biotecnologia levam à criação de milhares de novas linhas em organismos-modelo, assim, levando à necessidade de novos métodos para o armazenamento seguro dos recursos genéticos, além de práticas comuns de manter colônias de reprodução. O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Criopreservação de células germinativas de fase inicial pelos testículos todo NIV oferece possibilidades para o armazenamento de zebrafish recursos genéticos, especialmente desde que após transplante eles podem amadurecer em gâmetas masculinas e femininas. Os testículos foram extirpados, preso em uma agulha de acupuntura, incubada em dois meios de cryoprotective (solução de equilibração contendo metanol de 1,5 M e 1,5 M propilenoglicol; e solução de vitrificação contendo o sulfoxide dimethyl 3M e 3M propileno glicol) e caiu em nitrogênio líquido. Amostras foram aquecidas em uma série de três soluções de aquecimento consequentes. As principais vantagens desta técnica são (1) a falta de espermatozoides após a digestão dos testículos aquecidos, facilitando assim a jusante manipulações; (2) ultra rápido resfriamento permitindo a exposição ideal dos tecidos ao nitrogênio líquido, portanto, maximizando o resfriamento e reduzindo a concentração necessária de crioprotectores, reduzindo assim a sua toxicidade; (3) síncrona exposição dos testículos vários crioprotectores e nitrogênio líquido; e (4) repetibilidade demonstrado pela obtenção de viabilidade de acima de 50% em cinco estirpes diferentes do zebrafish.

Em média, o número de células germinativas de fase inicial isolado de um testículo único zebrafish fresca variou entre 40.000 e 200.000 células dependendo do tamanho do peixe. Quando digerindo testículos zebrafish fresco em todas as 5 estirpes, células germinativas-início não eram as única células presentes nas suspensões celulares (Figura 2). Ao lado as células germinativas de estágio inicial, numerosos espermatozoides foram encontrados também. Por outro lad...

O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Além disso, a repetibilidade do método em cinco estirpes diferentes zebrafish foi testada.

Criopreservação de Zebrafish espermatogónias por toda agulha testículos imersos refrigeração ultra rápida

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

A criopreservação oferece a possibilidade de manter células e tecidos vivos em baixas temperaturas por um período infinito de tempo, pelo menos em termos humanos. A vitrificação é uma forma de criopreservação que envolve um resfriamento ultrarrápido até um estado vítreo e amorfo, sem a formação de gelo cristalino e sem os danos associados. Neste vídeo, apresentamos o protocolo para a vitrificação de testículos inteiros de peixe-zebra, o que permite seu armazenamento seguro até seu uso posterior como fonte de células germinativas para transplante em receptores adequados.O protocolo de vitrificação atual apresenta uma vantagem significativa em comparação com os protocolos de congelamento lento no que diz respeito às manipulações de células germinativas. E essa vantagem é que, após a vitrificação e o aquecimento, os espermatozoides morrem e são eliminados, de modo que não permanecem na suspensão celular. Assim, não há necessidade de isolamento das células germinativas após o aquecimento.E isso facilita prontamente as manipulações posteriores. Eutanasiar o peixe colocando-o em uma placa contendo 200 miligramas por litro de MS-222 em pH 7. Antes de prosseguir com a dissecação, certifique-se de que as brânquias tenham parado de se mover e de que pelo menos 10 minutos tenham se passado desde aquele momento para garantir a morte por hipóxia.Seque o peixe batendo-o com um papel toalha e coloque-o sobre o lado dorsal em um suporte para dissecação. Primeiramente, corte as nadadeiras pélvicas e peitorais para facilitar a dissecação. Corte horizontalmente a pele no ventre do peixe entre as nadadeiras peitorais e, em seguida, corte a pele e o músculo subjacente ao longo do ventre até a nadadeira anal.Abra a cavidade corporal do peixe e fixe as paredes laterais esquerda e direita no tabuleiro de dissecação com agulhas. Os testículos estão localizados acima dos órgãos gastrointestinais, em ambos os lados da bexiga natatória. Para evitar contaminação, não remova os órgãos gastrointestinais; em vez disso, empurre-os suavemente para um dos lados e retire os testículos do lado oposto.Os testículos estão conectados à parede corporal, portanto remova-os com cuidado e corte o peritônio de ligação com microtesoura. Além disso, para evitar contaminação, esterilize primeiramente os testículos colocando-os em etanol 70% por dois segundos, e em seguida coloque-os em L-15 em placa de 96 poços sobre gelo. Marque as agulhas com rótulos apropriados, dependendo do tipo de amostra, e prepare as soluções de equilíbrio e vitrificação.Transfira os testículos para uma placa ou vasilha de maior tamanho e fixe três testículos ou mais, dependendo do tamanho da agulha, em uma agulha de acupuntura estéril. Primeiramente, posicione os testículos sobre pinças curvas. Coloque a ponta da agulha no centro do testículo e puxe cuidadosamente o testículo para cima com as pinças.Após perfurar o testículo, puxe-o suavemente para cima, em direção ao topo da agulha. Certifique-se de que os testículos estejam separados uns dos outros e de que não estejam caindo ou escorregando para baixo. Coloque as agulhas com os testículos fixados em um tubo Eppendorf Tubulator contendo L-15 até a vitrificação a 25 graus.O tempo de armazenamento não deve exceder uma hora. Transfira a agulha com os testículos para a solução de equilíbrio e incube por cinco minutos a 25 graus. Transfira a agulha para a solução de vitrificação e incube por 30 segundos a 25 graus.Remova a agulha da solução de vitrificação. Absorva rapidamente e com cuidado a solução remanescente do tecido usando um papel toalha estéril. Tenha cautela para evitar que os testículos aderem ao papel toalha ou caiam.Coloque rapidamente a agulha em nitrogênio líquido dentro de uma caixa de isopor. Mantenha a agulha em nitrogênio líquido em uma caixa de isopor fechada por cinco a 10 minutos. Resfrie previamente um criotubo aberto de 4,5 mililitros e sua tampa na mesma caixa.Após cinco a 10 minutos, transfira cada agulha para um criotubo separado abaixo da superfície do nitrogênio líquido e feche o criotubo. Coloque o criotubo em uma haste metálica e insira-o no recipiente do criobanco o mais rápido possível. Armazene as amostras em uma gaveta de armazenamento do recipiente até nova utilização.Aqueça cada agulha separadamente. Todas as soluções de aquecimento devem estar a 25 graus. Desprenda o criotubo da haste metálica e mergulhe-o no nitrogênio líquido armazenado em uma caixa de isopor.Abra o criotubo no vapor de nitrogênio líquido usando pinça e solte a agulha no nitrogênio líquido. Transfira a agulha rapidamente para a primeira solução de aquecimento e incube por um minuto. Certifique-se de transferir a agulha rapidamente para evitar aquecimento no ar durante a transferência.Transfira a agulha para a segunda solução de aquecimento e incube por três minutos. Transfira a agulha para a terceira solução de aquecimento e incube por cinco minutos. Libere os testículos da agulha deslizando-os para baixo com pinça curva.Coloque cada testículo aquecido individualmente em um poço separado contendo 250 microlitros de L-15, suplementado com 10% FPS. Certifique-se de que os poços estejam identificados de acordo com a amostra. Mantenha a placa sobre gelo até que todas as amostras sejam aquecidas e até o momento do próximo procedimento.Prepare 500 microlitros da solução de dissociação para cada amostra em tubos separados de dois mililitros. Rotule os tubos de acordo com o código da amostra. Incube a solução de dissociação preparada por cinco minutos à temperatura ambiente.Adicione o tecido aquecido à solução de digestão e corte-o em pequenos pedaços com pelo menos 30 movimentos de tesoura pequena. Incube o tecido em placa agitadora por 90 minutos a 24 graus. Interrompa o processo de digestão adicionando 400 microlitros de L-15 e 100 microlitros de FPS 10%.Agite brevemente a solução e incube por um minuto à temperatura ambiente. Filtre a solução obtida através de filtros de 50 micrômetros em um tubo de 1,5 mililitro. Rotule os tubos conforme necessário.Centrifugue a solução filtrada a 200 ×g durante 10 minutos a 25 graus. Remova cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 20 microlitros de L-15, suplementado com 10% de FPS. Agite manualmente o tubo até que o pellet esteja completamente dissolvido.Mantenha a suspensão celular em gelo ou a quatro graus até uso posterior. Misture cinco microlitros de suspensão celular e cinco microlitros de solução de azul de tripano 0,4% em um tubo de PCR de 0,2 mililitro devidamente rotulado. Se forem usados volumes diferentes, certifique-se de que a proporção de diluição de um para um permaneça inalterada.Incube esta suspensão por um a três minutos a 25 graus. Verifique a viabilidade de cada amostra em um hemocitômetro sob microscópio. Conte o número de células vivas não coradas pelo azul de tripano em 15 campos.Calcule o número total de células em 20 microlitros da suspensão celular. A suspensão está agora pronta para qualquer aplicação posterior. Em média, o número de células germinativas em estágio inicial isoladas de um único testículo de peixe-zebra fresco varia entre 40.000 e 200.000 células, dependendo do tamanho do peixe.Em todas as linhagens de peixe-zebra utilizadas neste estudo, o protocolo atual de vitrificação resultou em taxas médias de viabilidade de 50% ou superiores. Isso indica viabilidade e reprodutibilidade favoráveis do protocolo apresentado. Ao digerir testículos frescos de peixe-zebra nas cinco linhagens, além das células germinativas em estágio inicial, também foram encontrados numerosos espermatozoides.Após a digestão de testículos criopreservados, havia muito menos espermatozoides, indicando que eles não sobrevivem a este protocolo de vitrificação e que provavelmente são eliminados durante o processo de digestão. O protocolo de vitrificação com agulha imersa apresentado neste estudo oferece várias vantagens na criopreservação de fragmentos testiculares. Em primeiro lugar, vários fragmentos podem ser fixados em uma única agulha e, portanto, podem ser expostos simultaneamente aos crioprotetores e ao nitrogênio líquido.Além disso, este método permite que quantidades muito baixas de crioprotetores sejam adicionadas aos fragmentos de tecido. Assim, as taxas de resfriamento e aquecimento podem ser mais altas. Uma vantagem significativa é que os espermatozoides não sobrevivem a este protocolo, e, portanto, ao final, as suspensões celulares são enriquecidas em espermatogônias, o que facilitará as aplicações posteriores.Mas uma coisa que deve ser levada em consideração é a possibilidade de contaminação cruzada por meio do nitrogênio. Portanto, ao utilizar este método, o nitrogênio líquido não deve ser reutilizado.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este é um high-throughput protocolo de criopreservação de esperma para zebrafish. Espermatozóides criopreservados utilizando este protocolo tem uma média de fertilidade de 25% na fertilização in vitro subseqüentes e é estável durante muitos anos.

Um método de alta taxa de transferência para Zebrafish criopreservação de espermatozóides e In Vitro Fertilização

Este é um método para a geração de embriões diplóides gynogenetic zebrafish (embriões cuja única contribuição genética vem da mãe), bloqueando a segunda divisão meiótica imediatamente após a fertilização com esperma de luz ultravioleta inativado. EP embriões não são totalmente homozigótica devido à recombinação durante a primeira divisão meiótica, porém eles são homozigotos em todos os loci que não foram separadas de suas centrômero por recombinação.

Fazendo Zebrafish Diplóide Gynogenetic por pressão inicial

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Vitrificação de embriões de coelho usando palha criogênica: uma técnica de resfriamento ultrarrápido para preservar embriões de coelho para armazenamento a longo prazo

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