Uso de um Mosquito recombinante Densovirus como um vetor de entrega do Gene para a análise funcional de Genes em larvas do Mosquito

O objetivo geral deste procedimento é analisar a função gênica de larvas de mosquito, utilizando densovírus recombinante de mosquito como sistema de entrega gênica. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave em sistemas de entrega baseados em vírus, como superar as barreiras extracelulares e intracelulares associadas. As principais vantagens dessas técnicas são a fácil manipulação, alta eficiência de transdução, uso prolongado e robusto de expressões e a capacidade de produzir efeitos persistentes in vivo.

Este trabalho demonstrou que pequenos RNAs específicos ou genes alvo podem ser superexpressos ou silenciados em larvas de mosquito, utilizando o sistema de entrega por densovírus desenvolvido. As implicações dessa técnica ampliam as aplicações da estratégia de expressão descrita para investigar a biologia do mosquito, pois este método permite transduções fáceis das larvas. A demonstração do procedimento será realizada por Pei-Wen Liu, candidata a doutorado do nosso laboratório.

Comece encomendando a síntese química de sequências completas de cDNA para as pré-microRNAs, esponjas de microRNA e shRNA, conforme descrito no protocolo textual complementar. Após receber o DNA encomendado, centrifugue os tubos contendo os blocos de DNA para garantir que todo o DNA seco esteja na base do tubo. Em seguida, reconstitua o DNA em água livre de DNase para obter uma concentração final de 10 nanogramas por microlitro.

Adicione seis microlitros de XbaI para digerir a estrutura do plasmídeo e as sequências de cDNA, e coloque a reação a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, desfosforile as extremidades cinco-prime do esqueleto do plasmídeo linearizado com fosfatase alcalina de intestino de bezerro, de acordo com as instruções do fabricante. Para um empacotamento eficiente, o tamanho do genoma não pode exceder 4.400 nucleotídeos, representando 110% do comprimento do genoma de densovírus de mosquito selvagem, ou expressão de microRNA intrônico pode consistir em não mais de 400 nucleotídeos que podem ser introduzidos no genoma de Aedes aegypti.

Em seguida, inative a fosfatase alcalina pelo aquecimento a 65 graus Celsius. Depois, eletroforese o DNA em um gel de agarose a 1%, e corte o esqueleto linearizado. Extraia o DNA do fragmento do gel, utilizando um kit de extração de gel, seguindo as instruções do fabricante.

Uma vez extraído, ligue o fragmento de DNA ao vetor, utilizando a ligase T4 de DNA. Em seguida, use choque térmico para transformar os produtos da reação de ligação em células competentes de E. coli DH5-alpha. Plaque as bactérias transformadas em uma placa de ágar LB contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina.

No dia seguinte, escolha uma única colônia da placa e crie uma cultura inicial, utilizando três mililitros de meio enriquecido contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Por fim, extraia o DNA plasmidial da cultura bacteriana, utilizando um kit de miniprep, seguindo as instruções do fabricante. Envie uma amostra do DNA para uma empresa de sequenciamento de DNA para verificação.

Ligue o pré-miRNA ou shRNA ao sítio HpaI da região codificadora de NS1 de AaeDV no esqueleto do plasmídeo pUCA, utilizando os métodos demonstrados para o cassete artificial de expressão de RNA pequeno intrônico. Em vez de usar células DH5-alpha, transforme o DNA em células competentes Stbl3 de E.coli. Em seguida, plaque as células transformadas em uma placa de ágar LB contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina e prepare uma cultura inicial a partir de um clone positivo. Após isso, extraia o plasmídeo rAaeDV das células bacterianas, utilizando um kit de maxiprep, seguindo as instruções do fabricante.

No dia zero, divida frascos com 90 a 95% de confluência de células C6/36 de um para dois em 10 frascos de cultura T-25. Incube os frascos por 18 a 20 horas a 28 graus Celsius até que alcancem novamente 90 a 95% de confluência.

No primeiro dia, transfecte as células com os plasmídeos rAaeDV gerados. Para isso, dilua 10 microgramas de DNA em 600 microlitros de meio RPMI-1640 e misture a solução suavemente. Enquanto isso, prepare 600 microlitros de meio RPMI-1640 e 25 microlitros de reagente de transfeção por transfeção.

Incube as células com o DNA por cinco a 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 625 microlitros da mistura do reagente de transfeção RPMI-1640 à mistura de DNA plasmidial e incube essa mistura por 20 a 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, lave as células duas vezes com meio RPMI-1640 e, então, adicione a mistura de transfeção a cada um dos frascos de cultura T-25.

Incube as células na mistura de transfeção por seis horas a 28 graus Celsius. Após seis horas, remova o meio de transfeção, lave as células duas vezes com cinco mililitros de meio RPMI-1640 e, em seguida, adicione meio RPMI-1640 fresco contendo 10% de FBS. Cinco dias após a transfeção, utilize um conta-gotas de vidro de cinco mililitros para desprender e suspender as células nas placas, pipetando para cima e para baixo com o meio de cultura.

Transfira as suspensões celulares de cada frasco para tubos estéreis de 50 mililitros separados. Para colher um vírus dependente de limiar alto, é necessário manter as células por cinco dias após a transfeção. Congele os tubos individuais a menos 80 graus Celsius ou em banho de gelo seco com etanol por 30 minutos.

Em seguida, descongele rapidamente a 37 graus Celsius e vortexe a suspensão celular por um minuto. A seguir, colete o sobrenadante da amostra centrifugada e descarte o precipitado. Então, passe o sobrenadante por um filtro descartável de seringa de 0,22 micrômetro.

Aliquotar e armazenar os estoques finais de viriões purificados a menos 80 graus Celsius. Lavar 100 larvas de primeiro estágio de A. albopictus três vezes, utilizando água desionizada. Em seguida, transferir as larvas para um béquer contendo 95 mililitros de água desionizada.

Adicione cinco mililitros das estirpes de rAaeDV e incube as larvas por 24 horas a 28 graus Celsius. Para o sucesso da infecção larval, é essencial que as larvas permaneçam em contato com partículas virais de infecção por 24 a 36 horas, a fim de garantir altas taxas de infecção. Após a incubação, lave as larvas três vezes utilizando água desionizada e, em seguida, transfira-as de volta às placas. Alimente as larvas regularmente. Monitore o nível de expressão do gene alvo nas larvas, utilizando PCR quantitativa ou western blot, empregando técnicas padrão.

Neste exemplo, 100 larvas de primeiro estágio foram analisadas quanto à expressão endógena de miRNA após infecção com o vírus recombinante contendo o cassete de expressão aal-let-7, que mostra superexpressão.

A eficiência do construto anti-let-7 é mostrada à direita, destacando sua capacidade de silenciamento gênico. Para monitorar a eficiência do silenciamento do mRNA da V-ATPase pelos vetores rAaeDV, um total de 100 larvas de primeiro ínstar foram tratadas com quantidades iguais de rAaeDV de diferentes tipos, adicionando-se o vírus ao corpo d'água do habitat larval. Os níveis de mRNA da V-ATPase foram substancialmente reduzidos por um rAaeDV que expressa miRNA e por um rAaeDV que expressa shRNA intrônico.

Nossos resultados validam uma estratégia de expressão intrônica que oferece um novo paradigma, capaz de superar as limitações dos densovírus de mosquito com genoma defeituoso, permitindo a entrega eficiente de genes estranhos em mosquitos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que um cassete de expressão de microRNA intrônico com no máximo 400 nt pode ser introduzido no genoma do densovírus de Aedes aegypti. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisas na produção de densovírus recombinantes de mosquito não defeituosos, que podem superexpressar ou reprimir microRNAs e genes-alvo, possibilitando a análise funcional de genes de mosquito.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o sistema de entrega desenvolvido de densovírus de mosquito para analisar as funções gênicas nas larvas de mosquito.