Name: Uso de um Mosquito recombinante Densovirus como um vetor de entrega do Gene para a análise funcional de Genes em larvas do Mosquito (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Aprenda a analisar funções gênicas em larvas de mosquito usando densovírus recombinante AaeDV como sistema de entrega de genes. Este método permite superar barreiras extracelulares e intracelulares com alta eficiência de transdução.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores reconhecem o apoio financeiro da pesquisa nacional de chave e programa de desenvolvimento da China (2016YFC1200500 de Chen Xiao Guang), Nacional Natural Science Foundation da China (81672054 e 81371846), a equipe de investigação do Natural Fundação de ciência de Guangdong (2014A030312016) e o programa científico e tecnológico de Guangzhou (201508020263). Reconhecemos com gratidão Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) para gentilmente fornecendo os plasmideos pUCA e p7NS1-GFP e ler criticamente este manuscrito.

todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê ético de Southern University Medical.
 1. projetar um intrão Artificial Nota: O intrão artificial utilizado neste trabalho é 65 bp em comprimento e a sequência é 5 &#39; - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 &#39;.
<ol><li>Coloque o Hpa eu restrição site em ambas as extremidades do intron artificial então esse Hpa eu digestão pode liberar o intrão de plasmídeos (consulte a Figura 1 A).</li>
	<li>Lugar os dois Xba eu sites de restrição do intron então aquele Xba eu digestão pode ser usado para inserir sequências de RNA de pequena expressão.</li>
	<li>Ordenar a síntese química de sequências de DNA completos do intrão artificial de um fabricante de DNA. O sintético DNA criado é de clonagem em um plasmídeo padrão pUC19. 
	Nota: Os componentes essenciais do intrão artificial incluem vários elementos de nucleotídeos de consenso, incluindo um 5 &#39; site de tala doador (DS) com a sequência GUAAGAGU, uma sequência conservada ponto de ramificação (BPS) com a sequência UACUAAC, uma poli-pirimidina tracto (PPT), com a sequência UCUUC(U) 10 e um 3 &#39;-site de tala aceitador (AS) com a sequência de GAUAUCCUGCAG ( Figura 1 A). Dois Xba eu sites de restrição foram introduzidas entre o DS e BPS que pode ser usado para inserir sequências de RNA de pequena expressão. A capacidade de efetivamente emendar esta intrão artificial de células de mamíferos e mosquito foi previamente confirmados 14.</li>
</ol> 2. Projetando um Artificial intrônicas pequeno RNA expressão Cassette Nota: para superexpressão ou nocaute de miRNA endógeno, as sequências que codificam miRNA precursor ou uma esponja de miRNA foram inseridas entre o DS e BPS. Para servir como um exemplo, um precursor endógeno de miRNA de Ae. albopictus aal-deixe-7 foi selecionado para construir vetores virais recombinantes para miRNA superexpressão e nocaute. Uma esponja let-7 foi projetada de acordo com os métodos anteriormente descritos, 15. Para derrubar os genes alvo em larvas, nós projetamos miRNA artificial específico (amiRNA) ou sequências de RNA (shRNA) gancho de cabelo curto usando software online 16 ,, 17; para servir como um exemplo, a subunidade V-ATPase um mRNA (não de adesão. AY864912) foi selecionado como um gene alvo neste estudo. O amiRNA será referido como amiVTP agora em diante. Todos os detalhes de sequências de pre-miRNA, esponja, amiRNA e shRNA são descritos no quadro suplementar 1.
<ol><li>Ordenar a síntese química de sequências de cDNA completos do precursor miRNAs, miRNA esponjas e shRNA com Xba eu locais da limitação em ambas as extremidades de um fabricante de DNA.</li>
	<li>Depois de receber o DNA ordenado, rotação dos tubos contendo blocos de DNA em 10.000-14.000 x g por 1 min garantir que tudo seco DNA é na parte inferior do tubo.</li>
	<li>Resuspenda o DNA secado em água livre de DNase para atingir uma concentração final de 10 ng / µ l.</li>
	<li>Digerir a espinha dorsal do plasmídeo e DNA sequências com Xba eu a 37 ° C, durante 1 h e em seguida dephosphorylate a 5 &#39; extremidades da coluna vertebral do plasmídeo linear com bezerro intestinal fosfatase alcalina (CIAP) de acordo com o fabricante &#39; protocolo s .</li>
	<li>Inativar CIAP por aquecimento durante 60 minutos a 65 ° C.</li>
	<li>Executar um gel de agarose 1,0% e cortar a espinha dorsal linear. Em seguida, extrair o DNA da fatia gel usando um kit de extração de gel após o fabricante &#39; instruções de s.</li>
	<li>Ligam o fragmento de DNA para o backboneby T4 DNA ligase (5 U / µ l) a 22 ° C, durante 1 h.</li>
	<li>Transformar os produtos da reação da ligadura de células passo 2.7 em competentes de Escherichia coli (e. coli) e placa em uma placa de ágar caldo lisogenia (LB) contendo ampicilina (em uma concentração de 100 µ g/mL).
	<ol><li>Executar a transformação através de um choque de calor método 18 e uso o apropriado Escherichia coli cepa. Por exemplo, usar a estirpe de e. coli DH5α para transformação de choque do calor.</li>
	</ol></li> <li>Escolher uma única colônia de passo 2.8 e incubá-los numa cultura de 3 mL enriquecido média contendo ampicilina (em uma concentração de 100 µ g/mL).</li>
	<li>Extrair o ADN do plasmídeo de cultura bacteriana, usando um kit de mini-preparação seguindo o fabricante &#39; instruções s. Enviar a amostra para uma empresa de sequenciamento de DNA. 
	Nota: Para superexpressão ou nocaute de miRNA endógeno, as sequências de codificação miRNA precursor ou uma esponja de miRNA foram inseridas entre os dois Xba eu sites. Todas as construções de expressão ou esponja miRNA devem ser menores do que 400 bp (10% do comprimento do genoma viral), devido ao limite de empacotamento dos vírus 19.</li>
</ol> 3. Gerando um rAeaDV construção clonando uma miRNA ou shRNA Cassette de expressão em um Backbone de plasmídeo Nota: pUCA, um clone infeccioso consistindo de um plasmídeo pUCA contendo o genoma de AaeDV (3.981 nt) 19, foi gentilmente cedido pelo Prof Jonathan Carlson e tem sido descrita anteriormente em detalhe 11. p7NS1-DsRed expressa uma proteína não-estruturais 1 (NS1)-proteína de fusão da proteína fluorescente vermelha (DsRed) o promotor p7 e tem sido descrito em detalhe em outro lugar 14. Um precursor de humanos específicos miR-941-1 20 e sua esponja, um shRNA mexido (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), também subcloned AaeDV como controlo negativo.
<ol><li>Ligate a pre-miRNA, esponja, shRNA ou uma gaveta de expressão amiVTP para o Hpa eu site da região AaeDV NS1-codificação na espinha dorsal do plasmídeo pUCA conforme descrito na etapa de protocolo 2.4 para 2.7.</li>
	<li>Transformar o DNA em Stbl3 competentes de Escherichia coli células e selecione um clone positivo conforme descrito na etapa 2.8 a 2.10.</li>
	<li>Seguindo isso, extrair o plasmídeo rAaeDV de células bacterianas usando um kit de preparação maxi seguindo o fabricante &#39; instruções de s. 
	Nota: Células Stbl3 ou Stbl4 e. coli devem ser utilizadas para transformação de DNA rAaeDV para minimizar indesejada recombinação ITR. Uma preparação maxi deve ser usada para extrair o plasmídeo rAaeDV para obter uma grande quantidade de DNA (&#62; 100 µ g). Antes de gerar o vírus, a integridade da sequência do plasmídeo rAaeDV sempre deve ser analisada por sequenciamento de DNA 21.</li>
</ol> 4. Transfecting células C6/36 com plasmídeos de rAaeDV <ol><li>cultura C6/36 células em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio de 1640 contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina em uma incubadora de 28 ° C.</li>
	<li>No dia 0, as células em dez frascos de cultura de 2 25 cm da placa 18-20 h antes do transfection dividindo 90-95% confluentes em uma diluição de 1:2. 
	Nota: Por dia 1, as células devem chegar a confluência de 90-95%.</li>
	<li>No dia 1, transfect as células com a série de rAaeDV plasmídeos 22.
	<ol><li>Diluir 10 µ g/ml DNA 600 µ l de meio RPMI-1640 em um tubo de microcentrifugadora e misture delicadamente. Enquanto isso, preparar 600 µ l de meio RPMI-1640 e 25 µ l de reagente de transfeccao por transfecção.</li>
		<li>Incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente (RT). Em seguida, adicione 625 µ l da mistura reagente de Transfeccao de 1640 à mistura de DNA de plasmídeo-1640.</li>
		<li>Incubar esta mistura durante 20-30 min à RT Antes de transfeccao, lave as células duas vezes com 2 mL de meio RPMI-1640.</li>
		<li>Incubação após o RT (passo 4.3.3), adicione the1640-transfecção reagente DNA plasmídeo mistura no balão de cultura 25 cm 2 e incubar durante 6 h a 28 ° C.</li>
		<li>Em aproximadamente 6 h pós-do transfection, remover a mídia de transfeccao, lavar as células duas vezes com 5 mL de meio RPMI-1640 e em seguida, adicione o meio RPMI-1640 com 10% FBS. 
		Nota: rAaeDV mostra altas taxas de infecção (95%) em Ae. albopictus larvas; no entanto, em nossa experiência, em quase 50% de larvas infectadas, a infecção era restrita aos locais de infecção primária (por exemplo, células de cerdas e papila anal) sem divulgação 23. Portanto, se há uma necessidade de infectar as larvas em vários tecidos, um defeituoso vírus recombinante expressando a proteína fluorescente deve ser co-infectados para permitir a visualização dos locais de infecção. Por exemplo, para produzir defeituoso vírus recombinante expressando DsRed, p7NS1-DsRed deve ser co transfectada com um plasmídeo ajudante em células C6/36, de acordo com o procedimento descrito acima (a relação de concentração de cotransfection deve ser de 2:1).</li>
	</ol></li></ol> 5. Colheita rAaeDV Virions de Transfected C6/36 células <ol><li>colher as células 5 dias depois do transfection. Desalojar e suspender as células nos pratos por um conta-gotas de vidro de 5 mL, Pipetar para cima e para baixo com o meio de cultura. Transferir todas as suspensões celulares para tubos estéreis de 15 mL.</li>
	<li>Congelar a-80 ° C ou em um banho de gelo seco (etanol) por 30 min e depois descongelar em 37 ° C. Vortex para 1 min. repetir o procedimento de congelamento e descongelamento vezes 3.</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 4.800 x g por 20 min em 4 °C.Collect o sobrenadante e descartar a pelota. Em seguida, passe o sobrenadante através de um filtro de seringa descartável 0,22 µm. Alíquota e loja o vírion final purificado estoques no -80 ° C. 
	Nota: Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.</li>
</ol> 6. Quantificar rAaeDV <ol><li>preparar o DNA padrões. Linearizar todo rAaeDV plasmídeos com Hpa e purificar os produtos digeridos com um gel de extração kit 24.</li>
	<li>Construir a curva padrão quantitativa absoluta e medir do título do vírus de acordo com os métodos anteriormente descritos 25.</li>
</ol> 7. Transdução de mosquito <ol><li>lavagem 100 1 st ínstar Ae. albopictus as larvas três vezes usando água deionizada água e em seguida, transferir as larvas em um béquer contendo 95 mL de água desionizada. Adicionar 5 mL de rAaeDV ações (concentração final de 1,00 x 10 10 cópias/mL).</li>
	<li>Incubar por 24 h a 28 ° C, lavar as larvas três vezes usando água deionizada e depois transferir as larvas para as placas e alimentar regularmente.</li>
	<li>Monitorar o nível de expressão do gene alvo em larvas com qPCR ou Western blot (representante resultados são mostrados nas figuras 3 e 4). 
	Nota: O método de deteção do sinal de fluorescência pode ser usado para isolar as larvas infectadas, mais precisamente. Por exemplo, para detectar sinais fluorescentes de larvas infectadas com vírus recombinante expressando DsRed, as larvas podem ser colocadas em um slide de concavidade e observadas sob um microscópio de fluorescência invertido cada 8 h até pós-infecção 2 dias. Uma vez que as larvas fluorescentes são detectadas, eles devem ser separados em copos de plástico de teste individual para permitir a observação contínua subsequente. Larvas com vários tecidos infectados podem ser identificadas usando esse método.</li>
</ol>

<ol><li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.cppah.com/article/S1538-5442(09)00014-5/fulltext">Mosquito-borne diseases.</a> Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).</li>
<li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).</li>
<li>Roberts, D. R., Andre, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticide+resistance+issues+in+vector-borne+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+tropical+medicine+and+hygiene%22%5BJournal%5D)">Insecticide resistance issues in vector-borne disease control.</a> The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).</li>
<li>Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+risks+on+the+backs+of+the+poor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Balancing risks on the backs of the poor.</a> Nature medicine. 6, 729-731 (2000).</li>
<li>Volohonsky, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Expression+of+the+Anti-parasitic+Factor+TEP1+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS pathogens. 13, 1006113(2017).</li>
<li>Galizi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+sex+ratio+distortion+system+for+the+control+of+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito.</a> Nature communications. 5, 3977(2014).</li>
<li>Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+one+rabbit+out+of+the+hat%3A+Radiation%2C+transgenic+and+symbiont-based+approaches+for+sustainable+management+of+mosquito+and+tsetse+fly+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+tropica%22%5BJournal%5D)">More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations.</a> Acta tropica. 157, 115-130 (2016).</li>
<li>Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvised+microinjection+technique+for+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Indian+journal+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Improvised microinjection technique for mosquito vectors.</a> The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).</li>
<li>Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference-mediated+knockdown+of+a+GATA+factor+reveals+a+link+to+anautogeny+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).</li>
<li>Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+double-stranded+RNA+in+larvae+of+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%3A+implications+for+pest+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+insect+science%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control.</a> Journal of insect science. 13, (Online) 69(2013).</li>
<li>Ward, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+transducing+densovirus+pathogenesis+and+expression+in+Aedes+aegypti+and+Anopheles+gambiae+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae.</a> Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).</li>
<li>Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densoviruses+for+control+and+genetic+manipulation+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+virus+research%22%5BJournal%5D)">Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes.</a> Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).</li>
<li>Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+the+Aedes+albopictus+parvovirus+%28AaPV%29%2C+a+denso-like+virus%2C+for+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes.</a> Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+non-defective+recombinant+densovirus+vectors+for+microRNA+delivery+in+the+invasive+vector+mosquito%2C+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus.</a> Scientific reports. 6, 20979(2016).</li>
<li>Ortega, M. M., Bouamar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+Designing+MicroRNA+Sponges%3A+From+Construction+to+Stable+Cell+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line.</a> Methods in molecular biology. 1509, Clifton, N.J. 221-233 (2017).</li>
<li>BLOCKiT RNAi Designer. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/">http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/</a> (2017).</li>
<li>GE Dharmacon siDesign Center siRNA design tool. , Available from: dharmacon.gelifesciences.com/design-center/ (2017).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e253(2007).</li>
<li>Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densovirus+of+Aedes+aegypti+as+an+expression+vector+in+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+parasitology%22%5BJournal%5D)">Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells.</a> Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).</li>
<li>Hu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+human-specific+microRNA+miR-941%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Evolution of the human-specific microRNA miR-941.</a> Nature communications. 3, 1145(2012).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).</li>
<li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent%3A+primary+neurons%2C+siRNA%2C+and+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).</li>
<li>Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+AeDNA+containing+the+insect-specific+toxin%2C+BmK+IT1%2C+displayed+an+increasing+pathogenicity+on+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+tropical+medicine+and+hygiene%22%5BJournal%5D)">A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus.</a> The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).</li>
<li>Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serious+overestimation+in+quantitative+PCR+by+circular+%28supercoiled%29+plasmid+standard%3A+microalgal+pcna+as+the+model+gene%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene.</a> PloS one. 5, 9545(2010).</li>
<li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rAAV9+to+Overexpress+or+Knockdown+Genes+in+Mouse+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

É importante superar dois das principais barreiras que limitam a construção rAaeDV. O primeiro é a produção de vírus recombinantes com defeito. Tem sido relatado que o MDV pode ser usado como um vetor para expressar apropriadamente dimensionada genes estrangeiros, tais como neurotoxins20 de inseto específico de escorpião e a proteína GFP; no entanto, independentemente da estratégia de construção, uma vez que as ORFs do MDV são inserido ou substituído com genes exógenos, virions não podem formar independentemente a menos ...

Doenças transmitidas por mosquitos, como malária, febre do dengue, febre zika e febre amarela, são problemas de saúde pública internacional que continuam a ser responsáveis por uma fração significativa da carga global de doenças infecciosas1,2. Insecticidas convencionais, que têm sido utilizados em resposta a vetores, são um componente importante da estratégia de controle de mosquito integrado sustentável para a prevenção de doenças transmitidas por mosquitos. No entanto, tais estratégias provaram para ser relativamente ineficazes ou indesejáveis devido os impactos ambientais negativos associados, bem como a evolução da resistência no mosquito populações3,4. Por estas razões, há uma necessidade urgente de métodos alternativos de mosquito controle e o uso de métodos transgênicos para produzir mosquitos machos estéreis e o lançamento de mosquitos resistentes ao patógeno surgiram como promissoras novas estratégias de controle. Para desenvolver novo eficaz controlar métodos, tais como seguras e eficazes abordagens para na vivo entrega de gene, a análise abrangente da função do gene de mosquito é necessária.
Microinjeção direta de plasmídeo, dobro encalhado RNA (dsRNA) ou RNA de interferência pequeno (siRNA) é o mais comumente usado em vivo gene entrega método em mosquitos. Na verdade, a produção de variedades transgênicas de mosquitos ainda dependem de um processo de embrião microinjeção5,6,7. No entanto, microinjeção tem várias limitações. Em primeiro lugar, esta técnica é tecnicamente exigente e envolve procedimentos complicados. Em segundo lugar, a injeção faz com que um insulto físico para o embrião, larvas, pupas e adultos, que afecta directamente a viabilidade do organismo alvo. Em terceiro lugar, é difícil imobilizar as larvas de mosquito para microinjection porque a maioria vive em um habitat aquático e possuem uma característica que se contorcendo de movimento. Em quarto lugar, o tamanho de 1st-2nd ínstar larvas é 10 a 20 vezes menor do que a de 4th ínstar e larvas mais velhas e as cutículas da antiga são mais delicadas. Estas características tornam difícil de manipular 1st-2nd ínstar larvas em comparação com aqueles em estágios mais antigos. Combinados, esses fatores contribuem para uma taxa de sobrevivência de pós-injeção reduzida para larvas (cerca de 5%) em comparação com adultos8. Sistemas de entrega baseada em viral foram desenvolvidos para superar as barreiras extracelulares e intracelulares associadas. Estes sistemas têm as vantagens de fácil manipulação, transdução de alta eficiência, a longo prazo e robustos níveis de expressão e a capacidade de produzir efeitos persistentes na vivo. Portanto, gene entrega sistemas utilizando lentivírus, retrovírus e adenovírus foram amplamente utilizado linhas de células inmammalian e espécie de modelo. O sistema de expressão viral de Sindbis tinha sido anteriormente usado para analisar a função do gene no mosquito adulto; Além das preocupações de segurança biológica, no entanto, a injeção é ainda um processo necessário para infecção viral9. Embora, a entrega oral por larvas de imersão na solução dsRNA tem sido relatada anteriormente como um método de entrega viável, é inadequada para o pequeno RNA função análise10. Então, métodos de efetiva entrega viral ainda devem ser desenvolvidos para os mosquitos.
Mosquito densoviruses (MDVs) fazem parte da subfamília Densovirinae de Parvoviridaee uma queda do género Brevidensovirus11. Virions MDV são não-envelopado e consistem de um genoma de DNA (ssDNA) single-stranded e um capsídeo icosaédrica (20 nm de diâmetro). O genoma viral é aproximadamente 4 kb em tamanho e é replicado dentro dos núcleos das células do hospedeiro. MDVs são relativamente estáveis no ambiente e mostram uma gama de hospedeiros estreitas com alta especificidade para os mosquitos. Estes vírus têm o potencial para se espalhar e persistir naturalmente em populações de mosquito e podem invadir quase todos os órgãos e tecidos desses insetos, incluindo o midgut, Malpighi túbulos, gordura corporal, massa muscular, neurônios e glândulas salivares12.
Genomas MDV intactas podem ser subcloned em vetores do plasmídeo para produzir clones infecciosos baseados no plasmídeo; Quando estes clones são entregues em células de mosquito, o genoma viral é extraído do vetor do plasmídeo, e partículas virais infecciosas são produzidas. Porque MDV tem um genoma pequeno ssDNA, clones infecciosos são facilmente construídos e o genoma viral pode ser facilmente manipulado11,13. Estas características fazem MDV um valioso agente para examinar a biologia do mosquito. No entanto, porque quase toda a sequência do genoma viral é essencial para proliferação viral, a criação de vírus recombinantes através da substituição ou inserção de genes estrangeiros provoca uma perda na capacidade de embalagens e/ou replicação viral, que cria um barreira para o desenvolvimento de MDVs como vetores de entrega do gene. Neste documento, nós relatamos usando uma estratégia intrônicas artificial pequeno-RNA expressão para desenvolver um rAaeDV não-defeituoso na vivo RNA entrega sistema que tem as vantagens da construção fácil do plasmídeo e a manutenção de um vírus funcional que pode produzir estável e de longo prazo expressão em células hospedeiras, sem a necessidade de vírus do tipo selvagem. Além disso, este método permite a fácil transdução de larvas.
Os protocolos para as etapas a seguir são descritos neste estudo: linha 1) projeto de rAaeDVs codificação uma gaveta intrônicas expressão pequeno-RNA, 2) produção de partículas de vírus recombinantes usando a célula de empacotamento C6/36, 3) análise quantitativa de célula livre rAaeDV genoma copiar números e 4) infecção do Ae. albopictus larvas por introdução directa de vírus para o corpo de água do habitat larval. Em geral, este trabalho demonstrou que RNAs pequeno específico genes-alvo podem ser overexpressed ou derrubados em larvas de mosquito, usando o sistema de entrega MDV desenvolvido.

<table><tbody><tr><td>Máquina centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Extração de Gel GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Kit Midi de Plasmídeo</td><td>Omega Biotech</td><td>D6904</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Purificado</td><td>OXOID</td><td>LP0028A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase alcalina termossensível FastAP (1 U/&micro; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest HpaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD1034</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest XbaI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0684</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase (5 U/&micro; L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TransStbl3 Célula Quimicamente Competente</td><td>Beijing Transgen Biotech</td><td>CD521-01</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina&nbsp;</td><td>Pequim Tiangen Biotech</td><td>RT501</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>MC5008</td><td></td></tr><tr><td>SuperReal PreMix Plus (SYBR Verde)</td> <td>Pequim Tiangen Biotech</td><td>FP205</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de um mosquito recombinante densovirus como um vetor de entrega do gene para a análise funcional de genes em larvas do mosquito

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

Microinjection in vivo é a técnica de transferência do gene mais comumente usados para analisar as funções do gene em mosquitos individuais. No entanto, esse método requer uma mais tecnicamente exigente operação e envolve procedimentos complicados, especialmente quando usado em larvas devido ao seu pequeno tamanho, cutícula relativamente fina e frágil e alta mortalidade, que limitam a sua aplicação. Em contraste, vetores virais para a entrega do gene foram desenvolvidos para superar barreiras extracelulares e intracelulares. Estes sistemas têm as vantagens de fácil manipulação, gene alta eficiência de transdução, manutenção a longo prazo da expressão do gene e a capacidade de produzir efeitos persistentes na vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) são específicos de mosquito, pequenos vírus de DNA único-encalhado que podem efetivamente entregar estrangeiros ácidos nucleicos nas células de mosquito; no entanto, a substituição ou a inserção de genes estrangeiros para criar vírus recombinantes normalmente provoca uma perda de habilidades de embalagens e/ou replicação, que é uma barreira para o desenvolvimento destes vírus como vetores de entrega.
Neste documento, nós relatamos utilizando uma estratégia intrônicas artificial pequeno-RNA expressão para desenvolver um recombinante com defeito não Aedes aegypti densovirus (AaeDV) na vivo sistema de entrega. São descritos os procedimentos detalhados para a construção, a embalagem e a análise quantitativa dos vetores rAaeDV e para infecção larval.
Este estudo demonstra, pela primeira vez, a viabilidade de desenvolver um com defeito não recombinante MDV micro RNA (miRNA) expressão sistema, desta forma fornecendo uma poderosa ferramenta de análise funcional de genes no mosquito e estabelecendo uma base para o aplicação de paratransgenesis viral para controlar doenças transmitidas por mosquitos. Demonstrámos que instar as larvas do Aedes albopictus 1st podem ser facilmente e eficazmente infectadas introduzindo o vírus para o corpo de água das larvas reprodução local e que o rAaeDVs desenvolvido poderia ser usado para overexpress ou derrubar o expressão de um gene alvo específico em larvas, fornecendo uma ferramenta de análise funcional de mosquito genes.

Estratégias para a construção de rAaeDV Um vetor de rAaeDV com defeito foi gerado para expressar o gene DsRed em larvas do mosquito. O plasmídeo resultante continha uma gaveta de proteína NS1-DsRed fusão com a proteína VP eliminada (Figura 1A). rAaeDV plasmídeos contendo a expressão construções para miRNA, amiRNA, Plasmideo e miRNA esponja foram projetados (mostrado na Figura 1B</stron...

Nós relatamos usando uma artificial intrônicas pequeno RNA expressão estratégia para desenvolver um recombinante com defeito não Aedes aegypti densovirus (AaeDV) na vivo sistema de entrega. Um procedimento detalhado para a construção, embalagens e análise quantitativa dos vetores rAaeDV tão bem quanto a infecção larval é descrito.

Uso de um Mosquito recombinante Densovirus como um vetor de entrega do Gene para a análise funcional de Genes em larvas do Mosquito

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

O objetivo geral deste procedimento é analisar a função gênica de larvas de mosquito, utilizando densovírus recombinante de mosquito como sistema de entrega gênica. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave em sistemas de entrega baseados em vírus, como superar as barreiras extracelulares e intracelulares associadas. As principais vantagens dessas técnicas são a fácil manipulação, alta eficiência de transdução, uso prolongado e robusto de expressões e a capacidade de produzir efeitos persistentes in vivo.Este trabalho demonstrou que pequenos RNAs específicos ou genes alvo podem ser superexpressos ou silenciados em larvas de mosquito, utilizando o sistema de entrega por densovírus desenvolvido. As implicações dessa técnica ampliam as aplicações da estratégia de expressão descrita para investigar a biologia do mosquito, pois este método permite transduções fáceis das larvas. A demonstração do procedimento será realizada por Pei-Wen Liu, candidata a doutorado do nosso laboratório.Comece encomendando a síntese química de sequências completas de cDNA para as pré-microRNAs, esponjas de microRNA e shRNA, conforme descrito no protocolo textual complementar. Após receber o DNA enc

use-recombinant-mosquito-densovirus-as-gene-delivery-vector-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Reversa abordagens genéticas têm-se revelado extremamente útil para determinar quais genes de resistência a patógenos underly vetor em mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra um método utilizado pelo laboratório de James para injetar dsRNA em fêmeas de mosquitos A. aegypti, que abrigam o vírus da dengue. A técnica para a calibração de agulhas de injeção, manipulando a configuração da injeção, e injetando dsRNA no tórax é ilustrado.

Injeção de dsRNA em Mosquitos Feminino A. aegypti

Reversa abordagens genéticas têm-se revelado extremamente útil para determinar quais genes de resistência a patógenos underly vetor em mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra um método utilizado pelo laboratório Dimopoulos para injetar dsRNA em mosquitos Anopheles gambiae, que abrigam o parasita da malária. A técnica de manipular a configuração da injeção e injetar dsRNA no tórax é ilustrado.

Protocolo para Ensaios RNAi em mosquitos adultos (A. gambiae)

Oligonucleotídeos podem ser usados ​​para o site substitua especificamente um único nucleotídeo de genes-alvo transfectadas em ambos...

Transfecção e Mutagênese de genes alvo em células de mosquito por Locked de ácido nucléico modificados Oligonucleotídeos

Neste protocolo combinamos RNAi mediada silenciamento de genes com...

RNAi mediada knockdown do gene e<em&gt; In Vivo</em&gt; Ensaio diurese no Feminino Adulto<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Os mosquitos

Source: Liu, P., et al. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the process of isolating recombinant Aedes aegypti densovirus (rAaeDV) from infected mosquito-derived epithelial cells. The infected cells are collected and exposed to repeated freeze-thaw cycles for lysis. Lysate is centrifuged, and the supernatant containing viral particles is filtered, aliquoted, and...

Harvesting Recombinant Aedes aegypti Densovirus from Infected Cells

Fonte: Liu, P., et al. Uso de um Densovírus Recombinante de Mosquito como Vetor de Entrega Gênica para a Análise Funcional de Genes em Larvas de Mosquito. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o uso de densovírus recombinantes de mosquito que codificam microRNAs para silenciar genes específicos em larvas de mosquito. Larvas infectadas em estágios iniciais produzem microRNAs funcionais que suprimem a expressão do gene-alvo para estudos posteriores.

Silenciamento Gênico Mediado por Densovírus Recombinante em Larvas de Mosquito

Neste vídeo, demonstramos a entrega da construção do gene drive no embrião do mosquito Anopheles gambiae por meio da técnica de microinjeção de embriões. Este procedimento permite a integração da construção de DNA entregue, por meio de recombinação homóloga, nas células germinativas para gerar uma população de mosquitos transformada.

Microinjeção de embrião de mosquito: uma técnica para entregar DNA exógeno na gema embrionária de Anopheles gambiae para gerar mutações germinativas

Aqui, descrevemos um processo para a inibição da função do gene em vectores mosquitos doença através do uso de quitosano / interferindo nanopartículas de RNA que são ingeridos pelas larvas.

A quitosana / RNA de interferência Nanoparticle Mediated silenciamento gênico na Doença Vector Mosquito Larvas

A interferência de RNA (RNAi) é uma ferramenta extremamente valiosa para descobrir a função do gene. No entanto, a capacidade de direcionar genes usando RNAi durante os estágios pré-adultos é limitada no principal vetor da malária humana, Anopheles gambiae. Descrevemos um protocolo de RNAi para reduzir a função do gene por meio de injeção direta durante o desenvolvimento da pupa.

RNAi gatilho para o interior<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; As pupas

Este protocolo descreve uma metodologia de microinjeção que temos padronizado e utilizado por vários anos para entregar quantidades específicas de ácidos nucleicos diretamente a hemolinfa de mosquitos e moscas domésticas. Este protocolo resulta em mortalidade de injeção mínima e permite medições de dose correlacionado de fecundidade.

Reprodutível dsRNA Microinjection e Bioassay de oviposição em mosquitos e moscas domésticas

O sistema bipartite GAL4-UAS é uma ferramenta versátil para modificação da expressão genética de forma espástica controlada que permite a análise genética funcional em Anopheles gambiae. Os procedimentos descritos para o uso deste sistema são uma estratégia de clonagem semi-padronizada, sexagem e triagem de pupas para marcadores de proteína fluorescente e fixação de embriões.

Usando o sistema GAL4-UAS para genética funcional em Anopheles gambiae

Aprenda a analisar funções gênicas em larvas de mosquito usando densovírus recombinante AaeDV como sistema de entrega de genes. Este método permite superar barreiras extracelulares e intracelulares com alta eficiência de transdução.

Uso de um Mosquito recombinante Densovirus como um vetor de entrega do Gene para a análise funcional de Genes em larvas do Mosquito (Vídeo) | JoVE Journal

Uso de um Mosquito recombinante Densovirus como um vetor de entrega do Gene para a análise funcional de Genes em larvas do Mosquito

Explorar mais vídeos