Manter o Aedes aegypti , mosquitos infectados com Wolbachia

O objetivo geral deste protocolo é descrever a manutenção dos mosquitos Aedes aegypti infectados com Wolbachia. Esses mosquitos estão sendo liberados em todo o mundo para suprimir a transmissão da dengue e de outros vírus. Nosso protocolo para criação de mosquitos Aedes aegypti pode ser usado por qualquer pesquisador interessado em usar mosquitos para experimentos ou programas de controle de doenças.

Este método também pode ser usado para criar mosquitos geneticamente modificados para programas de controle populacional de mosquitos, incluindo aqueles que envolvem liberação estéril de insetos. Os princípios envolvidos nesta abordagem também podem ser aplicados à criação de outras espécies de vetores de doenças. Para este protocolo, abrigue os mosquitos a aproximadamente 26 graus Celsius e a 50 a 70% de umidade relativa com um período fotográfico equatorial.

Se forem criados em temperaturas mais altas, as infecções por Wolbachia podem ser perdidas, portanto, não superaqueça as colônias. Mantenha cerca de 500 mosquitos por população para minimizar a endogamia. Usar este protocolo com nutrição adequada produzirá gerações de 28 dias.

Comece com ovos em um substrato. Mergulhe-os em bandejas contendo três litros de água com cerca de 300 miligramas de comida de peixe e alguns grãos de fermento seco ativo para induzir a eclosão. Um dia após a eclosão, use uma pipeta de vidro para transferir aproximadamente 500 larvas para bandejas contendo quatro litros de água e ração fresca para peixes.

Verifique as bandejas diariamente para garantir que as larvas tenham comida suficiente. Adicione cerca de 600 miligramas de comida de peixe em dias alternados para manter um suprimento ideal de alimentos. A superalimentação pode resultar em turvação da água e, portanto, mortalidade, portanto, substitua a água conforme necessário.

Se a nutrição e as temperaturas forem mantidas corretamente, as larvas se transformarão em pupas cinco a sete dias após a eclosão. E os adultos surgirão aproximadamente dois dias depois. Sete dias após a eclosão, despeje todo o conteúdo da bandeja em uma malha fina.

Retenha um pouco da água filtrada em um recipiente de cinco litros para a posição dos ovos na mesma colônia. Em seguida, inverta a malha e mergulhe-a em um recipiente de plástico com 200 mililitros de água para transferir as pupas. Adicione a quantidade apropriada de alimento para alimentar as larvas restantes.

Agora, monte uma gaiola de emergência adulta com duas xícaras de solução de sacarose a 10% e duas xícaras de bolas de algodão úmidas para evitar a dessecação. Se as pupas não precisarem ser separadas por sexo, transfira o recipiente de pupas para uma gaiola e deixe a tampa entreaberta para que os adultos escapem e entrem na gaiola. Depois que todos os adultos emergirem, remova o recipiente da gaiola.

Não selecione desenvolvedores lentos retirando o contêiner mais cedo. Para coletar mosquitos virgens, transfira as pupas das bandejas de criação de larvas para recipientes plásticos com 200 mililitros de água a cada 24 horas. Classifique os sexos por tamanho.

As fêmeas são maiores que os machos. E transfira-os para recipientes separados. Mantenha as tampas fechadas nos recipientes para que os adultos não escapem.

Antes de liberar os adultos emergentes em suas gaiolas, confirme seu sexo. Adultos com sexo incorreto devem ser removidos usando um aspirador dentro de 24 horas após o despertar, enquanto ainda são sexualmente imaturos. Para manter as colônias infectadas com Wolbachia semelhantes a uma população natural, cruze as fêmeas infectadas do laboratório para os machos selvagens não infectados.

Amadureça os machos e as fêmeas separadamente por dois dias. E então aspire as fêmeas para a gaiola masculina. Idealmente, estabeleça uma proporção de um para um com um tamanho populacional de cerca de 500.

Continue a cruzar os mosquitos por pelo menos três gerações consecutivas. Pelo menos três dias após o surgimento dos últimos adultos, e antes de completarem duas semanas de idade, o sangue alimenta a colônia antes que ocorra uma mortalidade excessiva das fêmeas. Isso é particularmente importante para mosquitos com infecções por Wolbachia que encurtam a vida útil.

Os copos de açúcar devem ser removidos no dia anterior. Dê aos mosquitos acesso a um antebraço e use uma luva de látex para proteger a mão e o pulso. A maioria das fêmeas deve ser alimentada em cinco minutos.

Mas pode levar até 15 minutos. Quando todas as fêmeas estiverem visivelmente ingurgitadas, remova o antebraço e recoloque os copos de açúcar. Dois dias após a alimentação com sangue, coloque dois copos plásticos cheios de água e forrados com uma tira de lixa parcialmente submersa na gaiola.

Em seguida, remova qualquer outra fonte de água, exceto a água com açúcar. As fêmeas ovipositarão na lixa logo acima da linha d'água a partir de três dias após a alimentação sanguínea. Colete e substitua a lixa diariamente até que não haja mais ovos.

Se forem necessários mais ovos, a alimentação sanguínea pode ser realizada em intervalos semanais. Seque parcialmente a lixa com cerca de 30 segundos de secagem suave usando uma toalha de papel. Não desaloje os ovos.

Em seguida, embrulhe as tiras em uma folha de papel toalha seco e coloque-a em um saco plástico lacrado. Três dias após a coleta, inspecione os ovos em um microscópio de dissecação. Se a lixa estiver muito molhada, os ovos podem eclodir antes de serem submersos na água.

Mas se secar muito forte, os ovos podem entrar em colapso. Os ovos estão prontos para eclodir três dias após a coleta. Mergulhe todos os ovos de cada colônia no mesmo recipiente de água para produzir um grande grupo de indivíduos para a próxima geração.

Geralmente, os ovos podem ser armazenados em um recipiente lacrado com umidade superior a 80% a 20 graus Celsius por vários meses. Mas algumas infecções por Wolbachia reduzem a viabilidade, então esses ovos devem ser chocados dentro de uma semana após a coleta. Quando os recipientes de larvas receberam 0,25 miligramas de alimento por larva por dia ou menos, o tempo de desenvolvimento aumentou para ambos os sexos e foi menos sincronizado do que nos recipientes fornecidos com mais alimento.

Se a alimentação adequada não for fornecida durante todo o desenvolvimento, isso afetará negativamente a manutenção da colônia. Indivíduos em desenvolvimento lento podem ser selecionados e a alimentação com sangue pode ser atrasada. Pode até haver aumento da mortalidade adulta antes da reprodução.

A nutrição abaixo do ideal afetou a morfologia adulta. Os comprimentos das asas diminuíram substancialmente e se correlacionaram com os níveis de nutrição. Tamanhos corporais uniformes são importantes para comparações experimentais, pois o tamanho corporal está positivamente associado à fecundidade, e mosquitos grandes devem estar mais aptos em condições de campo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como manter os mosquitos Aedes aegypti infectados com Wolbachia. Seguir nosso protocolo deve garantir que mosquitos saudáveis de qualidade consistente sejam produzidos. Esses mosquitos podem então ser liberados no campo para programas de controle de doenças ou usados para experimentos.

Ao trabalhar com mosquitos infectados por Wolbachia, é importante monitorar seu status de infecção para garantir que as colônias mantenham suas infecções por Wolbachia.