Name: Uma Metodologia de Lesão Mecânica Neuronal Simples para Estudar Drosophila Degeneração do Neurônio do Motor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Aprenda a induzir lesão mecânica em nervos segmentares de larvas de Drosophila para estudar neurodegeneração de neurônios motores. Este método acessível permite visualizar e quantificar eventos celulares na junção neuromuscular.

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Gostaríamos de agradecer a todos os membros do Keller e Magie Labs na Quinnipiac University por sugestões úteis. Em particular, gostaríamos de agradecer Barron L. Lincoln II pelo desenvolvimento deste ensaio de lesões no Keller Lab. Também gostaríamos de agradecer a Quinnipiac University College of Arts and Science Grant-In-Aid concedida à LC Keller.

1. Preparação de Reagentes e Equipamento <ol><li> Prepare 1x tampão de dissecção (NaCl 70 mM, KCl 5 mM, CaCl2 0,02, MgCl2 20 mM, 10 mM de NaHCO3, 115 mM de sacarose, trealose a 5 mM, HEPES a 5 mM; pH 7,2). </li><li> Prepare 1x salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Prepare 1x PBT usando 1x PBS com Triton X-100 a 0,01%. </li><li> Prepare placas de agar de suco de frutas. 14 Em resumo, misture 30 g de agar em 700 mL de H 2 O e autoclave. Dissolver 0,5 g de metilparabeno em 10 mL de etanol e adicionar solução a 300 mL de concentrado de suco de fruta (uva ou maçã). Misture o concentrado na solução de agar autoclavada e despeje nas tampas de placas de Petri de 10 mm x 35 mm. NOTA: A pré-mistura de agar de uva também pode ser comprada de várias empresas (consulte Tabelas de Materiais ). </li><li> Obtenha pinças de tamanho 5 que permitam ferir mecanicamente as larvas. </li><li> Use padrão Drosophila CO 2 </sAparelho de anestesia baseado em ub&gt;. </li></ol> 2. Seleção de Larvas de Drosophila <ol><li> Pegue um frasco ou frasco de Drosophila contendo larvas errantes do terceiro instar que foram cultivadas a 25 ° C. </li><li> Selecione dez larvas individuais de 2º ou 3º instar com base na aparência. As larvas do terceiro estádio podem ser identificadas pelo aparecimento de espirais ramificados anteriores, enquanto as larvas do segundo estádio são menores e possuem mais espirais anteriores do tipo clube. NOTA: Os estádios larvais também podem ser identificados por tempo. A 25 ° C, as larvas do segundo estágio aparecem aproximadamente 48 h após a eclosão, e as larvas do terceiro estádio são aproximadamente 24 horas depois. Se estiver interessado em examinar a neurodegeneração no NMJ, larvas de segundo estádio precisam se machucar. </li></ol> 3. Preparando Larvas de Drosophila para Ferimento Mecânico <ol><li> Escolha cuidadosamente larvas individuais por pinça ou pincel, sendo cautelosoPara não comprimi-lo de qualquer maneira. </li><li> Coloque diretamente dez larvas no prato de vidro contendo 1X PBS frio ou tampão de dissecação para remover quaisquer detritos alimentares e desacelerar a mobilidade larval. </li></ol> 4. Lesões mecânicas e tratamento de Larvas de Drosophila <ol><li> Coloque cada larva individual em um aparelho de anestesia com CO 2 . </li><li> Sob um microscópio de dissecação, rote cuidadosamente cada larva para o lado dorsal para visualizar os nervos segmentares através da cutícula. </li><li> Posicione o tamanho de 5 pinças aproximadamente 1/2 a 2/3 do comprimento da larva a partir dos ganchos da boca. Uma vez posicionado, aperte aproximadamente 1/3 da cutícula ventral contendo os nervos segmentares com pinça do tamanho 5. <ol><li> Para garantir que os nervos segmentares larvais estejam feridos, aplique força suficiente para esmagar os nervos segmentares, mas deixe a cutícula intacta. Para determinar a quantidade correta de força, esmague 10 larvas e assegureA taxa de mortalidade após 5 h é inferior a 50%. </li></ol></li><li> Após lesão, transferir cuidadosamente larvas para uma placa de agar de suco de fruta contendo aproximadamente 0,5 g de pasta de levedura. Coloque cada larva de modo que sua extremidade anterior esteja na pasta de fermento, para alimentação contínua, apesar da motilidade interrompida. NOTA: Para garantir que os nervos segmentares larvais tenham sofrido ferimento, a motilidade da larva interrompida pode ser observada após a transferência para a placa de ágar. A larva lesada é efetivamente paralisada posterior ao local da lesão, mas ainda pode mover os ganchos da boca e se alimentar. Uma taxa de mortalidade elevada de animais após lesão é comum por isso é melhor ferir 20-50% mais animais do que é necessário para uma experiência. </li><li> Coloque placas de agar contendo pasta de levedura e 10 larvas lesadas no fundo de uma placa de Petri vazia de 100 x 15 mm. Cubra esta placa de petri, agora contendo as larvas lesadas em uma placa de ágar com uma toalha de papel úmida, garantindo que a toalha de papel não toque as larvas ou as placas de ágar. Coloque issoPlaca de Petri em um recipiente maior, bem fechado, na RT. </li><li> Recuperar larvas para dissecção após períodos especificados (6, 12 ou 24 h) pós-lesão. NOTA: Para examinar os efeitos imediatos da lesão no citoesqueleto axonal, as larvas podem ser dissecadas diretamente após a lesão. Para examinar defeitos de transporte axonal, as larvas podem ser dissecadas aproximadamente 6 h após a lesão. Cerca de 12 h após a lesão, pode-se observar uma acumulação de proteínas ubiquitinadas e 24 h após a lesão, pode-se observar a degeneração de neurônios motores no NMJ. </li></ol> 5. Análise da Neurodegeneração no NMJ <ol><li> Disselar a larva NMJ de Drosophila como descrito anteriormente. 15 , 16 Em resumo, larvas de pin em uma placa de Sylgard, cortar a superfície dorsal e filé com pinos em uma gota de tampão de dissecação para expor a musculatura da parede do corpo. Fixar larvas em 4% paraformaldeído (PFA) ou solução de Bouin, dependendo do antiCorpos usados ​​para visualizar neurônios e músculos. NOTA: A fixação de PFA deve ser usada se as tags de proteínas fluorescentes, como Green Fluorescent Protein (GFP), devem ser visualizadas, pois o fixador de Bouin pode ser muito severo. </li><li> Execute a imunofluorescência, que foi descrita anteriormente 11 , 13 , 16 , para marcar simultaneamente neurônios motores pré-sinápticos e dobras pós-sinápticas adjacentes (SSR). Visualize membranas pré-sinápticas e axônios com peroxidase de rábano conjugada fluorescentemente (HRP) (1: 300) 17 e as zonas ativas podem ser coradas usando um anticorpo anti-Bruchpilot (Brp) (nc82; 1: 100; Developmental Studies Hybridoma Bank). Simultaneamente, rotine os músculos pós-sinápticos com um anticorpo anti-Dics Large (Dlg) (1: 10.000). 18 </li><li> Execute um ensaio estabelecido para quantificar a neurodegeneração no NMJ como descrito anteriormente. 8 </suP&gt; , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Em breve, visualize simultaneamente NMJs individuais para compartimentos pré e pós-sinápticos. Qualquer coisa marcada com marcadores pós-sinápticos, mas não marcadores pré-sinápticos, indica sites de neurodegeneração ( Figura 1 ). O número médio de boutons por NMJ, bem como o número médio de NMJs por animal pode ser quantificado. </li></ol>

<ol><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophilia%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li>
<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li>
<li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li>
<li>Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).</li>
<li>Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+turnover+of+the+Wallenda%2FDLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).</li>
<li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda%2FDLK+MAP+kinase+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).</li>
<li>Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998(2014).</li>
<li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynactic+is+necessary+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynactic is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li>
<li>Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM+Kinase1+controls+synaptic+stability+downstream+of+the+type+II+BMP+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor.</a> Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).</li>
<li>Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+spectrin+is+essential+for+synapse+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization.</a> Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).</li>
<li>Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+presynaptic+giant+Ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+or+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).</li>
<li>Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+that+enhance+synapse+stability+despite+persistent+disruption+of+the+spectrin%2Fankryin%2Fmicrotubule+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).</li>
<li>Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/9/pdb.rec065672.short">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19329927">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Smith, R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+imaging+of+active+zones+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li>
<li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A lesão mecânica neuronal descrita anteriormente e demonstrada aqui pode ser utilizada para induzir lesão / estresse nos nervos segmentares das larvas de Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Esta técnica experimental tem sido empregada anteriormente para dissecar a seqüência temporal de eventos que conduzem à neurodegeneração, bem como para examinar as alterações transcricionais nos corpos cel...

A degeneração neuronal ocorre durante o desenvolvimento normal e pode ser causada pelo processo de envelhecimento natural, lesão, estresse ou estados de doença. Drosophila melanogaster , a mosca comum da fruta, fornece um organismo modelo simples e poderoso para estudar a neurodegeneração devido às semelhanças notáveis ​​nos mecanismos moleculares que conduzem à degeneração dos neurônios. Essas semelhanças são destacadas pelo fato de que aproximadamente 70% dos genes humanos associados à doença possuem um homólogo de Drosophila . 1 Além disso, vários ensaios e ferramentas tecnológicas para estudar doenças neurodegenerativas humanas foram desenvolvidos e utilizados em Drosophila . 2 , 3 Dentro da Drosophila , a junção neuromuscular (NMJ) permite a análise de propriedades celulares e eletrofisiológicas e provou ser um sistema importante para estudar doença neuromuscular devido ao visível nConexões euron-músculo. 2 Neste estudo, descrevemos um ensaio de lesão de neurônio in vivo em larvas de Drosophila que permite a lesão reprodutível dos nervos segmentares. Esta lesão do motoneurão resulta em uma seqüência temporal de eventos celulares, resultando em neurodegeneração na lesão NMJ 24 h pós. A capacidade de reproduzir os motoneurônios lesionados resultando em neurodegeneração tem diversas aplicações, como a identificação de genes específicos necessários para o processo degenerativo, a dissecação de respostas transcripcionais à lesão neuronal e a análise de cascatas de sinalização protetora. 4 , 5 , 6 Este método também foi usado em combinação com microfluidics para estudar degeneração neuronal e regeneração em animais vivos. 7 Utilizamos um ensaio quantitativo estabelecido para examinar o degenerato do neurônio motorIon na Drosophila NMJ após lesão mecânica. Este ensaio baseia-se no facto de a perda de membrana pré-sináptica e as proteínas precedem a desmontagem do retículo subsináptico (SSR) caracterizada pelas dobras da membrana do músculo pós-sináptico. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Este ensaio permite a quantificação de &quot;pegadas sinápticas&quot; onde o neurônio pré-sináptico perdeu a conexão com o músculo pós-sináptico adjacente. O processo degenerativo mostrou ser progressivo em todo o desenvolvimento larval 12 e não pode ser explicado pelo desenvolvimento alterado de sinapse ou brotação. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 O anúncioA vantagem de usar lesões mecânicas em mutações preexistentes é que permite a dissecção da seqüência temporal de eventos celulares que conduzem à neurodegeneração no NMJ. 13

<table><tbody><tr><td>Tesoura de microdissecação</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Fórceps</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>11231-30</td><td>Algumas pessoas preferem o tamanho 3, enquanto outras preferem o tamanho 5</td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>11251-30</td><td>Algumas pessoas preferem o tamanho 3, enquanto outras preferem o tamanho 5</td></tr><tr><td>CO2 Tanque de Ar Tech</td><td>Air</td><td>UN 1013</td><td>Vários tamanhos de tanques podem ser adquiridos</td></tr><tr><td>CO2 Aparelho</td> de anestesia <td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Pinos de aço inoxidável, tamanho 0.1</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>SylGard 184 Elastômero de silicone, base e agente de cura</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Para derramar placas de dissecação</td></tr> Solução <tr><td>de Bouin</td><td>Sigma</td><td>HT 10132-1L</td><td>Os anticorpos devem ser testados quanto à sua eficiência em Bouin e PFA</td></tr><tr><td>4% Paraformaldeído (PFA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>FLY-8030-20</td><td>Os anticorpos devem ser testados quanto à sua eficiência em Bouin e PFA</td></tr><tr><td>Microscópio Estereoscópico de Dissecação</td><td>AmScope</td><td>SM-1BZ</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de Luz</td><td>AmScope</td><td>HL150-AY-220V</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-nc82</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma</td><td>nc82-s</td><td></td></tr><tr><td>anti-discos grande anticorpo</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma</td><td>AF3</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor anti-peroxidase de rábano</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td><td>Você pode Alexa Fluor&reg; 488, 594 ou 647</td></tr><tr><td>Flystuff Suco de Uva Ágar Pré-mistura</td><td>Genesee Scientific</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-101</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverstiles</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-87</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Utility Box</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-484C</td><td>Usado para criar câmara úmida para recuperação larval</td></tr></tbody></table>

uma metodologia de lesão mecânica neuronal simples para estudar<em&gt; drosophila</em&gt; degeneração do neurônio do motor

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A degeneração dos neurônios ocorre durante o desenvolvimento normal e em resposta a lesões, estresse e doença. As características celulares da degeneração neuronal são notavelmente semelhantes em humanos e invertebrados, assim como os mecanismos moleculares que conduzem esses processos. A mosca da fruta, Drosophila melanogaster , fornece um organismo modelo genético poderoso e simples para estudar as complexidades celulares das doenças neurodegenerativas. Na verdade, aproximadamente 70% dos genes humanos associados à doença possuem um homólogo de Drosophila e uma infinidade de ferramentas e ensaios foram descritos usando moscas para estudar doenças neurodegenerativas humanas. Mais especificamente, a junção neuromuscular (NMJ) em Drosophila provou ser um sistema eficaz para estudar doenças neuromusculares devido à capacidade de analisar as conexões estruturais entre o neurônio e o músculo. Aqui, relatamos um teste de lesão do neurônio motor in vivo em Drosophila , queInduz de forma reprodutiva neurodegeneração no NMJ por 24 h. Usando essa metodologia, descrevemos uma seqüência temporal de eventos celulares resultando em degeneração de neurônio motor. O método de lesão tem diversas aplicações e também foi utilizado para identificar genes específicos necessários para a neurodegeneração e para dissecar as respostas transcricionais à lesão neuronal.

Usando o procedimento apresentado aqui, demonstramos que a lesão neuronal mecânica permite a dissecção temporal de eventos neurodegenerativos. 14 , 18 A sequência de eventos foi previamente caracterizada e começa com uma ruptura imediata do citoesqueleto, seguida de defeitos de tráfico axonais, acumulação de proteínas ubiquitinadas e posterior neurodegeneração 24 h pós-lesão. Antes da lesão, WT NMJ mostra o marcador de zona activ...

Aqui, descrevemos um método simples e amplamente acessível para ferir nervos segmentares em larvas de Drosophila para visualizar e quantificar neurodegeneração de neurônios motores na junção neuromuscular (NMJ) de larvas de terceiro estádio.

Uma Metodologia de Lesão Mecânica Neuronal Simples para Estudar<em&gt; Drosophila</em&gt; Degeneração do Neurônio do Motor

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

O objetivo geral deste procedimento é induzir lesão mecânica de neurônios motores em larvas de Drosophila. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de pesquisa neurodegenerativa, como a sequência temporal dos eventos celulares que levam à neurodegeneração. As principais vantagens desta técnica são seu baixo custo e o uso de equipamentos que a maioria dos laboratórios de Drosophila já possui.As implicações dessa técnica estendem-se à compreensão dos mecanismos moleculares que impulsionam a neurodegeneração. Para iniciar o protocolo, selecione 10 larvas do segundo ou terceiro estágio de desenvolvimento de um frasco ou garrafa de Drosophila contendo larvas do terceiro estágio errantes que foram cultivadas a 25 graus Celsius. Use pinças para levantar cuidadosamente larvas individuais com pinças ou um pincel, sem comprimi-las.Coloque diretamente as 10 larvas em um recipiente de vidro contendo PBS 1x frio para remover qualquer resíduo de alimento e reduzir a motilidade larval. Identifique as larvas de terceiro estágio por seus espiráculos anteriores ramificados e as larvas de segundo estágio pelo tamanho menor e espiráculos anteriores em forma de clube. Coloque cada larva em um aparelho anestesiante de CO2.Sob um microscópio estereoscópico, gire cuidadosamente cada larva para o lado dorsal a fim de visualizar os nervos segmentares através da cutícula. É essencial girar cuidadosamente cada larva para o lado dorsal para poder visualizar os nervos segmentares através da cutícula antes da lesão. Começando nos ganchos bucais, posicione uma pinça nº 5 aproximadamente na metade até dois terços do comprimento da larva.Uma vez posicionado, pinça aproximadamente um terço da cutícula ventral contendo os nervos segmentares com pinça nº 5. Para garantir que os nervos segmentares das larvas sejam lesados, aplique força suficiente para esmagar os nervos segmentares, mas mantenha a cutícula intacta. Para determinar a quantidade correta de força, esmague 10 larvas e verifique se a taxa de mortalidade após cinco horas é inferior a 50%. Após a lesão, transfira cuidadosamente as larvas para uma placa de ágar suco de fruta contendo aproximadamente 0,5 gramas de pasta de levedura.Posicione cada larva de modo que sua extremidade anterior esteja sobre a pasta de levedura para alimentação contínua. Coloque placas de ágar contendo pasta de levedura e 10 larvas lesionadas no fundo de uma placa de Petri vazia de 100 por 15 milímetros. Cubra a placa de Petri com uma toalha de papel úmida, garantindo que a toalha de papel não toque nas larvas nem nas placas de ágar.Em seguida, coloque a placa de Petri em um recipiente hermético à temperatura ambiente. Por fim, recupere as larvas para dissecação após períodos específicos pós-lesão. Antes da lesão, as junções neuromusculares de tipo selvagem, ou JNM, mostram o marcador da zona ativa pré-sináptica Brp em oposição ao marcador pós-sináptico Dlg em toda a extensão da JNM.A lesão mecânica de nervos segmentares pode induzir uma neurodegeneração moderada a grave, na qual botões corados com Dlg agora carecem da proteína da zona ativa pré-sináptica Brp. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores que estudam lesões neuronais explorarem a sequência temporal dos eventos celulares que levam à neurodegeneração na junção neuromuscular em Drosophila.

a-simple-neuronal-mechanical-injury-methodology-to-study-drosophila

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Neurociência

A junção neuromuscular da Drosophila (NMJ) é usada como modelo para estudar a morfologia e a função das sinapses. Este vídeo descreve características importantes que os pesquisadores quantificam para caracterizar o NMJ. O protocolo de exemplo demonstra um software capaz de realizar a quantificação automaticamente.

drosófila Quantificação da Junção Neuromuscular (NMJ): Um Método para Avaliar a Morfologia e Função Sináptica

Este vídeo descreve a ablação a laser de dois fótons de axônios em uma larva de Drosophila melanogaster e um exemplo de protocolo para induzir lesão e imagem do local da lesão.

Lesão neural induzida por laser de dois fótons: um método para observar a degeneração e regeneração do axônio em larvas de Drosophila

O vídeo demonstra a indução de neurodegeneração nos nervos segmentares da larva de Drosophila por meio de lesão mecânica. A cutícula ventral das larvas anestesiadas é pinçada com uma pinça para causar lesão aos nervos segmentares. As larvas lesadas são mantidas com alimentos, permitindo que a lesão cause degeneração dos neurônios motores nos nervos, causando ruptura de suas junções neuromusculares (JNMs).

Lesão mecânica de nervos segmentares de larvas de Drosophila para induzir neurodegeneração

Este vídeo demonstra um protocolo para avaliar a integridade estrutural das junções neuromusculares nos músculos dorsais longitudinais de Drosophila. O procedimento envolve a coloração de neurônios e músculos com dois anticorpos distintos e a comparação de padrões de fluorescência entre moscas mutantes e selvagens. Uma redução na coloração neuronal em moscas mutantes indica neurodegeneração, enquanto a estrutura muscular permanece intacta.

Avaliação da integridade estrutural das junções neuromusculares do músculo longitudinal dorsal em Drosophila

Um paradigma lesão utilizando a Drosophila larval cordão nervoso ventral para investigar a regeneração do sistema nervoso central e de reparação é descrito. Stabbing seguido por varredura a laser microscopia confocal em amostras de lapso de tempo e fixa, combinada com a análise quantitativa, com software desenvolvido propositadamente e genética, são utilizados para investigar os mecanismos moleculares do CNS regeneração e reparo.

Um Paradigma para Investigar Lesão de reparação do sistema nervoso central em<em&gt; Drosophila</em

Larvas de Drosophila são um sistema modelo atraente para geração de imagens ao vivo devido à sua cutícula translúcido e genética poderosas. Este protocolo descreve como utilizar um dispositivo de PDMS de camada única, o chamado "chip larva 'para geração de imagens ao vivo de processos celulares dentro de neurônios do 3 º instar as larvas Drosophila.

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Aqui, apresentamos um protocolo utilizando a drosófila neurônio sensorial - modelo de lesão do neurônio arborização dendrítica (da), que combina na vivo ao vivo de imagens, dois fotões do laser axotomy/dendriotomy e poderoso toolbox genético mosca, como uma plataforma para a seleção de potenciais promotores e inibidores de Epilepsias.

Um modelo de lesão in vivo em Drosophila para estudar a neuroregeneração do sistema nervoso periférico e central

Descrevemos um método para rastreamento retrógrado dos neurônios motores embrionários Drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos.

Rastreamento retrógrado de neurônios motores embrionários drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos

Aqui, fornecemos protocolos para realizar três ensaios simples de degeneração de axôntoinduzidos induzidos por lesões (morte de axônto) em Drosophila melanogaster para avaliar a preservação morfológica e funcional de axôntos cortados e suas sinapses.

Avaliação morfológica e funcional de Axons e suas sinapses durante a morte de Axon em Drosophila melanogaster

O objetivo deste procedimento é dissecar o tecido do músculo longitudinal dorsal (DLM) para avaliar a integridade estrutural das junções neuromusculares DLM (NMJs) em modelos de doenças neurodegenerativas utilizando Drosophila melanogaster.

Visualização da Degeneração Sináptica em Drosophila Adulta em Associação com Neurodegeneração

Descrevemos uma técnica de dissecção que preserva a arquitetura da junção neuromuscular e permite um estudo imunocitoquímico detalhado dos neurônios motores na perna de Drosophila adulta.

Dissecção e Imunohistoquímica da Perna Adulta Drosophila para detectar alterações na junção neuromuscular para um neurônio motor identificado

Aprenda a induzir lesão mecânica em nervos segmentares de larvas de Drosophila para estudar neurodegeneração de neurônios motores. Este método acessível permite visualizar e quantificar eventos celulares na junção neuromuscular.

Uma Metodologia de Lesão Mecânica Neuronal Simples para Estudar

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