In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos

O objetivo geral deste procedimento é determinar a localização, abundância e fenótipo de células T CD8 positivas específicas para antígeno nos tecidos de interesse. Este método ajuda a responder rapidamente perguntas sobre células T CD8, fornecendo um meio para localizar, quantificar e caracterizar fenotipicamente virtualmente qualquer célula T CD8 específica para antígeno em qualquer tecido. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a determinação da distribuição espacial de células T CD8 positivas específicas para antígeno em relação a outras células e estruturas nos tecidos de interesse.

Quem demonstrará o procedimento junto com Shengbin Li será Gwantwa Mwakalundwa. No primeiro dia do procedimento, utilize um bisturi para cortar o tecido fresco em pedaços de aproximadamente 0,5 x 0,5 centímetro. Aqui, é mostrado o tecido do baço de macaco-rufo.

Cole separadamente cada fragmento de tecido no centro da parte superior de um êmbolo e incorpore as amostras em três a cinco mililitros de agarose de baixo ponto de fusão a 4% aquecida em PBS. Identifique os êmbolos com as informações relevantes do tecido. Em seguida, coloque as amostras em um suporte refrigerado dentro de um balde de gelo.

Quando o ágar solidificar, ligue o micrótomo e defina a espessura para 200 micrômetros. Após instalar uma lâmina de barbear nova, insira os êmbolos no banho do micrótomo. Encha o banho do micrótomo com 100 a 200 mililitros de PBS-H recém-preparado e adicione cubos de gelo de PBS-H para manter a temperatura entre zero e dois graus Celsius.

Após obter seções de 200 micrômetros, use um pincel para remover o ágar ao redor de cada seção e transfira as amostras para câmaras teciduais individuais dentro de poços individuais de uma placa de cultura celular de 24 poços contendo um mililitro de PBS-H gelado. Quando todas as amostras tiverem sido coletadas, incube as seções teciduais durante a noite em um mililitro de tetrameros de classe I de MHC carregados com peptídeo conjugado a fluoróforo, diluídos em PBS-H suplementado com 2% de soro normal de cabra, a quatro graus Celsius, com agitação. Na manhã seguinte, transfira cada câmara tecidual para poços individuais de uma nova placa de 24 poços contendo um mililitro de PBS-H fresco e gelado, por 20 minutos.

Após a segunda lavagem, fixe as seções em um mililitro de paraformaldeído a 4% fresco por duas horas à temperatura ambiente. Em seguida, realize duas lavagens de cinco minutos em PBS-H frio. Transfira as seções para uma nova placa de 24 poços contendo ureia 0,01 molar e aqueça as seções no micro-ondas três vezes, cerca de 10 segundos cada vez, até que a ureia entre em ebulição.

Para permeabilizar e bloquear as amostras, incube as seções na solução de bloqueio contendo PBS-H suplementado com 0,3% de detergente Triton X100 e 2% de soro normal de cabra em agitador durante uma hora, a quatro graus Celsius. Ao final da incubação, transfira as câmaras de tecido para poços individuais de uma nova placa de 24 poços contendo um mililitro de solução contendo anticorpo anti-FITC de coelho, anticorpo anti-CD humano de camundongo e anticorpo anti-CD3 humano de rato. Incube as amostras durante a noite a quatro graus Celsius com agitação.

No terceiro dia, lave as seções três vezes em PBS-H fresco a quatro graus Celsius por pelo menos 20 minutos por lavagem e realize uma incubação final com os anticorpos secundários conjugados à fluorescência apropriados por até três dias, protegidos da luz. Ao final da incubação com o anticorpo terciário, enxágue as amostras com três lavagens de 20 minutos em PBS-H fresco e use um pincel para transferir as amostras de cada câmara tecidual para uma lâmina de microscópio de vidro. Revesta cada seção com meio de montagem suplementado com um conservante de fluoróforo e cubra as amostras com uma lamínula.

Em seguida, armazene as lâminas em um recipiente para lâminas protegido da luz, a 20 graus Celsius. No dia da aquisição de imagens, coloque a primeira lâmina sobre a platina de um microscópio confocal e selecione os lasers e filtros apropriados para cada fluoróforo utilizado para marcar a amostra de tecido. Utilizando a objetiva de 20x, obtenha sequencialmente uma série z em intervalos de três mícrons em cada um dos canais de fluoróforo, em múltiplos campos de 800 x 800 pixels.

Em seguida, construa um mosaico dos campos coletados e salve cada imagem do mosaico com um nome baseado na amostra de tecido correspondente. Nessas imagens representativas, uma seção corada com tetrâmeros de MHC classe I carregados com um peptídeo de SIV é comparada a uma seção do mesmo tecido, corada com tetrâmeros de MHC classe I carregados com um peptídeo irrelevante, demonstrando a especificidade da coloração com tetrâmero. Nessas imagens, as células T específicas pelo vírus coradas com tetrâmero de MHC classe I carregado com peptídeo de SIV apresentam coloração dupla para CD8, um marcador de subpopulação de células T, mas não para CD20, uma proteína de superfície celular expressa em células B.

Esta montagem foi criada a partir de múltiplos campos de séries z confocais, que foram utilizados para a quantificação de células marcadas com tetrâmero com fenótipos específicos e em diferentes compartimentos anatômicos do linfonodo. Esta imagem ampliada destaca uma região da montagem do linfonodo que contém um folículo folicular delineado pela marcação de IGM. Células marcadas com tetrâmero da classe I do MHC, algumas das quais coexpressavam o marcador de ativação e proliferação de linfócitos T, KI67, podem ser detectadas dentro e fora do folículo de células B.

Essa combinação de coloração permite a determinação dos estados de ativação e proliferação de linfócitos T CD8 positivos específicos para o VSI, bem como sua localização nos tecidos linfoides secundários. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em aproximadamente cinco dias, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o tecido fresco é essencial para uma coloração bem-sucedida.

Processe as amostras em até 24 horas após a coleta, mantendo-as refrigeradas até a fixação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a coloração com tetrâmero e imuno-histoquímica para determinar a localização, abundância e fenótipo de linfócitos T CD8 positivos específicos para antígenos nos tecidos de interesse. Não se esqueça de que trabalhar com agentes infecciosos pode ser extremamente perigoso e que precauções para prevenir exposição, como o uso de equipamentos de proteção individual apropriados e a limitação do uso de materiais perfurocortantes, devem sempre ser adotadas durante a realização deste procedimento.