Name: In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a técnica de coloração in situ com MHC-tetramero para localizar, quantificar e caracterizar fenotipicamente células T CD8 antígeno-específicas em tecidos. Este método permite mapear a distribuição espacial dessas células em amostras de baço de macaco rhesus.

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Este trabalho foi apoiado pelo serviço de saúde pública concede a partir do National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

1. dia 1: corte de tecido fresco e incubação primário <ol><li>uso um bisturi para cortar o tecido fresco em pedaços pequenos (aproximadamente 0,5 cm de largura por 0,5 cm de altura). Separadamente cada tecido para um êmbolo de cola e incorporá-los com 3-5 mL de agarose de baixo ponto de fusão de 4% em PBS. Rotule o êmbolo com a informação do tecido usando um adesivo. Colocá-lo em um suporte refrigerado em um balde de gelo para solidificar o.</li>
	<li>Ativar o micrótomo e defina a espessura das seções a 200 µm. Instale uma lâmina de barbear o micrótomo e insira o êmbolo montada com tecido no banho de micrótomo.</li>
	<li>Preparar o tampão fosfato salino com heparina (PBS-H) adicionando-se 100 µ g/mL ou 18,7 U/mL heparina para PBS para preservar o RNA e para permitir que aplicações potenciais ISH a jusante. Encher a banheira do micrótomo, cobrindo o tecido incorporado, com 100-120 mL de PBS estéril, refrigerado-H. Adicione cubos de gelo de PBS-H para o banho para manter a temperatura em 0 - 2 ° C. Start o micrótomo e corte o tecido em 200 µm seções. 
	Nota: É importante manter os tecidos refrigerados no gelo para minimizar a atividade celular nos tecidos e porque o tecido fresco é mais fácil de seção quando é tranquilo. PBS sozinho pode ser usado se não existem planos para jusante ISH.</li>
	<li>Como alternativa, para tecidos que não cortadas com um micrótomo (por exemplo, intestino e pulmão), usar um bisturi ou lâmina de barbear para cortar o tecido em tiras finas como perto possível a 200 µm.</li>
	<li>Rotular a tampa das placas de cultura de tecidos de 24-bem com a informação da amostra experimental e colocar as câmaras de tecido em poços correspondentes. Use um pincel para transferir as seções para uma câmara de tecido conjunto no poço de uma placa de cultura de tecidos de 24-poço contendo 1 mL de refrigerados PBS-H. 
	Nota: As câmaras de tecido reutilizável devem ser feitas antes de iniciar a coloração. Câmaras de tecido podem ser feitas usando um tubo de snap-cap 14 mL polipropileno fundo redondo e engranzamento de fio. Use uma lâmina afiada para cortar a parte inferior de um tubo de snap-cap 14 mL polipropileno fundo redondo. Corte a malha de arame em um círculo para caber o buraco no fundo do tubo. O círculo de malha de arame usando um bico de Bunsen, até ficar em brasa de calor. Definir o círculo de malha de arame para baixo muito rapidamente e empurre o tubo para dentro da malha. Verifique se o engranzamento de fio é firmemente ligado ao fundo do tubo e então cuidadosamente cortar o topo do tubo na marca de 3 mL, usando uma lâmina de barbear afiada. Coloque até 3 seções de tecido em cada câmara de tecido, ou até 1 cm 2 de tecido por bem. Manter pelo menos um poço vazio entre poços com combinações de anticorpos diferentes para evitar a contaminação cruzada.</li>
	<li>Proceder ao primário tetrâmero e anticorpo que mancha imediatamente depois de terminar a transferência de todas as seções cortadas em câmaras de tecidos. Manter as seções submerso e refrigeradas em 1 mL de PBS-H em todos os momentos.</li>
	<li>Incubar as seções de tecido durante a noite com 0,5 µ g/mL de conjugado FITC, peptídeo-carregado MHC-eu tetrâmeros diluídos em PBS-H, com 2% de soro de cabra normal (NGS). Incluir o mouse ou outros anticorpos de coelho não dirigidos a epitopos extracelulares de interesse nesta incubação (por exemplo, os anticorpos de anti-CD8 rato diluída a 1: 500 em PBS-H, com 2% NGS). Coloque 1 mL de anticorpos diluídos em cada poço. 
	Nota: Tenha cuidado ao selecionar o CD8 anticorpos, como alguns podem realçar e alguns podem inibir tetrâmeros MHC ligação a receptores de células T 4 , 21. O anticorpo de CD8 anti-humano rato descrito aqui é instável e às vezes resulta em coloração um pouco fraco. Ele é usado aqui para etiquetar triplo, porque é o único não-coelho e anticorpos de CD8 sem mouse testaram que as células T CD8 de macaco reso manchada.</li>
	<li>Use 1 mL de solução por alvéolo para o anticorpo primário e incubação do subsequentes todas as e realizar isso e todos incubação do subsequente a 4 ° C, com as placas em uma plataforma oscilante. 
	Nota: Os tecidos devem flutuar livremente na câmara.</li>
</ol> 2. Dia 2: Fixação e incubação secundário <ol><li>após a incubação primária, lavar as seções duas vezes com 1 mL de PBS-H refrigerado por 20 min a cada lavagem. Para fazer isso, transferindo as câmaras de tecido para uma placa de cultura de tecido de 24-bem diferente contendo 1 mL de PBS-H refrigerado em poços correspondentes. 
	Nota: Tenha cuidado para não pingar o conteúdo de uma amostra experimental em outro quando se deslocam entre as câmaras de tecido. Para todos os subsequentes incubação do e lavagens, da mesma forma transferi a câmara de tecido para um prato limpo, contendo a solução adequada. Certifique-se de monitorar as seções nas câmaras de tecido durante o procedimento para certificar-se de que as seções não ficar preso aos lados das câmaras de tecido. Se eles, empurrá-los de volta para a solução.</li>
	<li>Corrigir as seções com 1 mL de fresco tampão PBS paraformaldeído 4% para 2 h à temperatura ambiente (não excessivamente corrigir). Lavagem com PBS-H frio duas vezes por 5 min. 
	Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; usar equipamento de protecção adequado. 
	Nota: Se a recuperação do antígeno e permeabilização é necessária para detectar intracellular epitopes, antígenos podem ser recuperados por ebulição as seções em ureia de mol 0,01 após a fixação do paraformaldehyde.</li>
	<li>Transferir as seções em placas de cultura 24-poço contendo ureia de mol 0,01 e colocar estas placas em um forno de microondas. Ferva as seções três vezes por cerca de 10 s cada um, para um total de 30 s. 
	Nota: Tenha muito cuidado, como ferver a solução pode forçar as seções fora dos poços. Se isso acontecer, use um pincel de adiar as seções das paredes da câmara de tecido ou da tampa da placa na parte inferior da câmara de tecido apropriado.</li>
	<li>Prévio para a incubação do anticorpo secundário, permeabilize e bloquear as secções de tecido incubando-os em solução de bloqueio contendo PBS-H, 0,3% de detergente (PBS-H-T) e 2% NGS sobre um roqueiro para 1 h a 4 ° C. Perform subsequente incubação do anticorpo com NGS PBS-H-T/2%.</li>
	<li>Para a incubação secundária, transferir as seções nas câmaras de tecido para poços contendo coelho anti-FITC 1:10,000 de anticorpo diluído em NGS PBS-H-T/2%. Incubar durante uma noite.</li>
	<li>Perform counterstaining usando anticorpo anti-CD20 de rato diluído 1: 200 em PBS-H-T/2% NGS. Para essa opção, recuperar os epítopos, se necessário, permeiam as células e bloquear antes esta incubação, conforme descrito acima.</li>
</ol> 3. Dia 3: Incubação terciária <ol><li>após a segunda incubação, lavar as seções três vezes em PBS-H a 4 ° C, durante pelo menos 20 min.</li>
	<li>Realizar uma incubação final com o apropriado fluorescente etiquetado anticorpos (por exemplo, de cabra anticoelho conjugado amarelo esverdeado, cabra anti-rato conjugados tintura muito vermelha e cabra anti-rato tintura verde conjugado anticorpos diluído 1:5, 000, 1:5, 000 e 1:2, 000, respectivamente, em PBS-H-T/2% NGS). Incubar durante uma noite. 
	Nota: neste ponto, a incubação pode ser estendida por até três dias se necessário. Manter as seções protegidas da luz envolvendo as placas em folha de estanho durante este incupasso bation e, posteriormente, como luz sacia fluorophores.</li>
</ol> 4. Dia 4: As seções de montagem <ol><li>lavar as seções três vezes em PBS-H pelo menos 20 min. 
	Nota: Se o planejamento para a jusante ISH 19, corrigir as seções em paraformaldeído 4% para 1 h para garantir os tetrâmeros e anticorpos no lugar e depois lavar as seções duas vezes com PBS-H por 5 min cada. 
	Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; usar equipamento de protecção adequado.</li>
	<li>Usar um pincel para transferir as seções para uma lâmina de microscópio. Tenha cuidado para não cutucar o tecido demais. Cubra cada seção com glicerol/gelatina contendo 4 mg/mL de n-propil galato ou outro meio de montagem, contendo um fluoróforo conservante. Cobrir com uma lamela.</li>
	<li>Armazenar os slides em um recipiente protegido contra luz slide em -20 ° C. Lave as placas de cultura de tecidos e remover os rótulos nas tampas usando álcool. 
	Nota: As placas podem ser reutilizadas..</li>
</ol> 5. Aquisição de imagens de microscópio Confocal <ol><li>captura imagens de alta resolução com um microscópio confocal, usando o apropriado lasers e filtros para cada fluoróforo ( figura 1A e B). 
	Nota: Neste exemplo, um microscópio confocal (consulte a Tabela de materiais) foi usado. Imagens foram coletadas usando o 561 nm laser em 20% de energia para as células de T de antígeno-específicas rótulo amarelo esverdeadas, o laser de 488 nm em potência de 10% para as células B CD20-expressando de rótulo verde e 640 nm laser em 15% de energia para as células T CD8 de longe com rótulo vermelho. Utilizaram-se os 20 X objetivo e uma abertura numérica de 0,8.</li>
	<li>Sequencialmente coletar intervalos de z-série em 3 µm (ou outro) em três canais em vários campos de 800 x 800 pixels. Construir uma montagem dos campos coletados ( Figura 1 -E). Nomeie cada imagem de montagem com base nas informações do slide correspondente e salvar para análise.</li>
	<li>Realizar a análise quantitativa de imagem usando o software de análise e quantificação do respectivo microscópio confocal ou ImageJ.</li>
</ol> 6. Análise quantitativa de imagem Nota: análise quantitativa de imagem pode ser realizado usando software de análise e quantificação do microscópio confocal ou usando o software ImageJ. Aqui, o ImageJ foi usado como exemplo.
Montagem de <ol><li>aberto por confocal arrastando-o para a janela do ImageJ ( Figura 2A). 
	Nota: ImageJ pode abrir diretamente montagens coletadas por muitos diferentes microscópios confocal. Se a montagem não pode ser aberta diretamente pelo ImageJ, exportar o z-scan selecionado como um arquivo TIFF para abri-la</li>
	<li>Duplicar o z-scan selecionado para análise (&#34; imagem &#34;-&#62; &#34; duplicar &#34;) ( Figura 2B).</li>
	<li>Dividir os diferentes canais (&#34; imagem &#34;-&#62; &#34; cor &#34;-&#62; &#34; Split canais &#34;) ( Figura 2).</li>
	<li>Desenhar o ROI da análise quantitativa no canal correspondente para ser objectivo e adicioná-lo ao gerente do ROI pressionando &#34; T &#34; no teclado. Medir a área de. 
	Nota: O Gerenciador de ROI do ImageJ mostra a área em µm 2 ( Figura 2D).</li>
	<li>Ajustar o brilho da fluorescência e contraste do canal a ser analisado (&#34; imagem &#34;-&#62; &#34; ajuste &#34;-&#62; &#34; brilho/contraste &#34;) ( Figura 2E).</li>
	<li>Achatar o ROI na imagem (&#34; Gerenciador de ROI &#34;-&#62; &#34; Flatten &#34;) ( Figura 2F).</li>
	<li>Quantificar as células positivas a imagem usando o &#34; multi-ponto &#34; ferramenta ( Figura 2).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

IST combinada com IHC fornece uma ferramenta essencial para detectar, caracterizar e quantificar as células T CD8 de antígeno-específicas em ambientes nativos com o contexto de outras células e estruturas do tecido. Aqui, descrevemos os procedimentos detalhados para IST combinada com IHC, seguido de análise quantitativa de imagem, para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T CD8 de antígeno-específicas em linfonodos de macacos rhesus. Coloração semelhante pode ser aplicada ao ser humano, rato, ou out...

As células T são essenciais para muitos processos imunológicos, incluindo a detectar e eliminar as células infectadas por vírus, evitando a auto-imunidade, auxiliando na produção de células B e células plasmáticas de anticorpos e detectar e eliminar as células cancerosas. O desenvolvimento de peptídeo/MHC classe I tetrâmero coloração de antígeno-específicas1 as células T CD8 e o mais recente desenvolvimento de MHC classe II tetrâmero coloração de células T CD42 por citometria de fluxo revolucionou a nossa capacidade de estudar e compreender o Immunobiology de células T. Embora extremamente útil para a determinação da quantidade e do fenótipo das células de T antígeno-específicas, citometria de fluxo não permitir a detecção da localização espacial das pilhas de T antígeno-específicas para outras células e estruturas nos tecidos e atual técnicas de desagregação para extrair as células T necessários por citometria de fluxo tem limitada eficácia em tecidos não-linfoides3.
Nós e os outros têm desenvolvido métodos usando peptídeo carregado MHC-classe I e classe tetrâmero II ou multimer reagentes para manchar as células CD8 e CD4 T antígeno-específicas em tecidos4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST estes métodos permitem a determinação do local, abundância e fenótipo de células CD8 e CD4 T antígeno-específicos tecidos e fornecer um meio para detectar dessas células em relação a outras estruturas nos tecidos e células. Nosso grupo tem usado extensivamente MHC-eu tetrâmero coloração para estudar o vírus de imunodeficiência humana (HIV) - e o vírus da imunodeficiência símia (SIV) - células T CD8 específicas nos tecidos linfoides, genitais e retais para obter uma compreensão do HIV e SIV imunopatogênese e para identificar correlações de vacinação bem sucedida estratégias14,15,16,17. Além disso, também desenvolvemos uma técnica que combina o IST com hibridação in situ (ISH) para localizar e quantificar as células T CD8 de vírus específicos e células infectadas por vírus em tecidos e para determinar os níveis de efetor-alvo na vivo 18 , 19.
Aqui, descrevemos um protocolo utilizando peptídeo carregado MHC-eu tetrâmeros manchar as células T CD8 de antígeno-específicas em secções de tecido fresco, para tecidos de corante de contraste usando IHC e quantificar células com fenótipos específicos em compartimentos de tecido específico. Estes procedimentos são os mesmos que foram utilizados em nossa recente publicação por Li et al, em que determinamos a localização, abundância e fenótipo de células T específicas SIV em tecido linfoide durante a infecção crônica do SIV em macacos20.
Para este procedimento, tecidos frescos são seccionados e incubados durante a noite com MHC do peptide-carregado-eu tetrâmeros conjugados a moléculas de tiocianato de fluoresceína (FITC). Então, eles são fixos em paraformaldeído. Após a fixação do tecido, o sinal de tetrâmeros o MHC é amplificado usando anticorpos de coelho anti-FITC e incubadas com fluorescente etiquetados anticorpos IgG anticoelho que mais amplificam o sinal dos limite tetrâmeros. IHC é usado em conjunto com o IST para caracterizar as células T antígeno-específicas e células circundantes. Anticorpos que reconhecem epitopos na superfície das células ou no espaço extracelular são incluídos na incubação preliminar com os tetrâmeros. Anticorpos que reconhecem epítopos intracelulares exigem permeação da parede celular antes da coloração. As secções de tecido manchado são fotografadas usando um microscópio confocal e analisaram utilizando o software confocal. Pilhas etiquetadas são quantificadas utilizando microscopia confocal software ou ImageJ. O protocolo descrito pode ser usado para manchar essencialmente qualquer célula T CD8 antígeno-específicas em qualquer tecido para qual MHC-eu tetrâmeros estão disponíveis.

<table><tbody><tr>Instalação <td></td><td>central de tetrâmero de</td> <td>monômero MHC-I</td><td>NIH Materiais para preparação de MHC-tetrâmero</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>Materiais para preparação de MHC-tetrâmero</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Baixa agasse</td><td>de fusão Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>SLBL6391V</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>J.T.Baker</td><td>4204-05</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>galato de n-propila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>Anticorpo instável, use alíquota</td></tr> <tr>congelada de uso único<td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>Vector</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>cabra-a-m-A488 (1:2.000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>cabra-a-rb-Cy3 (1:5.000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>106232</td><td></td></tr><tr><td>cabra-a-rato-Cy5 (1:5.000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>Compresstome: VF-300 Microtome</td><td>Precisionary Instruments, LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>Quick Set Instant Adhesive</td><td>Loctite</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de fundo plano de 24 poços</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio</td><td>Globe scienfitic Inc.</td><td>#1321</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi descartável de penas</td><td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td><td>No. 21</td><td></td></tr><tr><td>Pincel redondo # 2</td><td>PRINCETON ART & ESCOVA CO.</td><td>4350R</td><td>Pode aparar conforme necessário com navalha</td></tr><tr><td>Microscópio Confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ mhc-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células t de cd8 antígeno-específicas em tecidos

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

As células T são essenciais para muitos processos imunológicos, incluindo a detectar e eliminar as células infectadas por vírus, evitando a auto-imunidade, auxiliando na produção de células B e células plasmáticas de anticorpos e detectar e eliminar as células cancerosas. O desenvolvimento do MHC-tetrâmero de coloração de células T antígeno-específicas, analisadas por citometria de fluxo tem revolucionado a nossa capacidade de estudar e compreender o immunobiology de células T. Embora extremamente útil para a determinação da quantidade e do fenótipo das células de T antígeno-específicas, citometria de fluxo não é possível determinar a localização espacial de pilhas de T antígeno-específicas de outras células e estruturas em tecidos e técnicas atuais de desagregação para extrair o T células necessárias para citometria de fluxo têm limitado eficácia em tecidos não-linfoides. In situ MHC-tetrâmero coloração (IST) é uma técnica para visualizar as células T que são específicas para os antígenos de interesse em tecidos. Em combinação com imuno-histoquímica (IHC), IST pode determinar a abundância, localização e fenótipo das células CD8 e CD4 T de antígeno-específicas em tecidos. Aqui, descrevemos um protocolo para manchar e enumerar as células T CD8 de antígeno-específicas, com fenótipos específicos localizados dentro de compartimentos de tecido específico. Estes procedimentos são as mesmas que usamos em nossa recente publicação por Li et al, intitulado "células produtoras de Simian vírus da imunodeficiência em folículos são parcialmente suprimidos pelo CD8 células+ In Vivo." Os métodos descritos são amplamente aplicáveis, porque pode ser usados para localizar, fenótipo e quantificar essencialmente qualquer célula T CD8 antígeno-específicos para os quais tetrâmeros MHC estão disponíveis, em qualquer tecido.

A Figura 1 mostra como coletar imagens confocal, usando um microscópio confocal. A Figura 2 demonstra a análise quantitativa de imagem usando o ImageJ. Figuras 3 e 4 mostram representante imagens dos tecidos do nó de linfa de uma SIV infectado macaque do rhesus manchado com tetrâmeros de MHC e CD8 anticorpos anticorpos CD20 e servem para demonstrar a especificidade da MHC-tetrâmero de coloração. ...

Aqui, descrevemos um método que combina em situ MHC-tetrâmero coloração com imuno-histoquímica para determinar a localização, fenótipo e a quantidade de pilhas de T antígeno-específicos nos tecidos. Este protocolo é usado para determinar as características espaciais e fenotípicas de células T CD8 de antígeno-específicas em relação a outro tipo de célula e estruturas nos tecidos.

In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar a localização, abundância e fenótipo de células T CD8 positivas específicas para antígeno nos tecidos de interesse. Este método ajuda a responder rapidamente perguntas sobre células T CD8, fornecendo um meio para localizar, quantificar e caracterizar fenotipicamente virtualmente qualquer célula T CD8 específica para antígeno em qualquer tecido. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a determinação da distribuição espacial de células T CD8 positivas específicas para antígeno em relação a outras células e estruturas nos tecidos de interesse.Quem demonstrará o procedimento junto com Shengbin Li será Gwantwa Mwakalundwa. No primeiro dia do procedimento, utilize um bisturi para cortar o tecido fresco em pedaços de aproximadamente 0,5 x 0,5 centímetro. Aqui, é mostrado o tecido do baço de macaco-rufo.Cole separadamente cada fragmento de tecido no centro da parte superior de um êmbolo e incorpore as amostras em três a cinco mililitros de agarose de baixo ponto de fusão a 4% aquecida em PBS. Identifique os êmbolos com as informações relevantes do tecido. Em seguida, coloque as amostras em um suporte refrigerado dentro de um balde de gelo.Quando o ágar solidificar, ligue o micrótomo e defina a espessura para 200 micrômetros. Após instalar uma lâmina de barbear nova, insira os êmbolos no banho do micrótomo. Encha o banho do micrótomo com 100 a 200 mililitros de PBS-H recém-preparado e adicione cubos de gelo de PBS-H para manter a temperatura entre zero e dois graus Celsius.Após obter seções de 200 micrômetros, use um pincel para remover o ágar ao redor de cada seção e transfira as amostras para câmaras teciduais individuais dentro de poços individuais de uma placa de cultura celular de 24 poços contendo um mililitro de PBS-H gelado. Quando todas as amostras tiverem sido coletadas, incube as seções teciduais durante a noite em um mililitro de tetrameros de classe I de MHC carregados com peptídeo conjugado a fluoróforo, diluídos em PBS-H suplementado com 2% de soro normal de cabra, a quatro graus Celsius, com agitação. Na manhã seguinte, transfira cada câmara tecidual para poços individuais de uma nova placa de 24 poços contendo um mililitro de PBS-H fresco e gelado, por 20 minutos.Após a segunda lavagem, fixe as seções em um mililitro de paraformaldeído a 4% fresco por duas horas à temperatura ambiente. Em seguida, realize duas lavagens de cinco minutos em PBS-H frio. Transfira as seções para uma nova placa de 24 poços contendo ureia 0,01 molar e aqueça as seções no micro-ondas três vezes, cerca de 10 segundos cada vez, até que a ureia entre em ebulição.Para permeabilizar e bloquear as amostras, incube as seções na solução de bloqueio contendo PBS-H suplementado com 0,3% de detergente Triton X100 e 2% de soro normal de cabra em agitador durante uma hora, a quatro graus Celsius. Ao final da incubação, transfira as câmaras de tecido para poços individuais de uma nova placa de 24 poços contendo um mililitro de solução contendo anticorpo anti-FITC de coelho, anticorpo anti-CD humano de camundongo e anticorpo anti-CD3 humano de rato. Incube as amostras durante a noite a quatro graus Celsius com agitação.No terceiro dia, lave as seções três vezes em PBS-H fresco a quatro graus Celsius por pelo menos 20 minutos por lavagem e realize uma incubação final com os anticorpos secundários conjugados à fluorescência apropriados por até três dias, protegidos da luz. Ao final da incubação com o anticorpo terciário, enxágue as amostras com três lavagens de 20 minutos em PBS-H fresco e use um pincel para transferir as amostras de cada câmara tecidual para uma lâmina de microscópio de vidro. Revesta cada seção com meio de montagem suplementado com um conservante de fluoróforo e cubra as amostras com uma lamínula.Em seguida, armazene as lâminas em um recipiente para lâminas protegido da luz, a 20 graus Celsius. No dia da aquisição de imagens, coloque a primeira lâmina sobre a platina de um microscópio confocal e selecione os lasers e filtros apropriados para cada fluoróforo utilizado para marcar a amostra de tecido. Utilizando a objetiva de 20x, obtenha sequencialmente uma série z em intervalos de três mícrons em cada um dos canais de fluoróforo, em múltiplos campos de 800 x 800 pixels.Em seguida, construa um mosaico dos campos coletados e salve cada imagem do mosaico com um nome baseado na amostra de tecido correspondente. Nessas imagens representativas, uma seção corada com tetrâmeros de MHC classe I carregados com um peptídeo de SIV é comparada a uma seção do mesmo tecido, corada com tetrâmeros de MHC classe I carregados com um peptídeo irrelevante, demonstrando a especificidade da coloração com tetrâmero. Nessas imagens, as células T específicas pelo vírus coradas com tetrâmero de MHC classe I carregado com peptídeo de SIV apresentam coloração dupla para CD8, um marcador de subpopulação de células T, mas não para CD20, uma proteína de superfície celular expressa em células B.Esta montagem foi criada a partir de múltiplos campos de séries z confocais, que foram utilizados para a quantificação de células marcadas com tetrâmero com fenótipos específicos e em diferentes compartimentos anatômicos do linfonodo. Esta imagem ampliada destaca uma região da montagem do linfonodo que contém um folículo folicular delineado pela marcação de IGM. Células marcadas com tetrâmero da classe I do MHC, algumas das quais coexpressavam o marcador de ativação e proliferação de linfócitos T, KI67, podem ser detectadas dentro e fora do folículo de células B.Essa combinação de coloração permite a determinação dos estados de ativação e proliferação de linfócitos T CD8 positivos específicos para o VSI, bem como sua localização nos tecidos linfoides secundários. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em aproximadamente cinco dias, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o tecido fresco é essencial para uma coloração bem-sucedida.Processe as amostras em até 24 horas após a coleta, mantendo-as refrigeradas até a fixação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a coloração com tetrâmero e imuno-histoquímica para determinar a localização, abundância e fenótipo de linfócitos T CD8 positivos específicos para antígenos nos tecidos de interesse. Não se esqueça de que trabalhar com agentes infecciosos pode ser extremamente perigoso e que precauções para prevenir exposição, como o uso de equipamentos de proteção individual apropriados e a limitação do uso de materiais perfurocortantes, devem sempre ser adotadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este procedimento demonstra a purificação e expansão in vitro de células CD4 + antígeno específico das células T do sangue periférico todo e sua visualização usando tetrâmeros de MHC classe II. Tetrâmeros permitir a visualização direta das células T com uma especificidade antígeno único e definido MHC classe II restrição.

Visualizando CD4 + antígeno específico Células T usando MHC Classe II tetrâmeros

Uma técnica que combina na coloração tetrâmero situ e hibridização in situ (ISTH) permite o mapeamento, visualização e análise da proximidade espacial de vírus específicos células CD8 + T ao seu infectados por vírus metas e determinação das relações quantitativas entre estes efetores imunes e metas aos resultados infecção.

Uma técnica para Simultaneamente Visualize-Virus específicos células T CD8 + e células infectadas por vírus In situ</em

Este protocolo descreve o uso de péptido: MHC tetrâmeros e microesferas magnéticas para isolar populações de baixa frequência de células T específicas para epitopo e analisá-las por citometria de fluxo. Este método permite o estudo direto de endógenos populações de células T de interesse...

Péptido: Enriquecimento tetrâmero com base MHC das células T específicas para epitopos

O protocolo para detectar células auto-reactivas T CD4 no cérebro e no coração por coloração direta com complexo de histocompatibilidade principal dextramers classe II foi descrito neste relatório. Para análise detalhada, um método confiável para enumerar as freqüências de células T CD4 + antígeno-específicas in situ também é concebido.

A detecção in situ de células T CD4 autoreactive em Cérebro e Coração Usando principal de histocompatibilidade Dextramers classe II

Descrevemos técnicas baseadas em imagens de animais inteiros e citometria de fluxo para monitorar a expansão de células T CD8+ específicas do antígeno em resposta à imunização com nanopartículas em um modelo murino de vacinação.

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para enumerar e caracterizar macaco rhesus células T CD8 + contra o vírus da AIDS. Este artigo é útil não só para o campo da imunologia do HIV, mas também a outras áreas de investigação biomédica, onde são conhecidas respostas de células T CD8 + de afectar a evolução da doença.

Análise de células T CD8 específicas do vírus da imunodeficiência símia + Células-T em Rhesus Macaques por Peptide-MHC-I tetrâmero coloração

Estudar o microambiente do tumor pode identificar biomarcadores prognósticos ou preditivos de resposta clínica à imunoterapia. Apresentado aqui, é um método inovador baseado em situ fluorescência multiespectral de imagens para analisar e contar automaticamente várias subpopulações de CD8+ T células. Esta técnica reprodutível e confiável é apropriada para análises de grandes coorte.

Multiplexado imunofluorescência análise e quantificação de Intratumoral PD-1+ + Tim-3 CD8+ T células

Aqui, apresentamos um protocolo para o ex vivo deteção qualitativa do antígeno-específicos CD8+ T células. Análise é possível com suspensões celulares único de órgãos ou de pequenas quantidades de sangue. Uma ampla gama de estudos requer a análise das respostas de célula de T citotóxicas (vacinação e estudos de imunoterapia do câncer).

Quantificação simultânea de vetor anti e Antiespecíficas do transgene CD8+ T células Via MHC tetrâmero coloração após a vacinação com um vetor Viral

Este protocolo descreve o uso da única cadeia de MHC classe I complexos para investigar interações moleculares na ativação de células T CD8 + humana: geração de engenharia apresentadoras de celulas que expressam cadeia única constrói, cultura de clone humano de células T CD8 + e experimentos de ativação de células T.

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Neste artigo, um protocolo para amplificação manual do sinal de tiramida (TSA) por imunofluorescência multiplex (mIF) combinado com análise de imagem e análise espacial é descrito. Este protocolo pode ser usado com cortes fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) para a coloração de dois a seis antígenos por lâmina, dependendo do scanner de lâminas disponível no laboratório.

Imunofluorescência Multiplex Combinada com Análise Espacial de Imagens para Avaliação Clínica e Biológica do Microambiente Tumoral

Este protocolo detalha uma metodologia para detecção de mRNA multiplex com citometria de massa de imagem de proteína em seções de tecido embebidas em parafina fixada em formalina.

Cartografia Molecular de Modalidade Dupla: Integrando a Detecção de RNA Multiplex com a Citometria de Massa por Imagem de Proteínas

Aprenda a técnica de coloração in situ com MHC-tetramero para localizar, quantificar e caracterizar fenotipicamente células T CD8 antígeno-específicas em tecidos. Este método permite mapear a distribuição espacial dessas células em amostras de baço de macaco rhesus.

In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos (Vídeo) | JoVE Journal

In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos

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