In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos

O objetivo geral deste procedimento é determinar a localização, abundância e fenótipo de células T CD8 positivas específicas para antígenos nos tecidos de interesse. Este método ajuda a responder a perguntas rápidas sobre células T CD8, fornecendo um meio de localizar, quantificar e fenotipar virtualmente qualquer célula T CD8 específica do antígeno e qualquer tecido. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a determinação da distribuição espacial de células T CD8 positivas específicas do antígeno em relação a outras células e estruturas dentro dos tecidos de interesse.

Demonstrando o procedimento com Shengbin Li estará Gwantwa Mwakalundwa. No primeiro dia do procedimento, use um bisturi para cortar o tecido fresco em pedaços de aproximadamente 0,5 x 0,5 centímetro. Aqui, o tecido do baço do macaco rhesus é mostrado.

Cole separadamente cada fragmento de tecido no meio da parte superior de um êmbolo e incorpore as amostras em três a cinco mililitros de agarose quente de baixo ponto de fusão a 4% em PBS. Rotule os êmbolos com as informações relevantes sobre o tecido. Em seguida, coloque as amostras em um suporte refrigerado em um balde de gelo.

Quando o ágar-ágar solidificar, ligue o micrótomo e ajuste a configuração de espessura para 200 micrômetros. Depois de instalar uma nova lâmina de barbear, insira os êmbolos no banho de micrótomo. Encha o banho de micrótomo com 100 a 200 mililitros de PBS-H recém-preparado e adicione cubos de gelo PBS-H para manter a temperatura entre zero e dois graus Celsius.

Depois de obter seções de 200 micrômetros, use um pincel para remover o ágar ao redor de cada seção e transfira as amostras para câmaras de tecido individuais dentro de poços individuais de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços contendo um mililitro de PBS-H resfriado. Quando todas as amostras tiverem sido adquiridas, incubar as seções de tecido durante a noite em um mililitro de tetrâmeros MHC classe um carregados com peptídeo conjugado ajustado, diluído em PBS-H suplementado com soro de cabra normal a 2% a quatro graus Celsius com balanço. Na manhã seguinte, transfira cada câmara de tecido para poços individuais de uma nova placa de 24 poços contendo um mililitro de PBS-H fresco resfriado por 20 minutos.

Após a segunda lavagem, fixe as seções em um mililitro de paraformaldeído fresco a 4% por duas horas em temperatura ambiente. Seguido por duas lavagens de cinco minutos em PBS-H frio. Transfira as seções para uma nova placa de 24 poços contendo 0,01 molar de uréia e leve ao micro-ondas as seções três vezes por cerca de 10 segundos de cada vez até que a uréia ferva.

Para permeabilizar e bloquear as amostras, incubar as seções em solução de bloqueio contendo PBS-H suplementado com um detergente 0,3% triton x100 e 2% de soro de cabra normal em um balancim por uma hora, a quatro graus Celsius. No final da incubação, transfira as câmaras de tecido para poços individuais de uma nova placa de 24 poços contendo um mililitro de solução contendo anticorpo anti-fitc de coelho, anticorpo CD anti-humano de camundongo e anticorpo CD3 anti-humano de rato. Incube as amostras durante a noite a quatro graus Celsius com balanço.

No terceiro dia, lave as seções três vezes em PBS-H fresco a quatro graus Celsius por pelo menos 20 minutos por lavagem e realize uma incubação final com os anticorpos secundários conjugados com fluorescência apropriados por até três dias, protegidos da luz. No final da incubação de anticorpos terciários, enxágue as amostras com três lavagens de 20 minutos em PBS-H fresco e use um pincel para transferir as amostras de cada câmara de tecido para uma lâmina de microscópio de vidro. Cubra cada seção com meio de montagem complementado com um conservante de fluoróforo e cubra as amostras com uma lamínula.

Em seguida, guarde as lâminas em um recipiente de lâminas protegido contra luz, a 20 graus Celsius. No dia da imagem, coloque a primeira lâmina no palco de um microscópio confocal e selecione os lasers e filtros apropriados para cada fluoróforo usado para rotular a amostra de tecido. Usando a objetiva de 20x, obtenha sequencialmente uma série z em intervalos de três mícrons em cada um dos canais de fluoróforo, em vários campos de 800 x 800 pixels.

Em seguida, construa uma montagem dos campos coletados e salve cada imagem de montagem com um nome baseado na amostra de tecido correspondente. Nessas imagens representativas, um corte corado com tetrâmeros MHC classe um carregado com um peptídeo SIV é comparado a um corte do mesmo tecido, corado com tetrâmeros MHC classe um carregados com um peptídeo irrelevante, demonstrando a especificidade da coloração do tetrâmero. Nessas imagens, as células T específicas do vírus coradas com tetrâmero MHC classe um carregadas com peptídeo SIV, co-colorem para CD8, um marcador de subconjunto de células T, mas não CD20, uma proteína de superfície celular expressa em células B.

Esta montagem foi criada para vários campos confocais da série z, que foram usados para a quantificação de células coradas com tetrâmero com fenótipos específicos e diferentes compartimentos anatômicos no linfonodo. Esta imagem ampliada destaca uma área do linfonodo de montagem que contém um folículo de células B delineado pela coloração IGM. Células coradas com tetrâmero MHC classe um, algumas das quais co-expressaram o marcador de ativação e proliferação de células T, KI67 pode ser detectado dentro e fora do folículo de células B.

Esta combinação de coloração permite a determinação dos estados de ativação e proliferação de células T CD8 positivas específicas para SIV, bem como sua localização nos tecidos linfóides secundários. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em aproximadamente cinco dias se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o tecido fresco é fundamental para uma coloração bem-sucedida.

Processar as amostras dentro de 24 horas ou menos após a colheita, mantendo-as resfriadas até a fixação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como realizar uma coloração de tetrâmero e imuno-histoquímica para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T CD8 positivas específicas para antígenos em tecidos de interesse. Não se esqueça de que trabalhar com agentes infecciosos pode ser extremamente perigoso e que precauções para evitar a exposição, como usar o equipamento de proteção individual adequado e limitar o uso de perfurocortantes, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.