Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers

O objetivo geral deste protocolo é melhorar as investigações da ecologia trófica, especialmente a partir de amostras de campo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da ecologia da teia alimentar, como o impacto de espécies invasoras nas interações tróficas. A principal vantagem é a aplicação adicional para mais tempo integrando análises tróficas para os mesmos espécimes e que pode ser aplicada por praticamente todos os ecologistas.

Embora tenhamos estabelecido essa abordagem para fornecer informações sobre o consumo de presas dos consumidores aquáticos, ela também pode ser aplicada para outros fins, por exemplo, para determinar a composição de espécies em amostras de macroinvertebrados bentônicos. Demonstrando o procedimento estará Christian Sodemann, um técnico do nosso laboratório. Para iniciar este experimento, transfira o trato gastrointestinal do predador previamente dissecado para um tubo de reação de trava segura de dois mililitros contendo 440 microlitros de tampão de extração de sal.

Congele imediatamente as amostras a menos 20 graus Celsius até a extração do DNA. Depois de remover as amostras do freezer, inicie a extração de DNA usando uma pinça para adicionar um cordão de aço inoxidável de cinco mililitros a cada tubo de amostra e, em seguida, deixe as amostras na bancada em temperatura ambiente para descongelar. Usando um moinho de esferas, homogeneizar as amostras por um minuto a 15 hertz.

Depois de girar as amostras em breve, adicione 90 microlitros de 10% SDS e cinco microlitros de 10 miligramas por mililitro de proteinase K às amostras. Em seguida, vortex completamente as amostras e incube-as a 60 graus Celsius com agitação constante a 400 rpm em um ThermoMixer por uma hora. Para promover ainda mais a lise, faça um vórtice nas amostras a cada 10 minutos durante esta incubação.

Após uma curta centrifugação de centrifugação, pipete 350 microlitros de cloreto de sódio de cinco molares nas amostras. Vortex por 30 segundos a um minuto para misturar completamente as amostras. Em seguida, centrifugue a 16.200 vezes g a cinco graus Celsius por 40 minutos.

Portanto, uma das coisas mais críticas ao retirar as amostras da centrífuga é evitar que os grânulos se movam e perturbem o pellet contendo todas as partículas que precisam ser removidas pela etapa. Em seguida, transfira cuidadosamente aproximadamente 600 microlitros de sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro, certificando-se de não perturbar o pellet. Adicione 600 microlitros de isopropanol gelado e inverta cuidadosamente o tubo algumas vezes.

Armazene a menos 20 graus Celsius durante a noite. Depois de retirar as amostras do congelador, centrifugue-as a 16, 200 vezes g à temperatura ambiente durante 20 minutos. Descarte o sobrenadante, certificando-se de não perder o pellet, e use um lenço de papel para secar cuidadosamente o tubo.

Lave esses pellets contendo DNA adicionando 200 microlitros de etanol gelado a 70% e, em seguida, centrifugando a 16.200 vezes g em temperatura ambiente por 10 minutos. Descarte o sobrenadante com cuidado e use papel de seda sem fiapos para secar cuidadosamente o tubo. Por fim, usando uma pipeta de 10 microlitros ajustada para oito microlitros, remova cuidadosamente o sobrenadante restante, tomando cuidado para não perturbar o pellet.

Seque o pellet até que todo o etanol seja evaporado. Em seguida, adicione 50 a 100 microlitros de água livre de nuclease, vortex brevemente e deixe a quatro graus Celsius durante a noite para dissolver o pellet. Para verificar a eficiência funcional das amostras de DNA extraídas aqui, testar cada uma delas por PCR, usando conjuntos de primers universais adequados para a respectiva fonte de alimento.

Comece adicionando primers, mistura dNTP, tampão de reação, Taq DNA polimerase e água purificada em um tubo de reação de 1,5 ou 2,5 mililitros e vórtice a mistura de reação padrão. Agora, para cada amostra de DNA, transfira um microlitro do extrato de DNA correspondente para nove microlitros da mistura de reação padrão dentro de uma placa de PCR. Feche a placa, coloque-a no termociclador e inicie o programa de PCR.

Após a reação de PCR finalizada, use uma opção de curto prazo de uma mini centrífuga para girar os produtos de PCR. Em seguida, misture três microlitros de cada produto de PCR com um microlitro de corante de seis vezes o carregamento. Carregue essas amostras em ranhuras de gel de um gel de agarose previamente preparado.

Carregue 1,5 microlitros de uma escada de DNA de 100 pares de bases em um slot do gel como um padrão de tamanho. Feche a tampa da unidade de eletroforese, conecte-a a uma fonte de alimentação e execute o gel a 100 volts por centímetro por 35 minutos. Após a execução da eletroforese, remova o gel e coloque-o em um banho de coloração previamente preparado por aproximadamente 10 minutos.

Por fim, remova o gel do banho de coloração e coloque-o em um sistema de documentação de gel e visualize-o de acordo com o manual. Para analisar o conteúdo intestinal do predador, use soluções de trabalho previamente preparadas de extrato de DNA. Realizar reações de PCR separadas para cada um dos 16 conjuntos de iniciadores específicos do grupo de presas.

Incluir um controlo positivo com ADN de um espécime pertencente ao respetivo grupo de presas e um controlo negativo com ADN da espécie predadora. É crucial documentar a alocação de amostra dentro de cada placa de PCR exatamente para evitar o agrupamento de amostras diferentes ao carregá-las em uma placa de sequenciamento para a detecção de um sequenciador de alocação e, finalmente, atribuir os resultados errados a um indivíduo consumidor. Em seguida, execute as reações de PCR usando o mesmo protocolo descrito anteriormente, ajustado à temperatura de recozimento específica e ao número do ciclo para cada conjunto de primers usado.

Para detectar os fragmentos amplificados nessas reações de PCR, execute análises automatizadas de fragmentos em dois lotes, A e B. Prepare uma mistura contendo solução de carregamento de amostra, ou SLS, e o respectivo padrão de tamanho para cada lote. Em seguida, descongele os produtos de PCR previamente congelados das oito reações de PCR pertencentes ao respectivo lote, certificando-se de que sejam mantidos no escuro. Use uma opção de curto prazo de uma mini centrífuga para girá-los para baixo.

Em uma placa de sequenciamento, carregar o número de poços correspondente ao número de amostras a serem analisadas com 22 microlitros da respectiva mistura padrão de tamanho SLS para cada amostra. Em seguida, carregue um microlitro de produto de PCR de cada uma das oito reações de PCR nos respectivos poços da placa. Em seguida, use uma opção de curto prazo de uma centrífuga de miniplacas para girar cuidadosamente essa mistura.

Depois disso, cubra cada poço com uma gota de óleo mineral. Em seguida, encha os poços de reação de uma placa tampão com 250 a 300 microlitros de tampão de separação de DNA. Use o software do sequenciador capilar para criar uma configuração de amostra de acordo com as instruções do fabricante.

Certifique-se de que a alocação de amostras dentro da configuração da amostra corresponda à alocação da amostra na placa de sequenciamento e que a configuração da amostra contenha o método apropriado para processar o respectivo lote. Ao analisar os resultados, é importante verificar visualmente o eletroferograma de cada amostra e confirmar/desconfirmar cada pico chamado para cada primer marcador definido separadamente e inserir picos não chamados que se encaixem nos critérios de um primer marcador definido manualmente ou excluir os errados. Após a realização de experimentos de alimentação para determinar a eficácia dos conjuntos de primers específicos do grupo estabelecidos para as análises de PCR realizadas neste protocolo, os resultados de PCR usando DNA do trato gastrointestinal do predador foram analisados usando eletroforese em gel de agarose, bem como polimorfismo de conformação de fita simples, ou SSCP.

A eletroforese em gel de agarose revelou bandas simples de DNA de fita dupla, que não puderam ser distinguidas entre as diferentes espécies de presas estudadas. Em contraste com isso, a eletroforese SSCP foi bem-sucedida em distinguir entre as diferentes espécies de presas, comparando as amostras de conteúdo intestinal com as amostras de referência. O DNA extraído do intestino do ácaro d'água após o experimento de alimentação foi sequenciado em diferentes períodos de tempo após o consumo da presa.

De uma a 50 horas após a alimentação, as quantidades relativas de DNA de presas detectadas foram significativamente reduzidas. O DNA extraído do anfípode invasor, intestino de Dikerogammarus villosus, foi testado para DNA de presas macroinvertebradas usando 16 conjuntos de primers específicos para grupos descritos neste protocolo. Apenas 16% do conteúdo intestinal de D. villosus foi positivo para DNA pertencente a qualquer um dos 16 táxons de presas alvo.

Além disso, o DNA de 12 táxons de presas testados foi encontrado em pelo menos uma amostra, enquanto o DNA de quatro táxons nunca foi detectado. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de garantir que os primers usados são específicos para os táxons em seu sistema. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estender sua pesquisa sobre interações tróficas, complementando os métodos usados rotineiramente em seu laboratório com análises genéticas.