Name: Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-05T12:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Aprenda análises genéticas de conteúdo intestinal de macroinvertebrados aquáticos usando primers grupo-específicos. Este método melhora investigações de ecologia trófica e interações em teias alimentares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Silke Classen do Instituto de pesquisa para análise do ecossistema e avaliação (gaiac), RWTH Aachen pela sua assistência no estabelecimento dos conjuntos específicos de grupo primário usado neste protocolo. Agradecemos também Peter Martin e Laura Schynawa da Universidade de Kiel para a cooperação em experimentos dos ácaros da água. Agradecemos também os assistentes de laboratório técnico para manutenção de laboratório funcionando sem problemas e preparar o registo das empresas e números de catálogo. Este trabalho foi financiado pela Fundação de pesquisa alemã (DFG; projeto GE 2219/3-1).

<ol><li>Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revolution+in+food+web+analysis+and+trophic+ecology%3A+diet+analysis+by+DNA+and+stable+isotope+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis.</a> Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).</li>
<li>Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+source+accounting+for+fish+using+combined+DNA+and+stable+isotope+analyses+in+a+regulated+lowland+river+weir+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool.</a> Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).</li>
<li>Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2427.2004.01328.x/full">Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones.</a> Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).</li>
<li>Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1890/04-138/abstract">Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies.</a> Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).</li>
<li>Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/259188892_Chapter_Three_-_Empirically_characterising_trophic_networks_what_emerging_DNA-based_methods_stable_isotope_and_fatty_acid_analyses_can_offer">Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer.</a> Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, Elsevier Academic Press Inc. 177-224 (2013).</li>
<li>Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/292536291_Feeding_habits_of_the_spiny_lobster_Panulirus_interruptus_Randall_1840_in_Bahia_Tortugas_Baja_California_Sur">Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur.</a> Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).</li>
<li>Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002209819602730X">Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacepède) on a Réunion fringing reef.</a> J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).</li>
<li>Akin, S., Winemiller, K. O. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007%2FBF02784282?LI=true">Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary.</a> Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).</li>
<li>Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+approach+to+identify+prey+of+the+southern+rock+lobster%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Entomol+Res%22%5BJournal%5D)">A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster.</a> Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).</li>
<li>Gergs, R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/30019761_Dreissena_polymorpha_in_Lake_Constance_An_example_of_a_keystone_engineer">Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer?</a> Universität Konstanz. , (2009).</li>
<li>Sheppard, S. K., Harwood, J. D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Samuel_Sheppard2/publication/227994386_Advances_in_molecular_ecology_Tracking_trophic_links_through_predator-prey_food-webs/links/0deec519bc75aa375c000000.pdf">Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs.</a> Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).</li>
<li>Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide+primers+for+PCR+amplification+of+coelomate+introns%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns.</a> Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).</li>
<li>Verma, S. K., Singh, L. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1471-8286.2003.00340.x/abstract">Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application.</a> Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).</li>
<li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+scatology+as+a+tool+to+study+diet%3A+analysis+of+prey+DNA+in+scats+from+captive+Steller+sea+lions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions.</a> Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).</li>
<li>Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group-specific+polymerase+chain+reaction+for+DNA-based+analysis+of+species+diversity+and+identity+in+dietary+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples.</a> Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).</li>
<li>Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1471-8286.2005.01172.x/full">Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica.</a> Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).</li>
<li>Hayashi, K., Yandell, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8257985">How sensitive is PCR-SSCP?</a> Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).</li>
<li>Glavač, D., Dean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+single-strand+conformation+polymorphism+%28SSCP%29+technique+for+detection+of+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations.</a> Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).</li>
<li>Mülhardt, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%BClhardt%2C+C+%22Der+Experimentator+Molekularbiologie+%2F+Genomics%22">Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics</a>. , 7th ed, Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. (2013).</li>
<li>Lee, S. V., Bahaman, A. R. Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+SV+%22Gel+Electrophoresis+-+Principles+and+Basics%22">Gel Electrophoresis - Principles and Basics</a>. , InTech. (2012).</li>
<li>Wang, X. W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ajol.info/index.php/ajb/article/view/60628">A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles.</a> Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).</li>
<li>Gemmer, I., Gergs, R. <a target="_blank" href="https://pubag.nal.usda.gov/catalog/612063">Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda).</a> Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).</li>
<li>Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+set+of+multiplex+assays+%28SalPrint15%29+for+efficient+analysis+of+15+microsatellite+loci+of+contemporary+samples+of+the+Atlantic+salmon+%28Salmo+salar%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar).</a> Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).</li>
<li>Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. <a target="_blank" href="https://www.kmae-journal.org/articles/kmae/abs/2006/01/kmae2006380-381p977/kmae2006380-381p977.html">First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes.</a> Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).</li>
<li>Koester, M., Gergs, R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/265367886_No_evidence_for_intraguild_predation_of_Dikerogammarus_villosus_Sowinsky_1894_at_an_invasion_front_in_the_Untere_Lorze_Switzerland">No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland.</a> Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).</li>
<li>Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+LSU+rDNA+D1-D2+sequences+for+their+use+in+species+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Zool%22%5BJournal%5D)">An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification.</a> Front Zool. 4 (6), 6(2007).</li>
<li>Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10750-015-2558-9">Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system?</a> Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).</li>
<li>Koester, M., Claßen, S., Gergs, R. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12686-013-9998-1">Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates.</a> Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).</li>
<li>Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+detection+of+prey+DNA+in+Hygrobates+fluviatilis+%28Hydrachnidia%2C+Acari%29%3A+a+new+approach+for+determining+predator-prey+relationships+in+water+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Appl+Acarol%22%5BJournal%5D)">First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites.</a> Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).</li>
<li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+Seabird+Diet+through+Genetic+Analysis+of+Faeces%3A+A+Case+Study+on+Macaroni+Penguins+%28Eudyptes+chrysolophus%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus).</a> PLoS One. 2 (9), e831(2007).</li>
<li>Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group-Specific+Multiplex+PCR+Detection+Systems+for+the+Identification+of+Flying+Insect+Prey%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey.</a> PLoS One. 9 (12), e115501(2014).</li>
<li>Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+PCR+detection+of+prey+in+molecular+diet+studies%3A+importance+of+group-specific+primer+set+selection+and+extraction+protocol+performances%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances.</a> Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).</li>
<li>Vestheim, H., Jarman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+primers+to+enhance+PCR+amplification+of+rare+sequences+in+mixed+samples+-+a+case+study+on+prey+DNA+in+Antarctic+krill+stomachs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Zool%22%5BJournal%5D)">Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs.</a> Front Zool. 5 (1), 12(2008).</li>
<li>Harper, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+of+invertebrate+predators+for+multiple+prey+DNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets.</a> Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, apresentamos um método fácil e custo-eficiente para determinação de PCR-baseados de interações predador-presa de amostras de campo através de cartilhas específicas do grupo para as regiões de rDNA, que podem ser combinadas com outras análises non-molecular dos mesmos espécimes. No entanto, existem várias etapas críticas dentro do protocolo. Em primeiro lugar, assegurando a especificidade dos primers usados é essencial. Em segundo lugar, é fundamental evitar contaminação e perda de material de conteúdo intestino dur...

Interações predador-presa, que constituem a maioria da comida da web dinâmica e interações tróficas, são aspectos fundamentais para caracterizar os fluxos de matéria e energia ao longo de teias de alimento dentro e entre os ecossistemas, o que é um dos principais objetivos da ecologia 1. a determinação da fonte e fluxo de carbono e nutrientes é promover a compreensão da conectividade ecológica entre ecossistemas2. No entanto, os ecossistemas, tais como rios e suas bacias hidrográficas, não estão ligados somente por fluxos de matéria orgânica e nutrientes, mas também pelos movimentos de organismos3. Assim, alterações de habitat, interrompendo o fluxo de recursos que associam esses sistemas podem fortemente alterar as teias alimentares de ambos os ecossistemas, não só diretamente, mas também indiretamente alterando a respectiva composição das comunidades de predador-presa. Por exemplo, alterações de teias alimentares foram mostradas para ser ligado aos movimentos de predador única espécie (por exemplo, truta arco-íris)4. Tais alterações potencialmente ameaçam a biodiversidade e o funcionamento dos ecossistemas aquáticos. Portanto, analisar interações predador-presa no campo é essencial para determinar o impacto das mudanças ambientais induzidas pelo homem, tais como as práticas de gestão de água, sobre a biodiversidade nativa dos ecossistemas aquáticos.
Desde ligações tróficas de rastreamento é difícil em sistemas complexos, várias abordagens foram estabelecidas que permitem a avaliação da alimentação interações no campo5. Tradicionalmente, as investigações de interações no campo de alimentação baseiam-se na identificação visual dos restos de presas nas entranhas dissecados e exigem um amplo conhecimento sobre diversidade morfológica presa. Análises de conteúdo Visual intestino forneceram introspecções na utilização dos recursos de vários grupos de consumidores (por exemplo, variação sazonal na dieta de lagosta peixe e6 7,8 ou alimentando preferências de copépodes). No entanto, o processo físico de digestão dificulta as análises de conteúdo visual do intestino e perde geralmente suave rapina encorpado-organismos9. Para a alimentação de espécies por ingestão de líquidos ou para alguns consumidores invertebrados que fragmentá intensamente sua comida antes de ingestão, como anfípodas, identificação visual das espécies de presas no conteúdo do intestino é impossível10. Devido a essas limitações, a análise molecular fornece uma alternativa promissora.
Análises moleculares tornaram-se uma ferramenta comum permitindo a deteção de presa rápida e precisa no conteúdo do intestino. A variedade de tais técnicas é diversa: estratégias baseadas em anticorpos monoclonais ou reacções em cadeia do polymerase (PCR) são frequentemente usadas, por causa de sua alta especificidade e sensibilidade11. O desenvolvimento de novos anticorpos monoclonais é demorada e de custo, portanto, a aplicação de outras técnicas moleculares é mais útil quando os anticorpos já não existem11. Outra abordagem comum é a amplificação das regiões do ácido desoxirribonucleico (DNA), como o ácido ribonucleico ribossômico (RNA) genes presentes na maioria das espécies, usando primer universal define12,13. Ao usar essa técnica, muitas vezes não é possível identificar toda a gama de organismos presas dentro de fontes mistas de DNA14. Uma abordagem eficaz para evitar tal uma desvantagem é usar primer grupo específico define para análises de conteúdo genético do intestino. Projetado para amplificar apenas as regiões de ADN de determinados grupos-alvo e excluir todas as outras espécies15,16, primers específicos de grupo possibilitam a identificação de organismos de rapina no nível taxonômico dos grupos especificados sem análises secundárias de tempo - e onerosos. No entanto, como todos estripá-análise de conteúdo, tais análises fornecem apenas um instantâneo do comportamento alimentar. Portanto, combinar as análises de conteúdo intestino molecular com análises de traçadores naturais-integração de tempo (por exemplo, isótopos estáveis) é considerado benéfico1,2.
Aqui, descrevemos um método detalhado de inquéritos baseados em PCR de interações predador-presa usando conjuntos de cartilha de grupo específicas para as regiões de ADN (rDNA) ribosomal nucleares deve ser combinada com análises de isótopos estáveis do mesmo espécime. Descrevemos a detecção de DNA de rapina única grupos através de eletroforese em gel de agarose. Além disso, apresentamos uma oportunidade para ainda mais a jusante análises de produtos PCR de tais primers específicos de grupo aplicáveis sempre que uma resolução taxonômica maior do que a especificidade dos primers é necessária. Porque o único encalhado DNA (ssDNA) fragmentos de conformações terciário de forma que são determinadas pela sua sequência primária17, pequenas variações em fragmentos amplificados por tais cartilhas específicas do grupo levam a mudanças conformacionais. Tais mudanças podem ser detectadas pelas análises de polimorfismo (SSCP) único filamento conformação com géis de poliacrilamida17,18, permitindo uma identificação mais precisa de organismos de presa (até ao nível de espécie).
Enquanto a eletroforese em gel de agarose é uma ferramenta comum e de baixo custo para visualizar os fragmentos de DNA e determinar seu comprimento aproximado19, a resolução depende da quantidade de DNA e o corante de coloração usado20. Geralmente, a visualização é direta quando se trabalha com amostras de DNA puras, mas potencialmente baixas quantidades de rapina DNA no conteúdo do intestino dos consumidores pode complicar a Pontuação dos resultados de eletroforese de gel de agarose. Ainda, esse método de deteção é viável para a tela de um baixo número de espécimes de consumidor do campo para um ou alguns grupos de presas, mas complicação o artilheiro faz a seleção de um número elevado de amostras para vários táxons de presas extremamente tempo intensivo e, portanto, impraticável. Um método de deteção mais sensível é a análise automatizada de fragmentos através de eletroforese capilar, que além disso permite a determinação do comprimento exato de fragmentos21. Vários microssatélites com base em estudos têm mostrado que usando diferentes corantes fluorescentes como rótulos, é possível detectar e determinar diferentes fragmentos de comprimento comparável por fragmento automatizado análise22,23, 24. Portanto, apresentamos também um protocolo detalhado para a deteção paralela do DNA de várias presas grupos usando PCR com rotulado primeira demão específicas do grupo de moda e deteção através de análise de fragmento automatizado com um sequenciador automático. Além disso, apresentamos os resultados de um estudo de caso, demonstrando que a detecção de DNA de presas através de análise automatizada de fragmento é uma abordagem que também permite uma quantificação relativa de presas ingeridas.

<table><tbody><tr><td>nitrogênio líquido</td><td>Qualquer</td><td>NA</td><td>Para transporte de amostras de campo de macroinvertebrados para o laboratório.</td></tr><tr><td>Tubos de reação de 1,5 ml - Safelock</td><td>Any</td><td>NA</td><td>Para coleta de amostras de consumo no campo e posterior conservação em tubos de reação de nitrogênio líquido não precisam necessariamente ser limpos por PCR. Para evitar a explosão dos tubos, a tampa dos tubos deve ser perfurada com uma agulha.</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Qualquer</td><td>NA</td><td>Certifique-se de que a ampliação seja adequada para preparar o trato gastrointestinal do tamanho do consumidor de interesse.</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Qualquer</td><td>NA</td><td>Para dissecar o trato gastrointestinal de amostras de consumo sob o estereomikroscópio.</td></tr><tr><td>Foceps de aço inoxidável: Pinça Dumont No. 7</td><td>Bioform</td><td>B40d</td><td>Esta pinça curva de aço inoxidável às vezes pode ser muito útil para manter a amostra fixa entre a parte curva sem perfurar o trato gastrointestinal.</td></tr><tr><td>Focep de aço inoxidável: Pinça Dumont Eletrônica nº 5</td><td>Bioform</td><td>B40b</td><td>Esta pinça fina de aço inoxidável é ideal para a preparação do trato gastrointestinal de espécimes de consumo.</td></tr><tr><td>DNA-ExitusPlus</td><td>AppliChem</td><td>A7409,1000RF</td><td>Solução de descontaminação para a remoção de contaminações por DNA e RNA</td></tr> toalha <tr><td>de papel sem penugem</td><td>Qualquer</td> balança <td>de laboratório NA</td><td></td></tr><tr><td>Qualquer</td><td>precisão</td><td>NA</td><td>precisa ser de pelo menos 0,01 g.</td></tr><tr><td>Pipetas de microlitros (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 &mu; L)</td><td>Quaisquer</td> tubos <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 2,0 ml</td><td>VWR</td><td>211-2165</td><td>É crucial que estes tubos de reação estejam livres de inibidores de DNA, DNase, RNase e PCR (PCR clean)!</td></tr><tr><td>Tubos Safe-Lock 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>211-2164</td><td>É crucial que estes tubos de reação estejam livres de inibidores de DNA, DNase, RNase e PCR (PCR clean)!</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio &ge; 99,5%, p.a., ACS, ISO</td><td>carlroth</td><td>3957.3</td><td>Para tampão de extração de sal (SEB) e solução de NaCl 5M necessária para extração de DNA.</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)-aminometano Tris</td><td>carlroth</td><td>4855.2</td><td>Para tampão de extração de sal (SEB) e tampão TBE</td></tr><tr><td>Pipetas de microlitro (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 &mu; L)</td><td>carlroth</td><td>8043.1</td><td>Para tampão de extração de sal (SEB) e tampão TBE</td></tr><tr><td>Ácido bórico &ge; 99,8 %, a.a., ACS, ISO</td><td>carlroth</td><td>6943.2</td><td>Para tampão TBE. Não é necessário se for obtido tampão TBE disponível comercialmente.</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td> <td>carlroth</td><td>4360.1</td><td>Para extração de DNA</td></tr><tr><td>proteinase K liofil.</td><td>carlroth</td><td>7528.1</td><td>Preparar uma solução de trabalho contendo 10 mg/ml.</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Quiagen</td><td>85300</td><td>Moinho de esferas para homogeneização das amostras.</td></tr><tr><td>Contas de aço inoxidável, 5 mm</td><td>Quiagen</td><td>69989</td><td>Para homogeneização de amostras.</td></tr><tr><td>Aquecimento Thermoshaker</td><td>Qualquer</td><td>misturador de</td> vórtice NA <td></td></tr><tr><td></td><td>Qualquer</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada: himac CT 15 RE</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td>Centrífuga refrigerada usada para centrifugação durante a extração de DNA (Protocolo 1).</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>carlroth</td><td>6752,5</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 99,8 %, a.a.</td><td>Qualquer</td> água <td>de NA</td><td></td></tr><tr><td>Grau de biologia molecular (ddH2O)</td><td>AppliChem</td><td>A7398,1000</td><td>água livre de nuclease (esterilizada por fluxo e tratada com DEPC) usada para ressuspensão de DNA e sempre que referida a ddH2O dentro do manuscrito</td></tr><tr><td>Olegonucleotídeos não modificados</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>NA</td><td>Primers não rotulados</td></tr><tr><td>Olegonucleotídeos</td> <td>modificadosMetabion International AG</td><td>NA</td><td>Primers rotulados</td></tr><tr><td>peqGOLD Taq all inclusive</td><td>VWR Peqlab</td><td>01-1000</td><td>Taq all inclusive para misturas de reação PCR (tampão de reação Y e S, dNTPs e MgCl2)</td></tr><tr><td>Termociclador de gradiente avançado Primus 96 ou peqStar96x Universal Gradient</td><td>Peqlab</td><td>NA</td><td>Os conjuntos de primers foram originalmente estabelecidos em um termociclador de gradiente avançado Primus 96. Como este ciclador era bastante antigo, verificamos se nossos conjuntos de primers são eficientes e específicos nas mesmas condições usando o peqSta96x (que também poderia simular o modelo mais antigo). No entanto, os testes mostraram que nossos primers funcionam bem e ainda são específicos (ver Koester et al. 2013) sem usar a simulação da máquina antiga.</td></tr><tr><td>Placas de PCR padrão de 96 poços</td><td>VWR Peqlab</td><td>732-2879</td><td>Usado para reações de PCR.</td></tr><tr><td>Faixas de tubo de baixo perfil 0,15 ml com listras de tampa plana</td><td>VWR Peqlab</td><td>732-3223</td><td>Listras de tampa usadas para fechar as placas de PCR.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Peqlab</td><td>35-1020</td><td>Usado para eletroforese em gel.</td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Qualquer</td><td>balão</td> cônico NA <td></td></tr><tr><td></td><td>Qualquer</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de medição</td><td>Qualquer</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de eletroforese horizontal e respectivos pentes com dentes</td><td>Qualquer</td><td>NA</td><td>Para eletroforese em gel de agarose.</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação de eletroforese PS3002</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Solução de brometo de etídio 1 %</td><td>carlroth</td><td>2218.1</td><td>Usado para preparar banho de coloração para géis de agarose.</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>carlroth</td><td>6749.1</td><td>Necessário para o tampão de desnaturação para análises SSCP.</td></tr><tr><td>Azul de bromfenol</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td>Necessário para o corante de carregamento para eletroforese em gel de agarose.</td></tr><tr><td>Carlroth</td> <td>de sacarose</td><td>4621.1</td><td>Necessário para o corante de carregamento para eletroforese em gel de agarose.</td></tr><tr><td>100 bp-DNA-Ladder estendido</td><td>carlroth</td><td>T835.1</td><td>Como padrão de tamanho para eletroforese em gel de agarose.</td></tr><tr><td>Sistema de documentação UV</td><td>Qualquer</td><td>NA</td><td>Para visualizar os resultados da eletroforese em gel.</td></tr><tr><td>Rotiphorese NF-Acrilamida/Solução de Bis 40 % (29:1)</td><td>carlroth</td><td>A121.1</td><td>Para a preparação de géis de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Peroxidissulfato de amônio</td><td>carlroth</td><td>9592.2</td><td>Para a preparação de géis de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>clipes dobráveis (32 mm)</td><td>Qualquer</td><td>NA</td><td>Para a preparação de géis de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>caixa de plástico quadrada (21 &vezes; 6,5 &vezes; 5 cm)</td><td>Qualquer</td><td>NA</td><td>Para a preparação de géis de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>carlroth</td><td>23.67.1</td><td>Para a preparação de géis de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Béquer</td><td>Qualquer</td><td>chiller digital NA</td><td></td></tr><tr><td>RC 10</td><td>VWR</td><td>462-0138</td><td>Para análises SSCP utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Unidade de eletroforese vertical P10DS (OWL Separation Systems)</td><td>VWR</td><td>700-2361</td><td>Para análises SSCP usando eletroforese em gel de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Placa de vidro entalhada</td><td>VWR</td><td>730-0261</td><td>Para análises SSCP utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Placa de vidro em branco</td><td>VWR</td><td>730-0260</td><td>Para análises SSCP utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Espaçadores</td><td>VWR</td><td>730-0262</td><td>Para análises SSCP utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Pente com 25 dentes</td><td>VWR</td><td>730-0294</td><td>Para análises SSCP utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Plataforma de agitação</td><td>Qualquer</td><td>NA</td><td>Para agitação constante do banho de coloração.</td></tr><tr><td>Mancha de ácido nucleico GelStar (Lonza Rockland, Inc.)</td><td>Biozym</td><td>850535 (50535)</td><td>Para coloração de géis de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Kit Padrão de Tamanho de DNA GenomeLab 400bp</td><td>AB Sciex</td><td>608098</td><td>Para análises automatizadas de fragmentos. Padrão de tamanho para o lote B.</td></tr><tr><td>Kit Padrão de Tamanho de DNA GenomeLab 600bp</td><td>AB Sciex</td><td>608095</td><td>Para análises automatizadas de fragmentos. Padrão de tamanho para o lote A.</td></tr><tr><td>Solução de Carregamento de Amostras (SLS)</td><td>AB Sciex</td><td>608082</td><td>Para análises automatizadas de fragmentos.</td></tr><tr><td>Placa de sequenciamento - 96 Poços de polipropileno PCR Microplate</td><td>Costar</td><td>6551</td><td>Para análises automatizadas de fragmentos.</td></tr><tr><td>Centrífuga de placas, centrífuga de mini placas PerfectSpin P</td><td>VWR Peqlab</td><td>NA</td><td>usada para desfiar produtos de PCR.</td></tr><tr><td>Placa tampão - 96 poços EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate</td><td>Corning</td><td>9017</td><td>Para análises automatizadas de fragmentos.</td></tr><tr><td>GenomeLab Tampão de separação</td><td>AB Sciex</td><td>608012</td><td>Para análises automatizadas de fragmentos.</td></tr><tr><td>Gel de Separação - LPAI</td><td>AB Sciex</td><td>608010</td><td>Para análises automatizadas de fragmentos.</td></tr><tr><td>Sequenzer - CEQ8000 Sistema de Análise Genética</td><td>Beckman Coulter</td><td>NA</td><td>Para análises automatizadas de fragmentos.</td></tr><tr><td>GeneMarker V1.95</td><td>Softgenetics</td><td>NA</td><td>Para analisar os resultados de análises automatizadas de fragmentos.</td></tr></tbody></table>

protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rdna usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos primers

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analisar tróficas é essencial para uma melhor compreensão dos ecossistemas. Por exemplo, comida web interações podem sofrer graves alterações causadas pela invasão de espécies não-nativas. No entanto, a identificação exata das interações predador-presa de campo é difícil em muitos casos. Essas análises são frequentemente baseadas em uma avaliação visual do conteúdo do intestino ou a análise de isótopos estáveis (δ15N e δ13C). Esses métodos exigem conhecimento abrangente sobre, respectivamente, diversidade morfológica ou assinatura isotópica de organismos individuais presas, levando a obstáculos na identificação exata dos organismos de rapina. Análises de conteúdo Visual intestino especialmente subestime organismos suave rapina encorpado, porque maceração, ingestão e digestão de presas organismos dificultam a identificação de espécies específicas. Portanto, estratégias de reação em cadeia (PCR) com base de polimerase, por exemplo o uso de primer grupo específico define, fornecer uma ferramenta poderosa para a investigação de interações web de comida. Aqui, descrevemos protocolos detalhados para investigar o conteúdo do intestino dos consumidores de macroinvertebrados do campo usando conjuntos específicos de grupo primário para ácido desoxirribonucleico de ribosomal nuclear (rDNA). DNA pode ser extraído a partir de espécimes inteiro (no caso de pequenos táxons) ou do conteúdo do intestino de espécimes coletados no campo. Presença e eficiência funcional dos modelos de DNA precisam ser confirmada diretamente do indivíduo testado usar primer universal define visando a respectiva subunidade de DNA. Também demonstramos que presa consumida pode ser determinada mais para baixo ao nível de espécie através de PCR com primers de grupo específicas sem modificações combinadas com análises de polimorfismo (SSCP) conformação subsequente único fio usando géis de poliacrilamida. Além disso, mostramos que o uso de corantes fluorescentes diferentes como rótulos permite rastreio paralelo de fragmentos de DNA de presas diferentes grupos de várias amostras de conteúdo intestino através de análise automatizada de fragmento.

Usamos com sucesso as etapas descritas neste protocolo para análises de dieta dentro de diferentes estudos. Nesta seção, apresentamos exemplos descrevendo a aplicabilidade das diferentes secções do protocolo.
Por exemplo, para demonstrar a eficácia dos conjuntos específicos de grupo primário estabelecido pelos autores28 e o potencial de mais a jusante as análises de produtos PCR por análises SSCP, foi con...

Análises de conteúdo de intestino mais comuns de macroinvertebrados são visuais. Exigindo intenso conhecimento sobre diversidade morfológica de organismos de presas, eles falta suave rapina encorpada e, devido à forte cominuição de rapina, são quase impossíveis para alguns organismos, incluindo anfípodes. Nós fornecemos abordagens genéticas detalhadas, a novela de macroinvertebrados presas identificação na dieta de anfípodes.

Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

O objetivo geral deste protocolo é aprimorar investigações de ecologia trófica, especialmente a partir de amostras de campo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da ecologia de teias alimentares, como o impacto de espécies invasoras sobre interações tróficas. A principal vantagem é a aplicação adicional a análises tróficas com integração temporal mais ampla para os mesmos espécimes exatos e que pode ser aplicado por praticamente qualquer ecólogo.Embora tenhamos estabelecido esta abordagem para obter informações sobre o consumo de presas por consumidores aquáticos, ela também pode ser aplicada para outras finalidades, por exemplo, para determinar a composição de espécies em amostras de macroinvertebrados bentônicos. O procedimento será demonstrado por Christian Sodemann, um técnico do nosso laboratório. Para iniciar este experimento, transfira o trato gastrointestinal previamente dissecado do predador para um tubo de reação com fechamento seguro de dois mililitros contendo 440 microlitros de tampão de extração salina.Congele imediatamente as amostras a menos 20 graus Celsius até a extração de DNA. Após retirar as amostras do congelador, inicie a extraçã

laboratory-protocol-for-genetic-gut-content-analyses-aquatic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Esta publicação descreve como usar o Peixe Agilent Sistema de Identificação de Espécies para identificar as espécies de peixe através da extração de DNA e realização de PCR e análise de RFLP.

Baseados em DNA Peixe Protocolo Identificação de Espécies

A comunidade bacteriana activa associada ao intestino de Spodoptera littoralis, foi determinada por-estável-sondagem isótopo (SIP) acoplado a pyrosequencing. Usando essa metodologia, a identificação das espécies de bactérias metabolicamente ativas dentro da comunidade foi feito com alta resolução e precisão.

Identificação de bactérias metabolicamente ativas no intestino do Generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA Isótopos Estáveis ​​Sondagem Usando<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glicose

PCR combinada com a análise de fusão de alta resolução (HRMA) é demonstrado como um método rápido e eficiente para a genotipagem de peixe-zebra.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Um protocolo para quantificar genes bacterianos de rRNA 16S e transcritos de sedimentos costeiros por meio de PCR em tempo real é fornecido. A metodologia inclui a coextração de DNA e RNA; preparação de RNA livre de DNA; e quantificação do gene 16S rRNA e transcrito via RT-q-PCR, incluindo construção de curva padrão.

DNA-RNA simultânea de extração de sedimentos costeiros e quantificação de 16S rRNA genes e transcritos por PCR em tempo real

Nós apresentamos um protocolo para a avaliação funcional de bibliotecas de um único site saturação mutagênese abrangentes de proteínas utilizando sequenciamento de alto rendimento. É importante ressaltar que essa abordagem usa pares de primers ortogonais multiplex construção da biblioteca e sequenciamento. Os resultados representativos utilizando TEM-1 β-lactamase seleccionado a uma dosagem clinicamente relevante de ampicilina são fornecidos.

Um Protocolo de Avaliação Funcional da Whole-Protein saturação mutagênese Bibliotecas Utilizando-High Throughput Sequencing

Este manuscrito descreve um protocolo padronizado detalhado de arranjar em sequência do elevado-throughput 16S rRNA-amplicon. O protocolo apresenta um protocolo integrado, uniformizado, viável e barato a partir de coleta de amostra fecal através de análises de dados. Este protocolo permite a análise de um grande número de amostras com padrões rigorosos e vários controles.

Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação

Aqui, descrevemos um protocolo para obter dados de sequência de amplicons da rizosfera, solo e raiz endosphere microbiomes. Esta informação pode ser usada para investigar a composição e diversidade de comunidades microbianas associadas a planta e é apropriada para o uso com uma ampla gama de espécies de plantas.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

Zebrafish têm sido usados como organismos modelo genético confiável na investigação biomédica, especialmente com o advento das tecnologias de edição de gene. Quando os fenótipos larvas são esperados, identificação de DNA de extração e genótipo pode ser desafiador. Aqui, descrevemos um procedimento eficiente de genotipagem para larvas de peixe-zebra, por cauda de recorte, tão cedo quanto pós-fertilização 72-h.

Extração de DNA do elevado-throughput e genotipagem de larvas de Zebrafish 3dpf por Fin recorte

Este protocolo descreve uma abordagem eficaz de hibridização in situ para detectar os níveis de expressão mRNA e padrões espaciais de genes-alvo em fluido coelomico Sipunculus nudus.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Os ensaios de DNA ambiental requerem um design rigoroso, testes, otimização e validação antes que a coleta de dados de campo possa começar. Aqui, apresentamos um protocolo para levar os usuários através de cada etapa de projeto de um ensaio qPCR específico da espécie, baseado em sonda para a detecção e quantificação de dna de uma espécie-alvo a partir de amostras ambientais.

Desenvolvimento e teste de ensaios quantitativos de PCR específicos para aplicações de DNA ambiental

O protocolo detecta os principais genes do ciclo de metano nas zonas úmidas costeiras do sul do Texas e visualiza sua distribuição espacial para melhorar a compreensão da regulação do metano e seus impactos ambientais nesses ecossistemas dinâmicos.

Visualizando a dinâmica microbiana do ciclo de metano em zonas úmidas costeiras

Aprenda análises genéticas de conteúdo intestinal de macroinvertebrados aquáticos usando primers grupo-específicos. Este método melhora investigações de ecologia trófica e interações em teias alimentares.

Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers (Vídeo) | JoVE Journal

Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers

Explorar mais vídeos