Estereotáxica guiada por Atlas Laser Microdissection de captura de regiões do cérebro afetadas por lesão traumática
11 de setembro de 2017
Nós descrevemos o uso do laser microdissection de captura para obter amostras de populações de células distintas de regiões diferentes do cérebro para análise genética e microRNA. Esta técnica permite o estudo dos efeitos diferenciais de traumatismo crânio-encefálico em regiões específicas do cérebro de ratos.
O objetivo geral deste protocolo de microdissecção por captura a laser é coletar células de regiões cerebrais específicas afetadas por lesão cerebral traumática para análise molecular. Eu sou a doutora Helen Hellmich. Meu assistente de pós-graduação, Harris Weisz, que é estudante do programa de Fisiopatologia Humana e Medicina Translacional aqui no ramo médico da Universidade do Texas, vai demonstrar como usamos métodos de microdissecação por captura a laser em nossos estudos de lesão cerebral.
Este método pode ajudar a elucidar os mecanismos e consequências das alterações induzidas pelo TCE em regiões cerebrais discretas, como o córtex frontal, que controla as funções executivas. E hipocampo, que é importante para processos dependentes da memória. A principal vantagem dessa técnica é que podemos estudar o efeito de um processo de doença em várias regiões cerebrais discretas ou tipos de células individuais do mesmo cérebro.
Antes de qualquer procedimento de LCM anterior que inclua análise transcricional, limpe todas as superfícies com detergente eliminador de RNace para mitigar o risco de contaminação e degradação do RNA. Recupere o tecido cerebral do armazenamento. E coloque em um cirostato resfriado a menos 20 graus Celsius.
Deixe o cérebro se equilibrar à temperatura da câmara do criostato por aproximadamente dez minutos. Coloque o cérebro, com o lado ventral para cima, em uma folha de gaze no topo do estágio de criostato. Com uma lâmina de barbear de RNA limpa, corte a porção posterior logo rostral ao cerebelo e a porção logo anterior ao quiasma óptico.
Coloque uma pequena quantidade de meio de temperatura de corte ideal em dois moldes criogênicos separados. Coloque o cérebro contendo o córtex de associação frontal e o núcleo accumbens em um molde criogênico com o lado interno voltado para baixo. Adicionar OCT suficiente para cobrir o tecido.
Repita esta etapa com o pedaço de tecido cerebral contendo o hipocampo e o núcleo supraquiasmático. Deixar o meio OCT congelar completamente durante cerca de 20 minutos no criostato. Quando o tecido e o meio OCT estiverem completamente congelados, esprema uma pequena quantidade de OTC em um cabeçote de montagem.
Pressione um criomoldor congelado na cabeça de montagem e deixe a OCT congelar completamente para que o molde contendo o tecido fique firmemente preso à cabeça. Prenda o acessório da cabeça ao suporte de corte e aperte o parafuso. Ajuste o ângulo de corte em relação à lâmina do criostato com as alavancas de ajuste para garantir que as seções sejam cortadas uniformemente.
Defina a espessura da seção para 30 mícrons. Ao seccionar o bloco de tecido contendo o hipocampo e o NEE, corte até que o quiasma óptico seja achatado em bregma 0,48 milímetros Quando o terceiro ventrículo se tornar aparente. Em seguida, colete seções para o SEM a partir deste ponto, colocando suavemente lâminas de membrana de naftalato de polietileno à temperatura ambiente em cima do tecido seccionado.
Garanta visualmente a aderência à lâmina, confirmando que o tecido e o OTC estão completamente derretidos na lâmina. Armazene todas as lâminas com seções de tecido no criostato até a coloração. Pare as seções de coleta em bregma 0,72 milímetros quando a decussação supraóptica começar.
Para a coleta do hipocampo, corte até que os chifres do giro dentado da camada de células granulares sejam visíveis em bregma 3,00 milímetros. Colete seções até que os subcampos CA do hipocampo sejam fundidos nas seções coronais em bregma 4,78 milímetros. Isso permite a coleta completa do hipocampo sob a craniotomia e o local da lesão.
Antes da coloração, lave todas as louças e a área de coloração em um exaustor químico com detergente eliminador RNase. Retire o rack de laterais do criostato e coloque na hotte. Deixe as lâminas aquecerem por 30 segundos.
Manchar as seções com violeta cresil e limpar com solução salina. Deixe o rack de lâminas manchadas secar ao ar por não mais de dez minutos à temperatura ambiente na hotte. Depois de seco, prossiga imediatamente para o LCM.
Antes de iniciar qualquer procedimento de LCM para análise de RNA, limpe a área de coleta e a área ao redor do dispositivo com detergente eliminador de RNAse e etanol 100%. Gire o botão liga/desliga na unidade geradora de laser infravermelho antes de ligar a base do microscópio e permita que o sistema inicialize antes que o software seja iniciado na área de trabalho. Depois que o software for inicializado e executado, embora seja inicializado, abra o painel de configuração do software e pressione o botão de estágio atual.
O palco modular se moverá para a posição onde as tampas e slides macro do LCM serão carregados e descarregados. Coloque até três lâminas de membrana de caneta nos suportes com a borda fosca voltada para a direita. Selecione a área de manuseio da tampa e da lâmina ao lado da respectiva lâmina e clique na caixa de seleção MEM para informar ao software que as lâminas de vidro de membrana foram carregadas.
Em seguida, clique no slide desejado para ser capturado primeiro. Para capturar uma imagem lado a lado para localização e orientação do tecido para posicionamentos de tampa, selecione imagem na barra de ferramentas e selecione adquirir visão geral. Coloque o cursor sobre a área na imagem lado a lado, clique com o botão direito do mouse e selecione colocar tampa no centro da região.
O software colocará automaticamente uma tampa sobre a posição selecionada. Depois de localizar os lasers infravermelho e UV, escolha a opção de desenho à mão livre no painel de ferramentas de seleção. Usando a caneta da tela sensível ao toque, desenhe ao redor do perímetro da região de interesse, certificando-se de não perder o contato entre a tela sensível ao toque e a cabeça da caneta.
Certifique-se de conectar os pontos inicial e final. Para a coleta do hipocampo, capturar a laser os subcampos do hipocampo CA1, CA2 e CA3 começando em bregma 3,00 milímetros e usando a camada granular completamente formada do giro dentado como um marco físico de identificação morfológica. Após a coleta, mova as tampas macro LCM para a posição de controle de qualidade e inspecione a aderência completa do tecido, garantindo visualmente que o tecido cortado por UV esteja preso à membrana.
É imperativo que o laser UV corte todo o tecido. Não fazer isso resultará em aderência incompleta do tecido à tampa LCM. Em seguida, coloque rapidamente cada tampa em um tubo de reação de parede diluída de 0,5 mililitro livre de RNAse contendo 100 microlitros de tampão lisus celular.
Vortex as amostras brevemente para garantir lisus completo e armazene a menos 80 graus Celsius até que esteja pronto para realizar a análise genômica a jusante. A seguir estão imagens representativas de seções de tecido coletadas do lado epcilateral do local da lesão com funções de laser infravermelho e UV no sistema LCM. Esta é uma área do córtex de associação frontal.
Esta imagem mostra a mesma região após a coleta. E este é o tecido na tampa após a coleta. Esta imagem mostra os componentes das camadas parameatais CA1, CA2 e CA3 do hipocampo localizadas próximas aos cornos totalmente formados da camada granual do giro denteado.
As regiões CA2 e CA3 foram coletadas e essas populações de células são vistas na tampa. Aqui, uma área do núcleo accumbens proximal adrostral à comissura anterior foi alvejada foi reproduzida fielmente na tampa. Por fim, o núcleo supraquiasmático rostral ao quiasma supraóptico foi capturado pelo LCM após TCE.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para processar um cérebro em aproximadamente oito horas. Isso inclui processamento de tecidos, coloração e LCM. Após este procedimento, outros métodos, como a análise epigenética, podem ser realizados para responder a perguntas sobre padrões de metilação ou expressão micrônica.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como realizar o LCM em várias regiões do cérebro no mesmo cérebro.
Visão Geral
Este artigo descreve o uso da microdissecção a laser com captura (LCM) para obtenção de populações celulares específicas de diversas regiões cerebrais de ratos, a fim de analisar a expressão gênica e de microRNAs. A técnica aprimora a compreensão dos impactos diferenciais da lesão cerebral traumática (TBI) em regiões cerebrais distintas, como o córtex frontal e o hipocampo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Análise Molecular
Contexto
- O TCE pode causar efeitos variados em diferentes regiões cerebrais.
- O entendimento desses efeitos em nível celular exige técnicas precisas de amostragem.
- A MLC permite a análise direcionada de tipos celulares específicos sem contaminação.
- Este estudo envolve implicações práticas e metodológicas para a pesquisa em neurociência.
Objetivo do Estudo
- Utilizar a MCL para isolar células cerebrais afetadas pelo TCE.
- Analisar a expressão gênica e de microRNAs relevante para o TCE.
- Elucidar as consequências moleculares do TCE em áreas cerebrais selecionadas.
Métodos Utilizados
- A microdissecção a laser (LCM) é a plataforma principal utilizada.
- O modelo biológico consiste em tecidos cerebrais de rato, com foco específico em regiões afetadas pelo TCE.
- O estudo estabelece cronogramas críticos para o preparo do tecido, corte e coloração.
- Ênfase é dada a cuidadosas medidas de prevenção de contaminação ao longo do protocolo.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de populações celulares-alvo de regiões como o córtex frontal e o hipocampo.
- Compreensão das alterações induzidas pelo TCE em nível molecular, apoiando futuros estudos mecanicistas.
- Identificação de estágios críticos de seccionamento e coloração para coleta confiável de RNA.
Conclusões
- O estudo demonstra como a MLC pode facilitar análises moleculares direcionadas dos efeitos do TCE.
- As implicações incluem uma melhor compreensão dos mecanismos neuronais afetados pelo trauma.
- Este método aumenta a precisão na pesquisa em neurociência e oferece caminhos para a exploração terapêutica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microdissecção a laser (LCM) permite o perfil molecular preciso de regiões cerebrais discretas afetadas por lesão cerebral traumática (TBI), apoiando a validação de alvos por meio de análise espacialmente resolvida da expressão gênica e de microRNAs. Essa abordagem reduz sinais confundidores provenientes de tecidos heterogêneos, melhorando a confiança preditiva na desvinculação mecanicista de vias associadas ao TBI. Ao isolar respostas específicas de regiões a partir do mesmo animal, a LCM aumenta a continuidade translacional e a triagem de portfólios na descoberta em neurociência.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao isolar regiões afetadas pelo TCE, como córtex frontal e hipocampo, para esclarecimento de vias.
- Valor Operacional: Oferece validação de alvos com menor risco biológico por meio de análise molecular com resolução espacial, sem artefatos decorrentes da dissociação tecidual.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao associar alterações na expressão gênica específicas de região a desfechos funcionais nos processos executivos e de memória.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para ensaios genômicos subsequentes, preservando a integridade espacial e a posição nativa das regiões cerebrais.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio do corte orientado por marcos anatômicos com o uso de um atlas do cérebro de rato.
- Valor de Escalabilidade: Permite a avaliação confiável de compostos ao fornecer leituras moleculares quantitativas e específicas de regiões cerebrais discretas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Mantém a relevância para a doença ao permitir a análise de alterações induzidas pelo TCE na expressão gênica e de microRNAs em áreas cerebrais anatomicamente definidas.
- Continuidade Pré-clínica: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao permitir o perfil molecular longitudinal desde a fase de descoberta até as etapas pré-clínicas.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Foca no valor preditivo ao isolar alterações moleculares causais em regiões discretas, em vez de médias de tecido inteiro.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A MCL se insere no continuum de descoberta desde a identificação de alvos até a otimização de compostos líderes e a validação pré-clínica, permitindo análises orientadas por hipóteses sobre os mecanismos de LCT em regiões cerebrais-chave.
- Biologia do Descobrimento: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao isolar populações celulares específicas de regiões afetadas por lesões, como o núcleo accumbens e o núcleo supraquiasmático.
- Triagem: Garante a prontidão do ensaio por meio de seccionamento padronizado em coordenadas definidas de bregma e processamento livre de RNasee para obtenção confiável de RNA.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de variáveis dependentes, incluindo perfis de expressão gênica e de microRNA a partir de tecido capturado por laser.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas ao trabalho pré-clínico, permitindo análises epigenéticas e de metilação após a microdissecção por captura a laser, conforme indicado no protocolo.
- Reutilização Institucional: Funciona como uma capacidade reutilizável em diferentes modelos de doenças, com princípios aplicáveis a estudos de expressão genômica em outros contextos de lesão ou doença.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista na análise de vias de lesão cerebral traumática (TBI).
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio de cortes em criostato, orientação por atlas e fluxos de trabalho controlados por RNase.
- Valor Estratégico: Melhores decisões de prosseguir/interromper, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados mediante o isolamento de respostas moleculares específicas de região.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base no alinhamento de biomarcadores com resolução espacial.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em neuroanatomia, seccionamento em criostato e instrumentação de microdissecção a laser.
- Depende de ambientes livres de RNase, criostato a -20°C, meio de temperatura de corte ótima e sistemas a laser UV/IV.
- Necessita padronização entre equipes para protocolos de coloração, coleta de seções e carregamento de tampas nas equipes de neurociência e biologia molecular.
- As considerações para adaptação incluem o ajuste das coordenadas de seccionamento baseadas no bregma para diferentes regiões cerebrais e modelos animais.
- As limitações práticas incluem a necessidade de controle rigoroso de contaminação e proficiência técnica no rastreamento com laser UV para garantir a aderência completa do tecido.
