Name: Estereotáxica guiada por Atlas Laser Microdissection de captura de regiões do cérebro afetadas por lesão traumática (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprenda microdissecção por laser para isolar células de regiões cerebrais específicas afetadas por lesão traumática em ratos. Esta técnica permite análise molecular precisa de expressão gênica e microRNA em neurociência.

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Nós gostaríamos de reconhecer Elizabeth Sumner para editar este manuscrito a ajuda dela. Financiamento para este projeto foi fornecido em parte pelo The Moody Project para investigação de lesão cerebral traumática translação e RO1NS052532 para HLH.

Nota: todas as experiências com animais são aprovadas pelo Comité de uso da University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas e institucional Cuidado Animal como dirigido pelo institutos nacionais da saúde guia para o cuidado e o uso de Animais de laboratório (8ª edição, Nacional Conselho de investigação).
 1. coleta de tecido, identificação de região e Set Sectioning <ol><li>assunto, homem adulto, ratos Sprague-Dawley, aproximadamente seis semanas de idade e 250-300 g, a lesão de percussão fluidos experimental, conforme descrito em Shimamura et al. 4.</li> <li>vinte e quatro horas depois da TBI experimental, humanamente eutanásia dos animais, colocando-os em uma câmara com uma concentração de isoflurano de 4% até profundamente anestesiada. Certifique-se de morte por decapitação, excisar o cérebro e congelar imediatamente em gelo seco em pó. Loja de congelados cérebros em um freezer-80 ° C até seccionamento.</li>
	<li>Antes de qualquer procedimento de LCM que inclui análise transcricional, limpe todas as superfícies com RNase eliminando detergente para mitigar o risco de contaminação e degradação do RNA. 
	Nota: Esta limpeza inclui a área utilizada para a coloração, o criostato onde o tecido é seccionado, e a área em torno do dispositivo de LCM.</li>
	<li>Recuperar o tecido cerebral de armazenamento e o lugar em um criostato resfriado a -20 ° C. permitir que o cérebro para equilibrar a temperatura da câmara do criostato de ~ 10 min.</li>
	<li>Lugar do lado ventral do cérebro em uma folha de gaze em cima do palco do criostato. Com uma lâmina de barbear limpa, livre de RNase, cortar a porção posterior apenas rostral do cerebelo (podem ser salvas ou descartadas) e a parte apenas à frente do quiasma óptico (och).</li>
	<li>Colocar uma pequena quantidade de meio de temperatura (OCT) corte ideal em duas cryomolds distintas. Coloque o cérebro (contendo a córtex frontal associação (FrA) e o núcleo accumbens núcleo (AcbC)) no lado anterior do cryomolds para baixo. Adicione meio de OCT suficiente para cobrir o tecido.
	<ol><li>Repita este passo com o tecido do cérebro que contém o hipocampo (cavalo-força) e o núcleo supraquiasmático (SCN).</li>
		<li>Permitir a médio OCT congelar completamente por ~ 20 min no criostato.</li>
	</ol></li> <li>Uma vez que o tecido e médio OCT estão completamente congelados, espremer uma pequena quantidade de outubro para uma cabeça de montagem e pressione o cryomolds congelado contendo o tecido na cabeça da montagem. Permitir a OCT congelar completamente, para que o molde que contém o tecido firmemente presa na cabeça.</li>
	<li>Fixar o acessório de cabeça para a montagem do corte e aperte o parafuso. Ajustar o ângulo de corte em relação a lâmina do criostato com as alavancas de ajuste para garantir as seções são cortadas uniformemente.</li>
	<li>Definir a espessura de corte de 30 µm. Quando o bloco de tecido contendo a FrA e AcbC de seccionamento, começar primeiro corte até o córtex cerebral é aparente e em seguida iniciar coleta.</li>
	<li>Referindo-se aos 12 Atlas do cérebro de rato, seção e coletar cérebro secções colocando delicadamente slides de membrana de napthalate (caneta) de polietileno de temperatura em cima do tecido seccionado para o FrA até o córtex motor secundário (M2 ) é atingido em Bregma 5,16 mm.
	<ol><li>Visualmente garantir aderência ao deslize inspecionando-se tecido e OCT são completamente derretido para slide. Armazene todas as lâminas com cortes de tecido em criostato até coloração.</li>
	</ol></li> <li>Continuar o corte até a comissura anterior (aca) torna-se visível e une em uma comissura completa debaixo dos ventrículos laterais agora aparentes (LV) Bregma 1,80 mm.</li>
	<li>Recolher seções até os LVs aparecem para se conectar com a aca no Bregma 0,84 mm.</li>
	<li>Concluída a corte para o FrA e AcbC, remover o bloco de tecido montado e substitua o bloco contendo HP e SCN.</li>
	<li>Seção até o och é achatada no Bregma-0,480 mm, quando o terceiro ventrículo (3V) torna-se aparente.</li>
	<li>Recolher seções para o SCN deste ponto até Bregma-0,720 mm, quando começa a decussation supra-óptico (sox). 
	Nota: Pode ser necessário recolher mais cortes histologicos em todo o och como o SCN é facilmente preterido.</li>
	<li>Para a coleção de HP, seção até os chifres de célula grânulo camada dentate gyrus (GrDG) são visivelmente aparente no Bregma mm-3,000.</li>
	<li>Recolher seções até os subcampos de CA hippocampal são fundidos nas secções coronais em Bregma-4,780 mm. Este detalhe permite a coleção completa do hipocampo sob o site craniotomia e lesão. 
	Nota: Conforme demonstrado em publicações anteriores deste laboratório, mais células lesadas será aparentes dentro desta escala e é adequado para análise de expressão do gene ou do microRNA.</li>
</ol> 2. Protocolo de coloração <ol><li>Prior de coloração, lavagem de todas as loiças e área de coloração em uma coifa química com detergente RNase-eliminando. Esta preparação reduz o risco de degradação de RNA devido à contaminação.</li>
	<li>Prepara todos os reagentes e soluções em nuclease coloração água livre.</li>
	<li>Tomar um rack de slides armazenados no criostato e lugar na coifa. Permitir slides aquecer por 30 s. lugá-los em coloração soluções (preparadas com água livre de nuclease) da seguinte forma: 75% EtOH por 1 min, nuclease livre da água por 1 min, violeta de cresilo 1% por 1 min, água livre de nuclease por 30 s, água livre de nuclease por 30 s , 95% EtOH por 30 s, 100% EtOH por 30 s, xileno por 3 min e xileno por 3 min.</li>
	<li>Permitir a cremalheira para secar ao ar livre para não mais de 10 min a temperatura ambiente a coifa. Como alternativa, coloque prateleiras em um dessecador vácuo Rnase-livre para secar mais rápido. Uma vez seco, proceder de imediato à LCM.</li>
</ol> 3. Estereotáxica Atlas guiados Laser capturar Microdissection com o sistema de LCM <ol><li>antes de iniciar qualquer procedimento de LCM para análise de RNA, limpe a área de coleção e a área em torno do dispositivo com RNase-eliminando detergente e 100% EtOH.</li>
	<li>Virar o interruptor de alimentação do laser IR unidade geradora antes de ligar o microscópio base e permitir que o sistema inicializar antes de software é iniciado a partir do desktop. 
	Nota: Se não concluído nesta ordem, o software não reconhecerá o microscópio.</li>
	<li>Uma vez que o software tem iniciado e executado através de suas etapas de inicialização, pressione a &#34; actual fase &#34; botão no software &#34; instalação painel. &#34; o palco modular irá mover para a posição onde a LCM Macro Caps e slides podem ser carregadas e descarregadas.</li>
	<li>Coloque os slides de membrana de caneta nos suportes das (até três de cada vez) com a borda fosco enfrentando para a direita. 
	Nota: Se for colocado no suporte na orientação errada, o software pode não ser capaz de reconhecer corretamente a área desejada de corte de UV ou IR.</li>
	<li>Clique o &#34; Mem &#34; checkbox no &#34; Cap e área de manipulação de Slide &#34; ao lado do respectivo slide (i.e., A, B ou C). Esta etapa denota se o slide é uma lâmina de vidro de membrana. Em seguida, clique no slide desejado para ser capturado primeiro.</li>
	<li>Para fazer a câmera tirar uma imagem lado a lado para localização de tecido e orientação para estágios cap, selecione &#34; imagem &#34; na barra de ferramentas e selecione &#34; adquirir visão... &#34; 
	Nota: Se o usuário está familiarizado com o tecido que está sendo coletado, esta etapa pode ser omitida, usando a bola de rolagem manual para posicionar o &#34; região centro &#34; para coleção.</li>
	<li>Coloque o cursor sobre a área na imagem lado a lado (ou localização relativa sem imagem lado a lado), botão direito do mouse e selecione &#34; tampa na região centro... &#34; o software irá automaticamente colocar uma tampa sobre a posição selecionada.</li>
	<li>Selecione um local. 
	Nota: Para garantir que o laser IR está corretamente alinhado e vai pegar só trata de áreas onde os pontos são colocados pelo software ele deve estar localizado antes de prosseguir.
	<ol>
		<li>Mover para uma área no âmbito da PAC, onde o tecido não está presente. Clique em &#34; eu &#34; no &#34; painel de ferramentas de Microdissect &#34; e selecione o &#34; IR Locate &#34; guia. Do painel, disparar um tiro para avaliar onde está a disparar o laser IR e o tamanho do ponto de teste do IR.</li>
		<li>Com o cursor, clique direito no meio de IR à vista e selecione &#34; localizado IR local. &#34; 
		Nota: O tamanho e intensidade do feixe de IR podem ser alterados manualmente alterando o &#34; poder, diâmetro ou duração &#34; sob Designador cada tamanho de ponto ou movendo a escala deslizante na parte inferior da caixa de diálogo. Vários tiros de teste podem precisar ser acionado para garantir tamanho de ponto adequado. O laser de IR deve ser re-colocado cada vez que a posição das mudanças de tampão ou slides são comutados.</li>
		<li>UV para corte, localize o laser UV, selecionando o &#34; UV Locate &#34; guia na caixa de diálogo. 
		Nota: Porque o laser UV e o laser IR se movem em uníssono, não há nenhuma necessidade para continuamente re-localizar cada vez que a posição é alterado o laser UV.</li>
	</ol></li> <li>Escolher o &#34; desenho à mão livre &#34; opção no &#34; selecione o painel de ferramentas &#34;. Usando uma caneta de tela sensível ao toque, desenhe ao redor do perímetro da região de interesse enquanto certificando-se de não perder o contacto entre o ecrã táctil e a cabeça de caneta. Certifique-se de conectar o início e pontos finais juntos. 
	Nota: Pontos de IR serão estabelecidos automaticamente através do software, mas o usuário pode optar por estabelecer pontos adicionais para garantir que o tecido é aderido a tampa depois executou-se corte UV.</li>
	<li>Coleção de FrA, executar uma captura de bruto do laser do tecido cortical até quando o córtex M2 aparece no Bregma 5,16 mm. 
	Nota: Este detalhe pode ser alterado tal que apenas partes específicas do FrA ou tipos de células específicas são coletados.</li>
	Coleção de <li>para AcbC, captura de laser perto de uma área na proximidade com a aca. 
	O núcleo e a casca da AcbC executam diferentes funções e são fisiologicamente exclusivos. Assim, é importante seguir o atlas do cérebro tão próximo quanto possível. Recomenda-se coletar de não mais adicional passado bregma 0,84 mm, como as duas sub-regiões tornam-se também intimamente associadas com os outros.</li>
	<li>Coleção para Hp, laser capturar o CA 1, 2 e 3 subcampos hippocampal iniciando no Bregma 3.00 mm e usando o GrDG completamente formado como um marco físico para identificação morfológica. 
	Nota: Para os fins deste estudo, não recolhem passado Bregma-4,780 mm, que pode ser visualmente demarcada como o ponto quando os subcampos de Hp são fundidos e apontam ventralmente. Esta área foi escolhida como ferido mais neurônios podem ser descobertos diretamente sob a lesão local 6.</li>
	<li>Para a coleção do SCN, primeiro identificar visualmente os núcleos densamente que sentar dorsal para o och e coletar.</li>
	<li>Após a coleta das regiões (listado acima), mover LCM Macro Caps para o &#34; posição de QC &#34; e inspecionar para aderência de tecido completa garantindo visualmente UV corta tecido é ligada à membrana. Rapidamente, coloque a tampa ontoan livre de RNase 0,5 mL reação murado fino tubo contendo 100 µ l de tampão de lise celular.</li>
	<li>Amostras de vórtice brevemente para assegurar a Lise completa e armazenar a-80 ° C. Neste ponto, LCM pode ser pausado e amostras armazenadas até usado para análise genômica a jusante 6.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Para estudos moleculares dos cérebros dos mamíferos, LCM tornou-se uma técnica essencial. Este artigo demonstra que usando a combinação de lasers de corte o IR e UV no sistema LCM pode capturar alterações genômicas em qualquer região do cérebro dos mamíferos. Estas regiões incluem aqueles identificáveis com manchas de LCM-compatível convencionais, tais como cresilo violeta ou hematoxilina e eosina. A velocidade do processo de captura de laser e capacidade de realizar LCM na espessa 30 µm seções nas corrediças de membrana de caneta permite não só obter quantidades suficientes de amostras de células, mas também para isolar o RNA de amostras de LCM de uma qualidade adequada para todos os tipos de jusante análise genômica; Estas análises incluem microarrays16e PCR matrizes17PCR em tempo real quantitativa18.
Nossos dados fornecem uma lógica para estudos que utilizam tecidos de LCM. Encontramos esse miR-15b é upregulated no hipocampo e córtex (Figura 4) mas o ativador no núcleo accumbens e pode ser biologicamente relevantes para a compreensão dos efeitos diferenciais da TBI no cérebro. Um estudo anterior sugeriu que aumentos na cortical vulnerabilidade neuronal a lesões resultam de superexpressão de vários miRNAs que regulam negativamente genes pro-sobrevivência, tais como Bcl-2,19. Programas de análise de varredura alvo Bcl-2 também é regulada por miR-15b; assim, nossos dados sugerem uma explicação mecanicista por que regiões específicas do cérebro (ou seja,, FCx) podem ser seletivamente vulneráveis a TBI. É importante lembrar que a maioria dos genes são regulados por vários miRNAs e correlacionar as alterações em qualquer um miRNA para um gene específico do alvo é difícil. Além disso, estes dados indicam que certas mudanças na expressão de gene e microRNA podem ser utilizadas como biomarcadores de lesão cerebral de regiões específicas. Na verdade, estamos usando atualmente estes dados em estudos de novo como neuroprotetor compostos de drogas com propriedades antidepressivas diferencialmente podem afetar a expressão de gene e microRNA em regiões do cérebro ligadas a distúrbios neuropsiquiátricos. Uma limitação do nosso estudo é que, durante as várias etapas dos processos de preparação de slides para o LCM, integridade do RNA pode tornar-se comprometida. Este protocolo descreve as etapas necessárias para atenuar o risco de degradação do RNA. Outra limitação é o tamanho de amostra relativamente pequeno usado para cálculo estatístico. No futuro, estudos, aumentando o tamanho da amostra devem diminuir os efeitos de variações de expressão de gene e miRNA entre animais individuais.
O benefício do LCM é realizado em estudos de genômicos translacionais usando modelos animais de doença humana e tecidos doentes20,21,22,23. Sem a capacidade de capturar as populações de células específicas, os perfis transcriptional de regiões diferentes do cérebro seria uma mistura de incognoscível e indecifráveis de muitos tipos de células. Usar métodos de LCM em estudos de lesão cerebral levou a esforços atuais para delinear biomarcadores específicos do cérebro região e entender como eles se correlacionam com biomarcadores de TBI de circulação.

O cérebro é extremamente complexa e heterogênea, com centenas de milhares de tipos de célula1. De fato, estudos em humanos demonstraram que em regiões como o córtex frontal, estruturais e diferenças funcionais na matéria branca e cinza são refletidas em distintas e divergentes transcriptional perfis2. Heterogeneidade do cérebro tem sido um grande obstáculo para interpretar os dados da expressão do gene e no campo da lesão cerebral. Essa ambiguidade em estudos pré-clínicos posteriormente levou a centenas de ensaios clínicos falhadas de tratamentos para lesões de cérebro3.
Nós usamos o laser captura microdissection (LCM) métodos para estudar a traumatismo crânio-encefálico (TCE)-induzido gene desregulagem no rato cérebro4, enfocando o hipocampo, uma região do cérebro que é essencial para a aprendizagem e memória5. A capacidade de captura de laser e analisar a expressão do gene em morrer e sobreviver de neurônios nos dá uma maior compreensão do papel do crescimento na expressão gênica, na determinação do resultado (sobrevivência neuronal) após TBI6. Técnicas de LCM também provaram útil para explorar os efeitos de TCE em neurônios hippocampal comparando-se8, de7 ou ratos ratos jovens e envelhecimento.
Em estudos recentes, examinamos a outras regiões do cérebro de ratos afetados negativamente pelo TBI, com foco em áreas em ratos e em pacientes humanos do TBI que estão associados com a função executiva (ou seja, o córtex frontal9) e comorbidades TBI; Estas comorbidades incluem depressão (ou seja, núcleo accumbens10) e distúrbios do ritmo circadiano (de núcleo supraquiasmático11). Em estudos anteriores, Huusko e Pitkanen12 e Drexel et al 13 usado LCM para examinar a expressão do gene no tálamo e hipotálamo. Nosso estudo baseia-se estas observações anteriores e inclui quatro outras regiões do cérebro. Para estudar as alterações moleculares específicas da região induzidas após TBI, era necessário ganhar experiência na identificação e obtenção de tipos de células nestas regiões usando um sistema de LCM. Os lasers de corte de UV e infravermelhos (IR) permitem microdissection preciso de regiões cerebrais desejado. Aqui, descrevemos como usamos este sistema LCM, guiado pelas coordenadas estereotáxicos no rato cérebro atlas14, para identificar e laser captura quatro rato regiões do cérebro que são diferencialmente afetadas pelo método de lesão cerebral experimental de fluido-percussão 4.

<table><tbody><tr><td>Sistema de Microdissecção de Captura a Laser Arcturus</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN Lâminas de Vidro de Membrana&nbsp;</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Capsure LCM caps</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Violeta Cresyl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Xileno (grau histológico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 prova (grau histológico)</td><td>UTMB Pharmacy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous Micro-Kit</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Gene Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>Taqman microRNA Expression Primer/Probes</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>A25576</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 96 System</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estereotáxica guiada por atlas laser microdissection de captura de regiões do cérebro afetadas por lesão traumática

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

A capacidade de isolar regiões cerebrais específicas de interesse pode ser impedida em técnicas de dissociação de tecido que não preserva sua distribuição espacial. Tais técnicas também potencialmente distorcer a análise da expressão de gene porque o processo em si pode alterar os padrões de expressão em células individuais. Aqui nós descrevemos um método de microdissection (LCM) de captura de laser para coletar seletivamente regiões específicas do cérebro afetadas por traumatismo crânio-encefálico (TCE) usando um Nissl modificado (violeta de cresilo) mancha o protocolo e a orientação de um atlas de cérebro de rato. LCM fornece acesso a regiões do cérebro em suas posições nativas e a capacidade de usar pontos anatômicos para a identificação de cada região específica. Para este fim, LCM tenha sido usado anteriormente para examinar a expressão de genes específicos de região cerebral no TBI. Este protocolo permite o exame das alterações induzidas pelo TCE em expressão de gene e microRNA em áreas distintas do cérebro dentro do mesmo animal. Os princípios do presente protocolo podem ser alterados e aplicados para uma ampla gama de estudos examinando a expressão genômica em outras doenças e/ou modelos animais.

O esquema apresentado na Figura 1 ilustra o fluxo de trabalho geral de LCM atlas guiado de regiões específicas do cérebro e potenciais aplicações de análise a jusante. Este estudo focado em quatro regiões do cérebro relevantes a fisiopatologia do TCE e ao desenvolvimento de comorbidades: FrA, AcbC, SCN e Hp. Uma limitação presente no LCM de regiões específicas do cérebro é que locais anatômicos são muitas vezes obscurecidas pela falta de limites definidos, como pode ser visto na Figura 2 (A, D, G, J). O uso de um atlas do cérebro de guia de corte e captura de regiões específicas de laser reduz a possibilidade de contaminação da amostra com regiões do cérebro que não seja o alvo. Quando é tomado a seguir Marcos de tecido, tanto durante o corte e após coloração de Nissl, tecnologia de LCM pode fornecer um meio muito consistente de aquisição de populações distintas de células, núcleos ou regiões15. Os objetivos a longo prazo destes estudos são identificar genes e microRNAs que potencialmente pode servir como substituto, não-invasivo biomarcadores de lesão específica da região cerebral. O primeiro passo no pipeline de desenvolvimento biomarcador é a caracterização do transcriptional alterações específicas do tecido após TBI experimental. Estes dados então podem ser correlacionados com mudanças induzida por lesão na circulação biofluids.
Os procedimentos apresentados foram otimizados para reduzir o risco de degradação do RNA para permitir a análise do RNA através de transcrição reversa do RNA total de LCM antes de PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). O RNA total (incluindo pequenas e grandes espécies de RNA) foi isolado usando um método de isolamento baseados em coluna no tecido que foi capturado por laser de regiões do cérebro individual. Para avaliar a quantidade, qualidade e integridade do RNA após procedimentos de isolamento, amostras do RNA brevemente foram desnaturadas a 70 ° C e executar em um analisador de RNA. Medições qualitativas incluem analisar amplitudes pico das bandas de rRNA 18s e 28s (Figura 3), que pode ser representante da degradação global e usando o "número integridade do RNA" (RIN). Se usando técnicas cuidadosos livre de RNase, RNA isoladas de amostras de LCM normalmente resulta em RINs que variam de 6-8. Um RIN inferior pode implicar a má qualidade do RNA e potencialmente pode diminuir a precisão de análise de expressão de gene e microRNA. Por outro lado, uma maior RIN pode melhorar a confiança na validade dos resultados gerados a partir de análise de RNA.
RT-qPCR foi realizada utilizando conjuntos de primer/sonda para genes individuais e microRNAs (Figura 4). Aproximadamente 1 ng do RNA total foi reverso-transcritos em cDNA e pre-amplificado antes qPCR foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. Genes relacionados com lesões avaliados neste estudo incluem BCL2 associado X, regulador da apoptose (Bax), B-Cell CLL/Lymphoma 2 (Bcl-2), Caspase 3, Apoptosis-Related Cysteine Peptidase (Casp3) , Cérebro derivada Neurotrophic Factor (Bdnf) e o acampamento elemento responsivo proteína 1 (Creb). MiR-15b foi selecionado porque ele foi mostrado para ser modificadas após a TBI experimental nos neurônios morrendo individuais. Também experimentalmente validou e bioinformatically previu alvos de gene com funções pro-sobrevivência (dados não publicados). Dobra-mudança normalizado rácios foram calculados pelo método de ΔΔCt, comparando os níveis de expressão de gene e microRNA no TBI animais e controles de ingênuo, com normalização de um gene endógeno (Gapdh) ou pequeno RNA (U6), respectivamente. Uma mudança dobra-acima de 1 indica uma upregulation global em que o gene ou microRNA, e inversamente, uma prega mudança menor do que 1 indica uma downregulation. Análise estatística mostrou alterações significativas na expressão gênica entre controle TBI e ingênuo (p ≤ 0,05) que foram a região do cérebro dependente. Nenhuma mudança significativa na expressão de miR-15b foram detectada entre controle TBI e ingênua, mas havia uma tendência para uma maior e menor expressão de forma dependente de região de cérebro. Estes dados sugerem que a otimização adicional é necessária para avaliar as mudanças na expressão de microRNA. Também é possível que o tamanho da amostra foi muito pequeno para ganhar significância estatística, em parte devido à variabilidade inerente na expressão. Futuros estudos incluem animais de operação para garantir esse gene e microRNA expressão alterações são atribuídas a TBI e não devido a preparação cirúrgica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig1.jpg"> 
Figura 1. Fluxo de trabalho de LCM Atlas guiadas para jusante análise genômica. (A-F) Procedimentos de preparação de animais para análise de qPCR a jusante: (A) adulto, do sexo masculinos Sprague Dawley ratos (~ 6 semanas de idade e pesando 300 g) são anestesiados, submetidos a percussão fluido TBI e humanamente sacrificados 24 horas após a lesão. (B) Serial seções (30 µm) de cérebros frescos congelados são com base nas coordenadas de regiões específicas do cérebro (FrA, AcbC, Hp, SCN) de Paxinos e de Watson atlas do cérebro de rato. (C) as seções são fixos, manchadas de Nissl (1% cresilo violeta), desidratado e secada ao ar. (D). LCM realizada na identificado regiões do cérebro com um sistema de LCM. (E) LCM Macro Caps transferido para um tubo de 0,5 mL RNase-livre com 100 μL de tampão de lise celular e armazenado a-80 ° c até o isolamento de RNA para análise genômica a jusante. RNA pode então ser reverso-transcrito para análise de RT-qPCR gene ou microRNA examinar a expressão diferencial de delimitar molecular depois TBI e/ou entre regiões do cérebro de interesse (F). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig2.jpg"> 
Figura 2. LCM de TCE afetadas regiões do cérebro. Imagens representativas de seções do tecido coletadas do lado ipsilateral do local da lesão com IR e UV a laser funções no sistema LCM (A-eu). Tecido foi seccionado em um criostato (30 µm) e coletado em lâminas de membrana de caneta. Seções foram então fixo, manchadas de Nissl com cresilo violeta (1%) e desidratado para identificar regiões cerebrais específicas com base em pontos anatômicos referenciados no Paxinos e de Watson Atlas de cérebro o rato. (A-C) Uma área do córtex de associação frontal (FrA) (D-F) componentes das camadas piramidais CA1, CA2 e CA3 do hipocampo (Hp) localizado ao lado de chifres completamente formados da camada do grânulo do giro do pectínea (GrDG). (G-eu) Uma área do núcleo accumbens coRe (AcbC) proximal e rostral comissura anterior (aca). (J-K) Núcleo supraquiasmático (SCN) rostral da quiasma supra-óptico (och). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig3.jpg"> 
Figura 3. Scans de representante da qualidade do RNA. Representante electropherograms e imagens de gel de associado do RNA derivado de LCM coletaram tecido (A-D). Electropherograms e gel de associado imagens mostram RNA intacto, com base na aparência dos picos de rRNA 18s e 28s e gel de bandas. Este RNA é adequado para todas as aplicações a jusante, incluindo genômica e proteômica análises. Córtex de associação do Frontal (A) (FrA) do RNA. RIN 6.1. (B) hipocampo (Hp) do RNA. 4.4 DE RIN. (C) do núcleo accumbens núcleo RNA (AcbC). 7.3 DE RIN. (D) supraquiasmático RNA de núcleo (SCN). RIN 7,6. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig4.jpg"> 
Figura 4. Análise a jusante do Gene de região específica do cérebro e MicroRNA expressão através de RT-qPCR. RT-qPCR individual para os genes de interesse (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb) e microRNA de interesse (miR-15b) foi realizada em regiões do cérebro do laser capturado após TBI (Hp e AcbC n = 5, FrA n = 4) e em comparação com animais ingênuo ileso (n = 4). Análise de genes relacionados à patogênese TBI foi realizada para Hp, AcbC, FCx. dados é apresentado como rácios de mudança dobra normalizado em comparação com regiões do cérebro ingênuo controle (teste t não pareado com Welch correção ± SEM; * p ≤ 0,05) (A). Expressão diferencial de miR-15b em regiões diferentes do cérebro é apresentado como dobra normalizado alterações em relação ao controle de ingênuo (± SEM) (B). Dados do SCN (n = 2) não incluído. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Nós descrevemos o uso do laser microdissection de captura para obter amostras de populações de células distintas de regiões diferentes do cérebro para análise genética e microRNA. Esta técnica permite o estudo dos efeitos diferenciais de traumatismo crânio-encefálico em regiões específicas do cérebro de ratos.

Estereotáxica guiada por Atlas Laser Microdissection de captura de regiões do cérebro afetadas por lesão traumática

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

O objetivo geral deste protocolo de microdissecção a laser é coletar células de regiões cerebrais específicas afetadas por lesão cerebral traumática para análise molecular. Eu sou a Doutora Helen Hellmich. Meu assistente de pós-graduação, Harris Weisz, que é aluno do programa de Fisiopatologia Humana e Medicina Translacional aqui na Universidade do Texas, no campus médico, vai demonstrar como utilizamos métodos de microdissecção a laser em nossos estudos sobre lesão cerebral.Esse método pode ajudar a elucidar os mecanismos e consequências das alterações induzidas por TCE em regiões cerebrais discretas, como o córtex frontal, que controla funções executivas, e o hipocampo, que é importante para processos dependentes de memória. A principal vantagem dessa técnica é que podemos estudar o efeito de um processo patológico em múltiplas regiões cerebrais discretas ou em tipos celulares individuais a partir do mesmo cérebro.Antes de qualquer procedimento de LCM que inclua análise transcricional, limpe todas as superfícies com detergente eliminador de RNase para reduzir o risco de contaminação e degradação do RNA. Retire o tecido cerebral do armazenamento e coloque-o em um criostato resfriado a menos 20 graus Celsius.Deixe o cérebro equilibrar à temperatura da câmara do criostato por aproximadamente dez minutos. Coloque o cérebro, com a face ventral voltada para cima, sobre uma folha de gaze posicionada sobre a platina do criostato. Com uma lâmina de barbear limpa para RNA, corte a porção posterior logo cranial ao cerebelo e a porção logo anterior ao quiasma óptico.Coloque uma pequena quantidade de meio de temperatura de corte ideal em dois moldes criogênicos separados. Coloque o cérebro contendo o córtex frontal de associação e o núcleo do núcleo accumbens em um dos moldes criogênicos com a face interna voltada para baixo. Adicione meio OCT suficiente para cobrir o tecido.Repita este passo com o fragmento de tecido cerebral contendo o hipocampo e o núcleo supraquiasmático. Deixe o meio OCT congelar completamente por cerca de 20 minutos no criostato. Uma vez que o tecido e o meio OCT estejam completamente congelados, pressione uma pequena quantidade de OTC sobre um suporte de montagem.Pressione um molde criogênico congelado contra a cabeça de montagem e deixe a OCT congelar completamente, de modo que o molde contendo o tecido fique firmemente preso à cabeça. Fixe o suporte da cabeça ao conjunto de corte e aperte o parafuso. Ajuste o ângulo de corte em relação à lâmina do criostato usando as alavancas de ajuste para garantir que os cortes sejam realizados de forma uniforme.Defina a espessura da seção como 30 mícrons. Ao seccionar o bloco de tecido contendo o hipocampo e a SEN, seccione até que o quiasma óptico esteja achatado em bregma 0,48 milímetros, quando o terceiro ventrículo se tornar aparente. Em seguida, colete as seções para a SEM a partir desse ponto, colocando suavemente lâminas de membrana de naftalato de polietileno à temperatura ambiente sobre o tecido seccionado.Verifique visualmente a aderência ao lâmina, confirmando que o tecido e o OTC estão completamente derretidos sobre o lâmina. Armazene todas as lâminas com seções de tecido no criostato até a coloração. Interrompa a coleta de seções no bregma 0,72 milímetros, quando iniciar a decussação supraóptica.Para a coleta do hipocampo, seccione até que os cornos da camada granular do giro denteado sejam visíveis em bregma 3,00 milímetros. Colete seções até que os subcampos CA do hipocampo estejam fundidos nas seções coronais em bregma 4,78 milímetros. Isso permite a coleta completa do hipocampo sob o local da craniotomia e da lesão.Antes da coloração, lave toda a vidraria e a área de coloração em uma capela química com detergente eliminador de RNase. Retire a bandeja de lâminas do criostato e coloque na capela. Deixe as lâminas aquecerem por 30 segundos.Colorir os cortes com violeta cresil e clarificar com solução salina. Deixar a bandeja com lâminas coradas secar ao ar por não mais de dez minutos à temperatura ambiente na câmara de fluxo. Após a secagem, prosseguir imediatamente para a MLC.Antes de iniciar qualquer procedimento de LCM para análise de RNA, limpe a área de coleta e a região ao redor do equipamento com detergente eliminador de RNAses e etanol a 100%. Ligue o interruptor de energia da unidade geradora de laser infravermelho antes de ligar a base do microscópio e aguarde a inicialização do sistema antes de iniciar o software a partir da área de trabalho. Uma vez que o software seja carregado e conclua suas etapas de inicialização, abra o painel de configuração do software e pressione o botão de apresentação da platina.A plataforma modular se moverá para a posição onde as tampas macro para microdiseção a laser e as lâminas podem ser carregadas e descarregadas. Coloque até três lâminas de membrana com caneta na portadora, com a borda fosca voltada para a direita. Selecione a área de manipulação da tampa e da lâmina ao lado da lâmina correspondente e clique na caixa de seleção MEM para informar ao software que as lâminas de vidro com membrana foram carregadas.Em seguida, clique no slide desejado para ser capturado primeiro. Para capturar uma imagem em mosaico para localização e orientação do tecido para a colocação das tampas, selecione imagem na barra de ferramentas e escolha adquirir visão geral. Posicione o cursor sobre a área na imagem em mosaico, clique com o botão direito e selecione colocar tampa no centro da região.O software colocará automaticamente uma tampa sobre a posição selecionada. Após localizar os lasers infravermelho e ultravioleta, escolha a opção de desenho livre no painel de ferramentas de seleção. Usando uma caneta stylus na tela sensível ao toque, desenhe ao redor do perímetro da região de interesse, certificando-se de manter o contato contínuo entre a tela sensível ao toque e a ponta da caneta stylus.Certifique-se de conectar os pontos inicial e final. Para a coleta do hipocampo, capture com microdissecção a laser os subcampos hipocampais CA1, CA2 e CA3 começando no bregma 3,00 milímetros e utilizando a camada granular completamente formada do giro denteado como marco físico de identificação morfológica. Após a coleta, mova as cápsulas macro do LCM para a posição de controle de qualidade e inspecione a aderência completa do tecido verificando visualmente se o tecido cortado por UV está preso à membrana.É imperativo que o corte do laser UV envolva completamente todo o tecido. O não cumprimento resultará em aderência incompleta do tecido à tampa do LCM. Em seguida, coloque rapidamente cada tampa em um tubo de reação de parede fina de 0,5 mililitro livre de RNAsa contendo 100 microlitros de tampão de lise celular.Vortexe brevemente as amostras para garantir a lise completa e armazene a menos 80 graus Celsius até o momento de realizar a análise genômica subsequente. A seguir, são apresentadas imagens representativas de seções de tecido coletadas do lado epilateral do local da lesão, utilizando as funções de laser infravermelho e ultravioleta no sistema de microdissecção a laser (LCM). Esta é uma região do córtex associativo frontal.Esta imagem mostra a mesma região após a coleta. E este é o tecido sobre o capuz após a coleta. Esta imagem mostra os componentes das camadas paramatiais CA1, CA2 e CA3 do hipocampo localizadas ao lado dos cornos totalmente formados da camada granular do giro denteado.As regiões CA2 e CA3 foram coletadas e essas populações celulares são vistas na tampa. Aqui, uma área do núcleo accumbens localizada proximal e adrostral à comissura anterior foi direcionada e reproduzida fielmente na tampa. Por fim, o núcleo supraquiasmático rostral ao quiasma supraóptico foi isolado por microdissecção a laser após a lesão cerebral traumática.Uma vez dominada, esta técnica pode ser usada para processar um cérebro em aproximadamente oito horas. Isso inclui o processamento do tecido, coloração e LCM. Após este procedimento, outros métodos, como análise epigenética, podem ser realizados para responder perguntas sobre padrões de metilação ou expressão de microrna.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a MLC em múltiplas regiões cerebrais no mesmo cérebro.

stereotactic-atlas-guided-laser-capture-microdissection-brain-regions

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Furmanski, O., et al. Modelo de Impacto Cortical Controlado de Lesão Cerebral de Camundongo com Transplante Terapêutico de Células Neurais Derivadas de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos. J. Vis. Exp. (2019)Neste vídeo, células neurais derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos são injetadas estereotaxicamente na borda da substância cinzenta e da substância branca do córtex profundo em um modelo de camundongo de lesão cerebral traumática. As células...

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