Name: Medição In Vivo alterações em neurotransmissores extracelulares durante naturalmente recompensando comportamentos em Hamsters sírios femininos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprenda a medir liberação de dopamina e glutamato em hamsters fêmeas durante comportamentos de acasalamento usando amperometria de potencial fixo. Esta técnica oferece alta resolução temporal para estudos em neurociência comportamental.

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Os autores gostaria de agradecer a graduação Daniel Korus por sua ajuda a executar o código Matlab e graduação Alex Boettcher por sua assistência na execução dos experimentos comportamentais. Este projeto é apoiado pela NSF IOS 1256799 de R.L.M e pelo Instituto Nacional sobre abuso de drogas do institutos nacionais da saúde sob prêmio número T32DA007234.

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Os autores não têm nada para divulgar.

Embora relativamente simples, alguns problemas podem surgir quando empregando esta técnica. Em primeiro lugar, o posicionamento estereotáxica das sondas deve ser preciso: ao contrário do microdialysis que as amostras de um raio mais amplo do meio extracelular em torno da sonda, esta técnica só permite a medição de um neurotransmissor que entra em contato direto com a sonda. Em segundo lugar, no caso da gravação de fibra de carbono, devido a pequena largura da fibra, pode ocorrer a ruptura, e a sonda deve ser introduzida ...

A capacidade de medir a liberação de neurotransmissores em animais comportamento acordados permite que os pesquisadores de vincular comportamentos específicos com padrões espaciais e temporais da neurotransmissão-uma poderosa ferramenta para investigar os mecanismos e circuitos subjacentes a ambos naturais e comportamentos operante em tempo real. Historicamente, o microdialysis tem sido empregado para medir substâncias eletricamente reativas e não reactivas no meio extracelular do cérebro1. Esta técnica usa um fluxo contínuo de uma solução aquosa de composição iônica semelhante ao fluido extracelular, através de uma sonda de microdialysis composta de uma haste pequena com uma dica de uma membrana de fibra oca semipermeable2. Após a inserção da sonda, neurotransmissores ou outros analitos de interesse podem atravessar a membrana semipermeável por difusão passiva, antes de ser coletados em intervalos para posterior análise por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), um técnica de química analítica, comumente utilizada para separar, identificar e quantificar os componentes em uma mistura heterogênea de3.
Embora microdialysis é uma técnica sensível que pode ser usada para medir praticamente qualquer substância de interesse, a resolução temporal é baixa, com taxas de amostragem máxima da ordem de dezenas de minutos1,2minutos. A invenção de varredura rápida voltametria cíclica (FSCV), uma técnica que se baseia no potencial redox de espécies eletroativos, pode elucidar perto instantâneas concentrações do analito de interesse no fluido extracelular. Em breve (ver Robinson et al 4 para uma extensa revisão), um eletrodo é aplicado para levantar e abaixar a tensão de forma de onda triangular em um rápido tempo de escala4. Quando a tensão está no intervalo correto, o composto de interesse repetidamente é oxidado e reduzido. Esta oxidação e redução resulta em um movimento de elétrons que cria uma pequena corrente alternada. Varredura de taxas terá lugar na escala de subsegundos com oxidação e redução de compostos ocorrem em microssegundos. Subtraindo-se o plano de fundo atual criado pela sonda de corrente resultante, pode-se gerar uma tensão vs atual trama original para cada composto. Desde que a escala de tempo das oscilações da tensão é conhecida, esses dados podem ser usados para calcular uma parcela da corrente em função do tempo. Assim, a concentração relativa do composto pode ser determinada, enquanto o número de elétrons transferidos em cada oxidação e reação de redução é conhecida4.
Esta especificidade química e alta resolução temporal fazem FSCV uma técnica poderosa para a detecção de alteração química concentrações na vivo. No entanto, apesar dessas vantagens múltiplas, esta técnica requer vastos conhecimentos técnicos e equipamentos caros e instalação. Além disso, nonelectroactive neurotransmissores (e.g., glutamato) não podem ser medidos usando esta técnica. Felizmente, os avanços tecnológicos no campo da eletroquímica5, bem como a comercialização destas invenções, introduziu uma abordagem relativamente simples para medir os neurotransmissores não-eletroativos em animais comportamento acordados sem comprometer a técnica de precisão, um temporal conhecida como tecnologia biosensor enzimática. Esta técnica usa conversão enzimática do neurotransmissor nonelectroactive de interesse em dois substratos, um dos quais é eletroativos de peróxido de hidrogênio que é detectado como uma oxidação amperométrico atual gerada por um potencial aplicado5 . Biosensor comercialmente disponíveis sondas seletivamente (ver Figura 1) medem analitos de interesse, competitivamente, reduzindo a contribuição de interferentes endógenos. No caso de glutamato, a contribuição do ácido ascórbico interferent comuns (AA) é reduzida competitivamente à corrente medida pelo co localizando oxidase de AA na superfície do sensor, conversão de AA para não-eletroativos enzimática ativa dihydroascorbate e água. Além disso, uma camada de polímero Nafion carregada negativamente presente sob a camada de enzima exclui compostos aniônicos endógenos.
Esta mesma configuração experimental biosensor pode medir eletroativos neurotransmissores como FSCV, mas em vez disso, ele emprega um potencial fixo gravação6. Em contraste com a tensão oscilante aplicada em FSCV, na gravação de um potencial fixo a tensão é mantida no redox potencial para o analito de interesse. Embora seja menos quimicamente seletiva do que FSCV como vários neurotransmissores podem ter o mesmo potencial, de redox em áreas do cérebro que esmagadoramente inclinação para um neurotransmissor, a natureza da curva-chave desta abordagem supera a falta de química especificidade.
A capacidade de medir tanto eletroativos e nonelectroactive lançamento do neurotransmissor em tempo quase real e vinculá-lo a eventos comportamentais específicos fornece uma oportunidade para examinar a liberação de neurotransmissor convergentes. Este manuscrito detalha o uso deste sistema para interrogar a neurotransmissão tanto dopamina e glutamato em resposta a recompensa natural em hamsters comportamento acordados. O objetivo deste trabalho é a detalhar o processo de medição esta liberação de neurotransmissor durante o comportamento sexual em hamsters femininos, com o objetivo de demonstrar a sua viabilidade para examinar outros comportamentos e paradigmas experimentais.
Os hamsters são um modelo ideal para uso em gravações de eletroquímicas Historicamente, os modelos de ratos e camundongos têm sido empregados no estudo do comportamento sexual. Estas espécies de roedores se envolver em uma sequência de imperatividade dinâmica, envolvendo inúmeros comportamentos de solicitação feminino que incluem lupulagem, arremessam e orelha mexer para atrair o macho de perseguir e, finalmente, montar o feminino7. A montagem pelo macho (com ou sem penetração vaginal) dura apenas alguns segundos, durante o qual a fêmea se engaja na sua postura de comportamento sexual (denominada lordose) também só por alguns segundos antes de retomar comportamentos ativo solicitação. Este padrão de comportamento, composto por altos níveis de atividade intercalados com breves períodos de imobilidade, é problemático para medir a neurotransmissão em comportamento de animais. Primeiro, pode haver artefatos de movimento em amperométrico gravações que estão relacionadas com a atividade neural. Em segundo lugar, a locomoção é associada com a liberação de neurotransmissores particulares em certas regiões do cérebro. Por exemplo, liberação de dopamina tem sido acoplada a atividade locomotora do striatum dorsal e ventral8,9, uma descoberta que formou a base para medições microdialysis de dopamina após psicoestimulantes Administração10. Porque os comportamentos de solicitação fêmea-típico em mosroedores de t envolvem altos níveis de atividade locomotora e são representados pela maior parte de um teste de comportamento sexual de 10 minutos, isso dificulta a alterações na neurotransmissão, atribuímos aos componentes explícitos de comportamento sexual que coletivamente durar apenas minutos.
Para analisar o perfil neuroquímico do comportamento sexual feminino, este laboratório procurou uma espécie em que há atividade locomotora mínima que acompanha o comportamento sexual. A sequência copulador no hamster sírio (Mesocricetus auratus) é ideal para gravações neuroquímicas devido à falta de comportamentos de solicitação normalmente visto em ratos e camundongos11. Como consequência, os hamsters fêmeas entrará e manter a postura de lordose para mais de 9 minutos a 10 minutos de sessão12de teste. Com a falta de estranhos movimentos de locomoção pelo sexo feminino, na vivo gravações eletroquímicas que podem ser associadas a componentes de interações sexuais com o macho podem ser obtidas.
Copuladores lutas em hamsters Após a introdução de um animal de estímulo masculino na câmara de teste, o macho irá inicialmente envolver anogenitais investigação (AI) da fêmea antes de montá-la (Figura 2). Em ordem para montar o macho, a fêmea deve assumir uma postura sexual receptiva, conhecida como lordose, no qual ela arcos de volta e desvia a cauda para que o macho de montagem pode ganhar acesso do pênis para a vagina dela. O macho vai montar a fêmea, abraçando seu traseiro com as duas patas (Figura 2B) e começar a empurrar na tentativa de ganhar penetração peniana (Figura 2C). O macho irá montar a fêmea (sem inserção), bem como intromit um número de vezes antes de finalmente conseguir a ejaculação. Esta sequência de montagens e intromissões levando a ejaculação é denominada um tal"imperatividade". Os machos terá várias lutas copulativo dentro de uma única sessão.

<table><tbody><tr><td>Nembutal</td><td>Carvalho Farmacêutico Inc.</td><td>76478-501-50 Injeção de</td><td>pentobarbital sódico, USP. Este laboratório usa 8,5 mg/100 g de peso corporal, injetados por via intrapericotinal.&nbsp;</td></tr><tr><td>Analgésico Loxicom&nbsp;</td><td>Laboratórios Norbrook</td><td>6451603670</td><td>antiinflamatório anti-inflamatório e analgésico anti-inflamatório (AINE) utilizado para o controle da dor pós-operatória. Genérico: meloxicam.&nbsp;</td></tr><tr><td>Antibiótico Enroflox&nbsp;</td><td>Laboratórios Norbrook</td><td>5552915411</td><td>Antibiótico fluoroquinolona para prevenção de infecções pós-operatórias. Genérico: Enrofloxacina.</td></tr><tr><td>Beutanásia-D&nbsp;</td><td>Merck Animal Health</td><td>00061047305</td><td>Pentobarbital Sódico, Fenitoína Agente de eutanásia sódica.</td></tr><tr><td>Parafusos ósseos</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>8111-16</td><td>Parafuso de osso de 1/8" (Pacote de 16) usado para fixar a calota craniana ao crânio.&nbsp;</td></tr><tr><td>Acrílico dental (Bosworth Duz-All)</td><td>Bosworth&nbsp;</td><td>166261C&nbsp;</td><td>O acrílico dental autopolimerizável é usado na construção de uma calota craniana para fixar a cânula e a montagem da cabeça no crânio.</td></tr><tr><td>Configuração do biossensor de hardware&nbsp;</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>8400-K2</td><td>A Pinnacle oferece kits de hardware completos para novos usuários de nosso sistema de biossensor cativo para ratos. Os kits incluem um comutador, pré-amplificador e sistema de condicionamento e aquisição</td></tr><tr><td>de dados Pacote básico de computador de vídeo</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>9000-K1</td><td>O pacote básico do computador inclui um computador pré-configurado com amplo armazenamento em disco rígido, um monitor de alta definição, um teclado e mouse, uma fonte de alimentação ininterrupta e todos os cabos necessários.</td></tr><tr><td>Vídeo EQ700 EverFocus pacote de câmera</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>&nbsp; 9000-K10&nbsp;</td><td>A câmera de caixa com capacidade de visão noturna EQ700 com fonte IR independente foi obtida como parte do pacote de computador de vídeo Pinnacle. Opções de câmera dome (9000-K9) e câmera HD (9000-K11) também estão disponíveis.</td></tr><tr><td>Software de aquisição Sirenia</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>Gratuito - disponível para download em pinnaclet.com</td><td>Sirenia&nbsp; A aquisição fornece uma plataforma única para registrar dados de qualquer sistema de hardware da Pinnacle. O software apresenta sincronização de todos os fluxos de dados, configurações configuráveis pelo usuário, consolidação de dados e várias opções de exportação. Além disso, o software inclui módulos básicos de revisão e análise para gravações de biossensores. Sirenia&nbsp; Oferece software LL-in-One gratuito que é ideal para aquisição e revisão de dados.</td></tr><tr><td>Rato amarrado&nbsp; in vitro&nbsp; kit de calibração</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>7000-K2-T-BAS&nbsp;</td><td>Para relacionar as mudanças atuais medidas por um biossensor com as mudanças reais na concentração do analito, é necessário calibrar o biossensor antes da implantação no animal. O processo também confirma a integridade e seletividade dos sensores. O kit de calibração inclui um copo revestido de 20 mL (#7058), barra de agitação magnética de 1/2" por 1/8" (#7059), grampo de ângulo reto (#7056), grampo de ajuste único de 2 pinos (#7055), pré-amplificador de calibração de 4 canais (#7053) e suporte de calibração (#7051).&nbsp;</td></tr><tr><td>Prato de mexer&nbsp;</td><td>Agitador digital Corning</td><td>6795-410D</td><td>Corning, 5" x 7", 120 VAC usado para girar o agitador magnético em béquer revestido durante a calibração in vitro de biossensores de glutamato.</td></tr><tr><td>Banho-maria capaz de circulação em circuito fechado</td><td>PolyScience</td><td>8006A11B</td><td>PolyScience 8006A11B 6L Banho de circulação aquecido digital padrão, banho de água de 120VAC foi usado com tubulação de plástico para aquecer o béquer encamisado à temperatura fisiológica.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sensor de fibra de carbono com cânulas de rato BASi</td><td>Pinnacle Technology, Inc.</td><td>7002-CFS</td><td>Eletrodo de fibra de carbono usado para registrar a neurotransmissão de dopamina.</td></tr><tr><td>Eléctrodo de referência Ag/AgCl</td><td>Pinnacle Technology, Inc.</td><td>7065</td><td>Necessário para gravações de fibra de carbono.</td></tr><tr><td>Biossensores de glutamato</td><td>Pinnacle Technology, Inc.</td><td>7001&nbsp;</td><td>Sonda biossensor enzimática usada para registrar a neurotransmissão glutamatérgica.</td></tr><tr><td>Cânulas guia BASi</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>7030&nbsp;</td><td>Cânulas guia implantadas na região cerebral de interesse para guiar a sonda.</td></tr><tr><td>Capacete de plástico para cânulas BASi para ratos&nbsp;</td><td>Pinnacle Technologies, Inc.</td><td>7011&nbsp;</td><td>O suporte de cabeça estabiliza a sonda e se conecta ao potenciostato.</td></tr></tbody></table>

medição in vivo alterações em neurotransmissores extracelulares durante naturalmente recompensando comportamentos em hamsters sírios femininos

Measuring In Vivo Changes in Extracellular Neurotransmitters During Naturally Rewarding Behaviors in Female Syrian Hamsters

A capacidade de medir a liberação de neurotransmissores em uma escala de tempo rápida permite que os padrões de neurotransmissão para ser ligado a comportamentos específicos ou manipulações; uma poderosa ferramenta na elucidação de mecanismos e circuitos subjacentes. Enquanto a técnica do microdialysis tem sido usada há décadas para medir praticamente qualquer analito de interesse no cérebro, esta técnica é limitada em resolução temporal. Alternativamente, voltametria cíclica de varredura rápida é temporalmente precisos e extremamente sensível; no entanto, porque esse método tecnicamente difícil depende do electroactivity do analito de interesse, é eliminada a possibilidade de detectar substâncias nonelectroactive (por exemplo, o glutamato neurotransmissor). Este documento detalha o uso de um sistema turn-key que combina potencial fixo amperometry e biosensing enzimático para medir os neurotransmissores tanto eletroativos e nonelectroactive com precisão temporal. O emparelhamento destas duas poderosas técnicas permite a medição de tônico e neurotransmissão fásicos com relativa facilidade e permite a gravação de vários neurotransmissores simultaneamente. O objetivo deste manuscrito é demonstrar o processo de medição de dopamina e glutamato neurotransmissão no vivo usando um comportamento naturalmente gratificante (ou seja, comportamento sexual) em hamsters femininos, com o objetivo de exibir a viabilidade técnica deste teste para examinar outros comportamentos e paradigmas experimentais.

Usando a eletroquímica e comportamental de codificação metodologia descrita acima, este laboratório começou a caracterizar ambos tônico e fásicas flutuações em dopamina e glutamato durante gravações no vivo de comportamento sexual. Devido a maneira temporalmente-precisa desta metodologia, nós pode caracterizar com mais precisão neurotransmissão durante o comportamento sexual; bem como atribuem alterações específicas nos padrões de lançamento de correspondentes alterações tônico d...

Este documento detalha a utilização do potencial fixo amperométrico gravações usando eletrodos de fibra de carbono e tecnologia enzimática biosensor para medir a liberação de dopamina e glutamato com alta resolução temporal durante o comportamento natural de gratificante na hamster fêmea.

Medição In Vivo alterações em neurotransmissores extracelulares durante naturalmente recompensando comportamentos em Hamsters sírios femininos

The ability to measure neurotransmitter release on a rapid time scale allows patterns of neurotransmission to be linked to specific behaviors or ...

O objetivo geral deste procedimento experimental é medir a liberação de neurotransmissores em animais acordados e em atividade. Embora este vídeo demonstre a aplicação em neurociência comportamental, com a capacidade de caracterizar a liberação específica de neurotransmissores em relação a eventos comportamentais específicos, esta técnica pode ser empregada em diversas outras subáreas da neurociência, como em estudos com injeção de fármacos. A principal vantagem desta técnica é sua natureza imediata para medir a liberação quase em tempo real de neurotransmissores in vivo.Comece injetando 500 microgramas de progesterona em 0,1 mililitros de óleo de algodão, por via subcutânea, quatro horas antes da introdução do macho para induzir a receptividade sexual. Certifique-se de testar cada animal no início da fase escura do seu ciclo diário, pois os comportamentos sociais de roedores estão sujeitos a alterações sob condições de teste com luz branca e luz vermelha. Prepare as soluções de calibração no dia do teste, recém-feitas, em tubos de centrífuga de vidro de 20 mililitros.Para a solução do analito, dissolva 7,4 miligramas de ácido L-glutâmico em 10 mililitros de água ultrapura inverten

measuring-vivo-changes-extracellular-neurotransmitters-during

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra o implante de eletrodos e cânulas em um rato anestesiado para medir a liberação de dopamina no núcleo accumbens usando um potenciostato e a infusão de drogas para modular a atividade dopaminérgica na área tegmental ventral.

Monitorando a liberação de dopamina em um modelo de rato com manipulação do receptor de neurônio dopaminérgico VTA

Este protocolo descreve duas manipulações ambientais diferentes e um protocolo de infusão cerebral concomitante para estudar as alterações cerebrais induzidas pelo ambiente subjacentes ao comportamento adaptativo e ao reparo cerebral em camundongos adultos.

Modulações Ambientais do número de Midbrain dopamina Neurônios no Adulto Mice

Este protocolo descreve a placa de furo modificada, que é uma configuração de teste comportamental que compreende as características de um campo aberto e uma placa de furo tradicional. Essa configuração permite a análise diferencial do comportamento incondicionado de pequenos mamíferos de laboratório, bem como a análise das habilidades cognitivas.

The Hole Board Modificado - Medir Comportamento, Cognição e Interação Social em camundongos e ratos

Este artigo descreve um novo protocolo para a medição quantitativa da motivação social em camundongos usando condicionamento operante para uma recompensa social. O protocolo é útil para a medição da motivação social em modelos de autismo e outros distúrbios do comportamento social em camundongos.

Quantificar motivação social em ratos usando Condicionamento Operante

Nós descrevemos um protocolo para induzir gratificante e nonrewarding experiências em moscas da fruta (Drosophila melanogaster), utilizando o consumo de etanol voluntária como uma medida de mudanças nos estados de recompensa.

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Identificação de receptor de dopamina D1-alfa no núcleo accumbens é fundamental para esclarecer a disfunção do receptor D1 durante uma doença do sistema nervoso central. Realizamos um novela RNA em situ da hibridação do ensaio para visualizar moléculas de RNA única em uma área específica do cérebro.

Identificação de Receptor de dopamina D1-alfa dentro roedores núcleo Accumbens por uma inovador RNA In Situ tecnologia da deteção

Este protocolo mede aprendizagem espacial e memória usando o labirinto de Barnes. Um novo paradigma de donzela em apuros é usado para avaliar a atividade locomotora e comportamento pró-social em camundongos.

Analisando a aprendizagem espacial e comportamento pró-social nos ratos usando o labirinto de Barnes e paradigmas de donzela em apuros

O protocolo aqui apresentado fornece informações sobre o eletroencefalograma (EEG) simultâneo e avaliação comportamental em tempo real. Discutimos todas as etapas envolvidas neste protocolo como uma solução atraente para pesquisadores em muitos campos da neurociência, particularmente nas áreas de aprendizagem e memória.

Monitoramento Simultâneo da Eletrofisiologia Wireless e Teste Comportamental de Memória como Ferramenta para Estudo da Neurogênese do Hipocampo

Um modelo de compulsão alimentar foi estabelecido em camundongos usando acesso intermitente a M&amp;M's (um alimento altamente palatável feito de gordura e açúcar). Camundongos com acesso intermitente a esse alimento rico em gordura e açúcar mostraram comportamentos semelhantes ao estresse, aumento da ingestão calórica e preferência por esse alimento em relação à ração padrão em comparação com camundongos com acesso contínuo ou nenhum acesso ao alimento.

Modelo de ingestão periódica intermitente em camundongos

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

Aprenda a medir liberação de dopamina e glutamato em hamsters fêmeas durante comportamentos de acasalamento usando amperometria de potencial fixo. Esta técnica oferece alta resolução temporal para estudos em neurociência comportamental.

Medição In Vivo alterações em neurotransmissores extracelulares durante naturalmente recompensando comportamentos em Hamsters sírios femininos (Vídeo) | JoVE Journal

Medição In Vivo alterações em neurotransmissores extracelulares durante naturalmente recompensando comportamentos em Hamsters sírios femininos

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