Medição In Vivo alterações em neurotransmissores extracelulares durante naturalmente recompensando comportamentos em Hamsters sírios femininos

O objetivo geral deste procedimento experimental é medir a liberação de neurotransmissores em animais acordados que se comportam. Embora este vídeo demonstre aplicação à neurociência comportamental, com a capacidade de caracterizar a liberação de neurotransmissores específicos, em relação a eventos comportamentais específicos, essa técnica pode ser empregada em uma variedade de outras subdisciplinas da neurociência, como a injeção de drogas. A principal vantagem desta técnica é sua natureza pronta para medir a liberação quase em tempo real de neurotransmissores in vivo.

Comece injetando 500 microgramas de progesterona em 0,1 mililitros de óleo de semente de algodão, por via subcutânea, quatro horas antes da introdução do macho para induzir a receptividade sexual. Certifique-se de testar cada animal no início da fase escura de seu ciclo diário, pois os comportamentos sociais dos roedores estão sujeitos a alterações sob condições de teste de luz branca e luz vermelha. Faça as soluções de calibração frescas no dia do teste em tubos de centrífuga de vidro de 20 mililitros.

Para a solução analita, dissolva 7,4 miligramas de ácido L-glutâmico em 10 mililitros de água ultrapura invertendo suavemente o tubo. Em seguida, faça a solução de interferência dissolvendo 176,1 miligramas AA em 10 mililitros de água ultrapura. Configure a calibração colocando um agitador magnético na base de um suporte de anel de laboratório básico.

Coloque um copo revestido de 20 mililitros em cima do agitador magnético e prenda no lugar usando um grampo médio de dois pinos. Conecte o béquer encamisado a um banho-maria circulante para aquecer a solução tampão a 37 graus Celsius. Adicione uma barra de agitação magnética e 20 mililitros de solução salina tamponada com fosfato 100 milimolar, ou PBS, no béquer encamisado.

Em seguida, coloque o suporte de calibração do sensor em cima do béquer revestido e coloque um pré-amplificador de calibração de quatro canais na parte superior, prendendo-o no lugar usando um ângulo reto clamp. Em seguida, conecte o préamplifier a um dispositivo de condicionamento e aquisição de dados para registrar os dados de calibração. Testar a sensibilidade de cada biossensor enzimático ao glutamato antes do registo experimental, colocando a sonda no suporte de calibração, sobre um copo encamisado, submergindo a cavidade de detecção e uma parte do fio de referência de cloreto de prata na solução tampão.

Inicie uma nova gravação na interface do computador utilizando um software de aquisição gratuito para download. Em seguida, conecte cada sensor que está sendo testado a uma porta em um pré-amplificador de calibração de quatro canais. Permita que os sensores atinjam uma linha de base estável.

Comece a adicionar as injeções de analito quando os sensores atingirem uma linha de base estável. Use o orifício no suporte de calibração para introduzir uma ponta de pipeta na solução tampão. Em seguida, use a ferramenta de anotação rápida de teclas no software de gravação para anotar quando uma injeção é feita.

Em seguida, faça 10 injeções micromolares de glutamato pipetando 40 microlitros da solução analita na solução tampão. Aguarde até que o sensor se estabilize entre as adições. Em seguida, adicione três injeções de solução analita antes de adicionar uma única injeção da solução AA interferente.

Forre a câmara de teste com roupas de cama retiradas da gaiola doméstica do animal. Remova o obturador oclusivo da cânula guia e insira o eletrodo de fibra de carbono ou a sonda enzimática através do eixo guia. Conecte o sensor ao sistema de gravação.

Em seguida, estabilize a conexão do sensor aparafusando um pino de fixação no suporte do cabeçote. Em seguida, coloque o animal na câmara de teste. Comece a gravar o vídeo e o sinal amperométrico bloqueado no programa de software.

Permita que o sensor se equilibre no cérebro antes do teste experimental. Em seguida, introduza um estímulo masculino na câmara de teste. Após a primeira monta com inserção peniana pelo estímulo masculino, continue gravando por mais 10 a 30 minutos, dependendo dos objetivos experimentais.

Finalmente, após o teste comportamental, desconecte o sensor fêmea. Remova os dois hamsters da câmara de teste, bem como a cama, para limpar a câmara usando etanol 70%. Comece visualizando e anotando os vídeos, usando software gratuito para download comercial, em câmera lenta para codificar com precisão os comportamentos bloqueados no tempo para o sinal amperométrico.

Anote a lordose inicial no quadro quando a fêmea inicia uma dorsiflexão das costas e desvia a cauda para cima. Anote a lordose final quando a fêmea termina essa postura, o que geralmente ocorre quando a fêmea se reajusta para outro local na câmara de teste. Em seguida, anote Start AI quando a fêmea estiver na postura de lordose e o macho mover o focinho em direção à região anogenital da fêmea, onde pode ocorrer cheirar, lamber ou acariciar sua região perineal.

Anote End AI quando o macho remover o focinho da proximidade com a região anogenital da fêmea. Em seguida, anote Start Mount quando o macho se aproximar e colocar as patas dianteiras na fêmea em uma postura de montaria, independentemente da orientação da tentativa de montaria. Da mesma forma, anote Iniciar Intromissão quando o impulso bem-sucedido ganhar o acesso peniano masculino montado à vagina da mulher.

Quando aplicável, anote Ejaculate, que pode ser notado por um movimento de pisar com a pata traseira do macho. Por fim, anote End Intromission e End Mount simultaneamente no quadro quando o macho tiver removido as duas patas dianteiras e, portanto, não tiver contato com a fêmea. Devido à frequente incapacidade de visualizar sua retirada, codifique simultaneamente esses dois comportamentos para permitir consistência e confiabilidade entre as lutas de acasalamento.

Na guia file, selecione a função Exportar e escolha a guia TSV para salvar as medições de tensão como um arquivo de extensão TSV. Abra cada arquivo com um programa de planilha e salve como XLS/XLSX. Finalmente, adicione manualmente anotações para o início da lordose de pré-acasalamento ao mesmo tempo em que o comportamento de lordose começa, que também inclui um comportamento de montada, e também no início de uma nova luta de acasalamento, se a fêmea permanecer na postura de lordose.

Durante as sessões de acasalamento, a transitoriedade dopaminérgica nos titulares do núcleo surge durante a inserção vaginal, ou intervalo, pelo macho. Um padrão semelhante foi observado em outros animais em relação à liberação de glutamato. Com transitoriedade rápida que corresponde a intervalos individuais no núcleo dorsal accumbens durante uma sessão copulatória.

Uma vez dominada, esta técnica, não incluindo as cirurgias estereotáticas preparatórias, pode ser concluída em um dia. Ao tentar este procedimento, é importante garantir que cada sensor esteja funcionando. Embora este vídeo demonstre uma única gravação de sonda, essa abordagem pode ser estendida para gravação dupla simultânea.

Mas isso adiciona uma camada de complexidade que não é trivial. Este vídeo é demonstrado em condições de luz para facilitar a visibilidade. No entanto, realizamos nossos experimentos comportamentais em condições escuras, e esse parâmetro pode ser alterado dependendo das necessidades experimentais específicas.

Após este procedimento, outros métodos, como a análise histológica subsequente de fatias de cérebro, podem ser realizados para identificar e confirmar o posicionamento exato do sensor. Além disso, análises adicionais de dados, usando os dados comportamentais codificados, podem ser realizadas em relação a quaisquer parâmetros de interesse. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem a liberação de neurotransmissores, incluindo neurotransmissores não eletroativos como o glutamato quase em tempo real em animais acordados que se comportam.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como calibrar sondas glutamatérgicas, implantar sondas, executar um experimento comportamental medindo mudanças na liberação de neurotransmissores para diferentes componentes do comportamento e codificar esses dados para análise subsequente. Não se esqueça de que, ao trabalhar com animais vivos, seja sensível ao seu conforto e bem-estar geral para garantir seus melhores resultados e os dos animais.