Análise do promotor de planta: Identificação e caracterização de raiz nódulo promotor específico no feijão comum

Raízes peludas são usadas para obter raízes transformadas em Phaseolus com uma construção repórter. As raízes transgênicas resultantes são usadas para examinar a expressão do gene repórter. Estudos de expressão de promotores são cruciais para entender os padrões de expressão espaço-temporal dos genes.

Hoje vamos demonstrar as metodologias para indução de raízes pilosas e estudar padrões de expressão de promotores em raízes pilosas transgênicas sob condições simbióticas de nódulos radiculares em Phaseolus. Estrada-Navarrete e colegas estabeleceram anteriormente o sistema radicular piloso induzido por Agrobacterium rhizogenes em Phaseolus. O método atual ajudará a acelerar a duração da indução da raiz peluda e, assim, melhorar a versatilidade do sistema.

Demonstrando os procedimentos estarão meu colega Manoj-Kumar Arthikala e as alunas de graduação Alma Leticia e Brenda Mariana do meu laboratório. Para começar, pesquise a sequência do gene NIN no banco de dados do genoma de Phaseolus vulgaris do Phytozome e selecione o comprimento necessário da sequência a montante do ATG. Projetar os oligonucleotídeos seguindo a análise apropriada da sequência do promotor.

O DNA genômico de Phaseolus recém-preparado servirá como modelo para amplificar a sequência promotora por PCR. Prepare a mistura principal de PCR com Taq polimerase de alta fidelidade e componentes de PCR padrão, juntamente com os oligonucleotídeos previamente projetados. Alicotar a mistura principal em tubos de PCR de 2 mL e realizar a amplificação do fragmento promotor em um termociclador e com um programa adequado.

Separe o produto de PCR eletroforeticamente em um gel de 1,2% de agarose. Visualize o fragmento NIN amplificado em 700 pares de bases sob transiluminação UV. Extirpe, elui e clone o fragmento no vetor de entrada do Gateway vetor pENTR/D-TOPO seguindo as instruções padrão.

Transforme dois microlitros da mistura de reação em células de E.coli competentes a 42 graus Celsius por 50 segundos e coloque a E.coli transformada em LB suplementada com 50 miligramas por litro de canamicina. Cultive as células revestidas a 37 graus Celsius durante a noite. Realize uma reação de PCR para plasmídeos isolados de colônias de E.coli selecionadas aleatoriamente usando oligonucleotídeos M13.

O fragmento em 1024 pares de bases deve indicar clones positivos. Execute a reação LR entre o clone de entrada positiva e o vetor binário de destino. Transforme dois microlitros de mistura de reação em E.coli e selecione as colônias em 100 miligramas por litro de espectinomicina a 37 graus Celsius.

Amplificar os plasmídeos com oligonucleotídeos específicos para NIN. O clone positivo deve amplificar em 700 pares de bases. Seqüenciar e verificar a exatidão do fragmento clone.

Mobilize a construção do promotor NIN em células eletrocompetentes K599 Agrobacterium rhizogenes. E mais uma vez, confirme o clone com oligonucleotídeos específicos do promotor. O enxofre esteriliza as sementes de Phaseolus vulgaris e germina em papéis de filtro úmidos estéreis por dois dias no escuro a 28 graus Celsius.

Espalhe 150 microlitros de células de Agrobacterium rhizogenes com NIN construto e vetor de controle em placas LB com seleção de espectinomicina. Cultive a cultura durante a noite a 28 graus Celsius. Retire as mudas de Phaseolus e raspe as células de Agrobacterium rhizogenes com uma ponta dobrada de 200 microlitros da placa.

E ressuspenda no tubo Eppendorf com um mL de água destilada estéril. Colete células de Agrobacterium rhizogenes em uma seringa de três mL e coloque as mudas de Phaseolus em uma configuração de tubo previamente preparada. Pique levemente os hipocótilos das sementes germinadas com a ponta da agulha, injetando simultaneamente as células de Agrobacterium rhizogenes.

Deve-se tomar cuidado para que a agulha não passe pelo hipocótilo. Mantenha as mudas injetadas em uma câmara de crescimento a 28 graus Celsius com fotoperíodo de 16 horas de luz e oito horas de escuridão. O calo nos hipocótilos feridos deve ser visível em cinco a sete dias.

Após duas semanas, remova a raiz primária cortando o caule dois centímetros abaixo das raízes peludas e transplante-as em vasos contendo vermiculita estéril. Simultaneamente, inocular as plantas com um ml de Rhizobium tropici para induzir a nodulação. Certifique-se de diluir a cultura de rizóbio para 6 a OD 600.

Mantenha as plantas em uma câmara de crescimento a 28 graus Celsius, 16 horas de fotoperíodo claro e oito horas de escuro e irrigue com solução B e D. Para estudar os padrões de expressão espaço-temporal do promotor NIN, a amostragem é feita em diferentes momentos. Retire as plantas sem danificar as raízes e lave as raízes sem manchas de vermiculita.

Selecione aleatoriamente as raízes do NIN e das plantas de controle e prossiga para a coloração histoquímica do GUS incubando as amostras no tampão de ensaio GUS a 37 graus Celsius por 16 horas no escuro. Observe as raízes coradas com GUS em microscópio estéreo e composto. Esta imagem mostra a expressão do promotor NIN induzido por rizóbio nas raízes primárias.

A expressão do promotor NIN também pode ser observada em células ciliadas da raiz infectadas com Rhizobium. Além disso, a expressão de GUS pode ser documentada em diferentes estágios do desenvolvimento do nódulo radicular. Nenhuma expressão de GUS foi observada nas raízes de controle do vetor.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão do design de suas construções promotoras e estudar os padrões de expressão do promotor em raízes pilosas transgênicas de Phaseolus. Este sistema pode ser estendido para estudar os padrões de expressão do promotor sob outras interações simbióticas e patogênicas em Phaseolus e também em outras eudicotiledôneas.