Name: Reconstrução tridimensional da arquitetura Vascular do ovário passiva Mouse clareza-limpo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Aprenda a reconstrução tridimensional da arquitetura vascular ovariana usando o método CLARITY passivo em ovários intactos de camundongo. Esta técnica revela a distribuição capilar em folículos ovarianos.

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Este estudo foi suportado por subvenções do fundo especial chinesa para pós-docs (n º 2014T70392 de YF), a Fundação Nacional de ciências naturais da China (n º 81673766 de YF), o novo fundo de escorva de professor, a Fundação de Zuoxue da Universidade de Fudan e o desenvolvimento Projeto de Shanghai pico medicina integrativa-disciplinas (20150407).

Todos os procedimentos envolvendo assuntos animais seguiram as orientações do Comitê de ética Animal em Xangai Medical College, Universidade de Fudan (número de aprovação 20160225-013).
1. preparação do ovário Mouse transparente
<ol><li>
Preparação das soluções
	<ol>
<li>Preparar a solução de tampão fosfato salino (PBS) (1 M, pH 7,6) com 0,1% Triton X-100 (PBST). Para fazer 1 L de solução estoque de PBS x 10, misture 87 g de NaCl, 3,1 g de NaH2PO4 · 2H2O e 28,7 g de Na2HPO4 ·12H2O. Adicionar dH2O distilada ~ 2 h. ajustar para pH 7,4 e 1 L com 1 N de NaOH e armazenam à temperatura ambiente. Diluir esta solução estoque 10 x por 1/10 usando O dH2e depois fazer 0,1% Triton X-100 em PBS.</li>
		<li>Prepare a solução de hidrogel (pH 7,5) por mixagens 4% (wt/vol) solução de paraformaldeído (PFA), 4% (wt/vol) acrilamida, bisacrylamide 0.05% (wt/vol) e iniciador de VA-044 0,25% (wt/vol) em água bidestilada no gelo.</li>
		<li>Prepare a solução de limpeza (pH 8,5) pela mistura de 200 mM de tampão de borato de sódio contendo 4% (wt/vol) Dodecil sulfato de sódio (SDS) em água bidestilada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de perfusão e ovário Transcardial
	<ol>
<li>Mantenha todas as soluções no gelo durante todos os procedimentos.</li>
		<li>Anestesia tipo selvagem feminino adulto C57BL/6 rato com uma injeção intraperitoneal de solução de pentobarbital (0,35 mg/kg). Uma vez que ele não mostra nenhuma resposta do dedo do pé-pitada, o mouse corretamente é anestesiado.</li>
		<li>Uso de fita adesiva para fixar o mouse com os membros esticada sobre uma placa plana da espuma.</li>
		<li>Expor o coração por uma incisão no processo xifoide, através do tórax, pele e ossos, com uma tesoura.</li>
		<li>Fazer uma incisão no átrio direito do animal e em seguida perfundir o ventrículo esquerdo com 20 mL de PBS gelado 1 x 10 mL/min.</li>
		<li>Perfundir o animal com pelo menos 20 mL de solução de hidrogel em 10 mL/min.</li>
		<li>Incise a pele ao longo do abdômen ao longo da linha de medioventral com uma tesoura, que expõe o enterocoelia inteiro, e remover os intestinos. Recolha os ovários, bem como o útero para manter a integridade da morfologia ovariana.</li>
		<li>Remova os tecidos de gordura ao redor do ovário sob um microscópio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Desgaseificação
	<ol>
<li>Coloque os ovários em 10 mL de solução de hidrogel a 4 ° C para fixação por 3 dias.</li>
		<li>Transferência do ovário em um tubo de 5 mL e encher o tubo com solução de hidrogel. Esticar o parafilm sobre a parte superior do tubo e em seguida, enrole parafilm ao redor do pescoço do tubo. Cuidado: Certifique-se que não há nenhuma bolha entre o parafilm e a solução de hidrogel.</li>
		<li>Coloque o tubo num agitador na incubadora a 37 ° C por um período máximo de 3 h para permitir que o hidrogel polimerizar.</li>
		<li>Remover o ovário do gel usando uma espátula e remova cuidadosamente o excesso de gel ao redor do ovário por lenços de papel. Lave o ovário quatro vezes com PBS 1x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Compensação passiva
	<ol>
<li>Submergi o ovário em 10 mL da solução de limpeza. Agite suavemente a 80 rpm a 37 ° C para iniciar o processo de compensação.</li>
		<li>Na primeira semana, altere a solução em 3 dias. Depois de uma semana, atualize a solução de limpeza uma vez por semana até o ovário torna-se claro. Geralmente este processo demora cerca de 2-3 semanas. Nota: O ovário pode ser diretamente immunostained ou pode ser armazenado em azida de sódio (0,02%) em PBS a 4 ° C, durante várias semanas antes de imunocoloração.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. imunocoloração
<ol><li>Lave o ovário duas vezes em PBST no dia 1 a 37 ° C, um agitador.</li>
	<li>Incubar o ovário num agitador na solução de anticorpos primários/PBST (tabela 1) no dia 2-3 a 37 ° C. No trabalho apresentado aqui, os anticorpos primários foram a molécula de adesão plaquetária-endothelial da pilha 1 (CD31) e tirosina hidroxilase diluído em 01:10 e 01:50 em PBST, respectivamente. Cuidado: Se são usados dois ou mais tipos de anticorpo primário, certifique-se que existem diferentes fontes animais.</li>
	<li>Lave os anticorpos primários com tampão PBST a 37 ° C no dia 4, um agitador.</li>
	<li>Incube o ovário com os desejado anticorpos secundários em PBST no dia 5-6 a 37 ° C, um agitador. O trabalho aqui apresentado, os anticorpos secundários foram Alexa 488 farinha para tirosina hidroxilase e Alexa farinha 594 para CD31 diluído em 01:50 em PBST.</li>
	<li>Lave os anticorpos secundários com tampão PBST a 37 ° C no dia 7 um agitador.</li>
	<li>Transferi o tecido para índice de refração correspondente solução para homogeneização de índice de refração no dia 8. Colocar o tecido em um papel com linhas de grade para verificar sua clareza visual, verificando se as linhas de grade podem ser vistas. Uma vez que o tecido tem sido totalmente esclarecido, isso pode ser fotografado.</li>
	<li>Faça um cilindro de massa que poderia envolve apenas o tecido e então moldá-la em forma de ferradura e pressione o cume exterior firmemente na placa de vidro para fazer um espaço fechado. A altura da massa deve ser um pouco mais alta do que o ovário.</li>
	<li>Coloque o ovário esclareceu cuidadosamente no centro do putty e adicionar solução de correspondência de índice de refração. Coloque um prato fundo de vidro sobre o putty firmemente e use massa para consertar o prato.</li>
</ol>3. Confocal da microscopia
<ol><li>Para a imagem latente com um microscópio confocal, no painel "Ni-E" escolha a lente (em imersão neste caso água 25 X lente objetiva, 1.1-NA, 2 mm-WD) com a distância de trabalho adequada (nesse caso 2,0 mm).</li>
	<li>
No painel de "Aquisição", selecione o número de canais. Aqui, use três canais.
	<ol>
<li>Primeiro, use a guia "porto de olho" e o joystick de controlador XY para mover o tecido para o centro do campo, verificando através das oculares do microscópio.</li>
		<li>Depois de desligar a luz do obturador, clique na guia "ao vivo" para ajustar o "poder do laser", "HV (ganho)", e "deslocamento" para cada canal separadamente. Maior potência do laser e a alta tensão podem levar a sinais de maiores e maior deslocamento pode reduzir o ruído de fundo.</li>
		<li>Selecione o tamanho adequado"Scan" e "Count". Use um tamanho de varredura de 1024 x 1024 µm2 e uma contagem de 4 a 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Depois de definir a qualidade de imagem para definir a profundidade do tecido no painel "Correção de intensidade de Z" e depois localizar a lente na camada superior do ovário (no centro do tecido) e ajuste a aquisição para a camada superior, clique o "plus" botão para definir a camada superior.
	<ol>
<li>Mover a lente para baixo e definir o HV apropriado e poder do laser para a parte inferior do tecido e adicionar as informações de camada mais baixas na tabela de correção de Z-intensidade. Clique em "Ao ND" para sincronizar a configuração com o painel de "Aquisição de ND".</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Painel em "ND aquisição", primeiro conjunto, o número de digitalização passos. Em seguida, marque as guias "Z" e "Imagem grande".
	<ol>
<li>Vá para a janela de "Varredura de imagem grande" para definir o tamanho do campo de acordo com a borda do tecido com a ajuda de visualização do tecido através das oculares. Volte para o painel de "Aquisição de ND" para o tamanho da área de digitalização ("campos") de entrada e escolha a sobreposição entre 10% e 15%.</li>
		<li>Clique em "Run Z correção", não "executar agora", para automaticamente definir o HV, poder do laser e deslocamento apropriado para cada camada e esperar a imagem processar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 3D reconstrução de folículos individuais e seus Vasculatures
<ol><li>Primeiro, use o ImageJ5 para abrir o arquivo original do NIS. Clique no botão "Imagem" e escolher a "cor" e os canais de"Split". Em seguida, clique em "Arquivo" e salve separadamente os canais como série de arquivo tiff usando a opção de "Sequências de imagem" em "Salvar como".</li>
	<li>Use Imaris para abrir uma das séries de arquivo tiff. Clique no botão "Editar" e escolha "Adicionar canais" para adicionar o resto dos canais. O nome e a cor do canal podem ser alterados nas guias "Ajuste de tela". A espessura do tecido talvez precise ser corrigido no painel "Propriedades da imagem" na lista drop-down sob "Editar".</li>
	<li>Para o corte das imagens finais e remoção de excesso peças 3D, clique no botão "Editar" e escolha "Crop 3D". O tamanho do campo pode ser ajustado arrastando a borda.</li>
	<li>
Para reconstruir os sinais de navio com o algoritmo de filamentos no painel Surpass, clique no botão "Filamentos" para criar um novo filamento e clique em Avançar.
	<ol>
<li>Para definir o maior e o mais fino diâmetro, vá para o painel de "Fatia" e encontrar o navio de rastreamento. A distância será automaticamente mostrada no painel "Medida", selecionando dois pontos com a largura máxima da embarcação.</li>
		<li>Voltar para o painel "Surpass" e a medida largura de entrada e clique em Avançar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajuste o limite de ponto de partida e sementes. No painel "Câmera", escolha "Selecionar". Se algumas das esferas automaticamente produzidas precisam ser removidos, Pressione shift e clique no ponto. Escolhendo a "Navegar" e movendo o mouse, a estrutura pode ser girada para garantir que todos os pontos corretos foram mantidos e clique em Avançar.</li>
	<li>Escolher o limite mais alto para o contraste local e clique em Avançar. Não selecione "Detectar espinhos" e continuar finalizar a reconstrução do cilindro vaso sanguíneo. A cor pode ser editada clicando na aba "Cores". Os dados estatísticos podem ser extraídos no painel "Estatística" do filamento reconstruído. Peças em excesso podem ser removidas do painel de "Editar". Nota: Outros algoritmos podem ser usados para medir o volume dos folículos totais ou paredes foliculares. O trabalho aqui apresentado, os oócitos foram marcados pela autofluorescência de ambos os anticorpos secundários. Devido à grande quantidade de dados, utilizou-se um servidor de estação de trabalho para a análise de dados.</li>
</ol>5. análise estatística
Nota: Dados de análise de imagem são apresentados como média ± erros-padrão.
<ol><li>Realizar comparações entre os folículos usando teste t de amostras independentes e usar o teste de correlação de Pearson para comparar os coeficientes de correlação da parede folicular e comprimento capilar. Definir um valor de P < 0,05 como o limite de significância estatística.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

No estudo atual, apresentamos a imagem para avaliar as relações entre os capilares e folículos de crescimento individuais 3D. Em nosso trabalho anterior, usando o mesmo protocolo n º 9, estudamos os papéis de grande vascularização, interações entre os folículos e a localização de folículos nos ovários intactos do mouse. A abordagem passiva de clareza nos permitiu estudar macro e micro --vasculatures, Foliculogénese e as inter-relações entre o alaranjado e folículos, bem como para reconstruir a arq...

O folículo é a unidade estrutural e funcional fundamental do ovário, e seu desenvolvimento está altamente relacionada com a vasculatura dentro do ovário. Vasos sanguíneos fornecer nutrição e hormônios para os folículos e, portanto, desempenhar um papel importante no crescimento e maturação dos folículos1.
Uma combinação de tecnologias, incluindo marcadores seletiva dos vasos sanguíneos, modelos do rato transgénico e desenvolvimento farmacêutico, aumentaram nosso conhecimento sobre redes vasculares no ovário, angiogênese e a função dos vasos sanguíneos Foliculogénese. O ovário é conhecido como um órgão ativo porque ele remodela vários tecidos e redes vasculares durante Foliculogénese e ovulação. Tal ativo remodela o tamanho e a estrutura dos vasos é necessária para a função biológica de desenvolvimento e de recrutamento de folículos.
Métodos tradicionais de histológica e histomorfométrica usando seções no ovário e immunolabeling dos vasos sanguíneos estão limitados a imagens bidimensionais (2D)2. Com o desenvolvimento de tecnologias de reconstrução tridimensional (3D), imagens em 2D de fatias de tecido podem ser sobrepostas para fazer uma estrutura 3D, mas esse método ainda tem algumas limitações — corte do tecido pode destruir as microestruturas, algumas partes do tecido são muitas vezes ausentes, e significativo trabalho está envolvido em fazer reconstruções 3D a partir de imagens obtidas de fatias. Imagem 3D todo-tecido com microscopia confocal pode ultrapassar muitas dessas limitações, mas esses métodos limitam-se à avaliação da angiogênese no ovário embrionário3. Usar o tecido inteiro limpando métodos tais como clareza4 pode aumentar o volume visualizado a fim de resolver estes problemas nos ovários pós-natal e adultos, e tais métodos fornecem acesso óptico do ovário sem deformações estruturais. Imagem da arquitetura 3D do ovário intacto fornece um banco de dados de imagem exata para software de análise de imagem, tais como o pacote de software hottie utilizado neste trabalho.
Remodelação do ovário durante a vida adulta é parte de um sistema fisiológico dinâmico, e isso faz com que o ovário um excelente modelo para investigações sobre a regulação da angiogênese. Além disso, avaliar o papel de vasos ovarianos em condições patológicas do sistema reprodutor feminino, tais como a síndrome do ovário policístico ou cancros ovarianos pode ser estudada através da imagem do tecido ovariano toda. O desenvolvimento do método passivo clareza e o uso de software de análise avançada de imagens apresentaram informações espaciais detalhadas sobre as relações entre os vasos sanguíneos e ovário estruturas tais como folículos.

<table><tbody><tr><td>Acrilamida</td><td>Vetec</td><td>v900845</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845</td></tr><tr><td>Alexa Flour 488 (Diluição 1:50)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11039</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039</td></tr><tr><td>Alexa Flour 594 (Diluição 1:50)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>Bisacrilamida</td><td>Amresco</td><td>172</td><td>http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx</td></tr><tr><td>Prato de fundo de vidro de parede preta (Willco-Dish)</td> <td>Ted Pella</td><td>14032</td><td>http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sinopharm Reagente químico</td><td>10004818</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818</td></tr><tr><td>hidrogenofosfato dissódico dodecahidratado (Na2HPO4 12H2O)</td><td>Sinopharm Reagente Químico</td><td>10020318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318</td></tr><tr><td>FocusClear</td><td>Celexplorer</td><td>FC-102</td><td>http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1</td></tr><tr><td></td><td>Parafilm Bemis</td><td>PM996</td><td>http://www.parafilm.com/products</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sinopharm Químico Reagente</td><td>80096618</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618</td></tr><tr><td>PECAM1 / CD31, molécula de adesão de células endoteliais plaquetárias 1 (Diluição 1:10)</td> <td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html</td></tr><tr><td>Fotoiniciador VA044</td><td>Wako</td><td>va-044 / 225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td> <td>Reagente químico Sinopharm</td><td>10019318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318</td></tr><tr><td>Dihidrogenofosfato de sódio di-hidratado (NaH 2PO4 2H 2 O)</td> <td>Reagente químico Sinopharm</td><td>20040718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Sinopharm Reagente Químico</td><td>30166428</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428</td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio (NaOH)</td><td>Sinopharm Reagente Químico</td><td>10019718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sinopharm Reagente Químico</td><td>30188928</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928</td></tr><tr><td>Tirosina hidroxilase (TH, Diluição 1:50)</td><td>Abcam</td><td>ab76442</td><td>http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html</td></tr></tbody></table>

reconstrução tridimensional da arquitetura vascular do ovário passiva mouse clareza-limpo

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

O ovário é o principal órgão do sistema reprodutor feminino e é essencial para a produção de gametas femininas e para controlar o sistema endócrino, mas as relações estruturais complexas e arquiteturas tridimensionais (3D) vasculatura do ovário não são bem descritas. Para visualizar as conexões 3D e arquitetura dos vasos sanguíneos no ovário intacto, o primeiro passo importante é tornar o ovário opticamente claro. Para evitar o encolhimento do tecido, usamos o hidrogel baseado em fixação passiva CLARITY (lipídios claro-trocadas rígida do acrilamido-hibridizado imagem / Immunostaining/In situ da hibridação-compatível com hidrogel de tecido) método para limpar um ovário intacto de protocolo . Immunostaining, avançado do multiphoton microscopia confocal e imagem-reconstruções 3D foram então usados para a visualização dos vasos ovarianos e capilares foliculares. Usando essa abordagem, mostrou uma correlação positiva significativa (P < 0,01) entre o comprimento dos capilares foliculares e volume da parede folicular.

Adaptamos o método passivo de clareza em um método rápido e simples para limpar enquanto preserva a arquitetura folicular e vascular e obtendo o maior sinal fluorescente de marcadores rotulados de navios e folículos do ovário passivo. A arquitetura 3D da vasculatura folicular foi determinada por imunocoloração para CD31, um marcador para células endoteliais6. CD31 coloração nos ovários de camundongos adultos foi rastreado usando o algoritmo de filamento e mostrou a...

Aqui apresentamos uma adaptação do método de reconstrução 3D para visualização da vasculatura do ovário e capilares foliculares e clareza passiva em ovários intactos do mouse.

Reconstrução tridimensional da arquitetura Vascular do ovário passiva Mouse clareza-limpo

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

O objetivo geral deste protocolo é fornecer uma visão tridimensional completa da distribuição dos capilares nos folículos ovarianos de camundongos e mostrar suas relações. O ovário é um órgão essencial na reprodução e na endocrinologia. Conte cada estágio diferente de desenvolvimento do folículo e as células somáticas.Além disso, ao contrário de outros órgãos, o ovário não apresenta ramificação repetida da unidade funcional. O sistema vascular local, juntamente com o sistema nervoso, também é capaz de sofrer grandes alterações em cada ciclo menstrual em mulheres adultas. A aplicação da clareza passiva no ovário permite-nos observar a distribuição geral e as conexões entre essas células e folículos no ovário.A maior vantagem desta técnica é que ela tem o menor efeito sobre o ovário e permite a visualização de diversos marcadores. Por meio da reconstrução da imagem microscópica, fornecemos um mapa do ovário. Alguns detalhes dos vasos, neurônios e folículos podem ser observados com clareza.Para a análise de imagem, algumas opções do Imaris foram utilizadas para avaliar as relações entre o ovário e as estruturas. Prepare as soluções de perfusão de acordo com as instruções do artigo e mantenha-as em gelo. Anestesie os camundongos e certifique-se de que o camundongo não apresente resposta ao aperto nos dedos dos pés.Pulverize etanol, faça uma incisão no átrio direito e, em seguida, perfunda imediatamente o ventrículo esquerdo com 20 ml de PBS gelado a uma velocidade de 10 ml por minuto para remover o sangue. Em seguida, perfunda o animal com Solução de Hidrogel Fria na mesma velocidade. Colete os ovários e o útero para manter a integridade da morfologia ovariana.Transfira os ovários separados para a Solução de Hidrogel fria. Sob um microscópio estereoscópico, remova os tecidos adiposos ao redor do ovário. Para um melhor resultado da fixação do tecido, recomendamos a remoção da bursa ovariana.Mantenha os ovários em Solução de Hidrogel por três dias. Após três dias, transfira os ovários para um tubo de vidro e preencha o tubo com Solução de Hidrogel fresca. Estique o parafilm sobre a parte superior do tubo e, em seguida, enrole outro parafilm ao redor do pescoço do tubo.Certifique-se de que não haja bolhas entre o parafilm e a solução de hidrogel. Coloque o tubo de vidro em um incubador com agitação a 37 graus centígrados por duas horas, até que o gel se forme. Remova cuidadosamente o gel em excesso ao redor dos ovários com um filtro de papel.Coloque os ovários em um tubo de 15 ml e encha o tubo com 10 ml de solução de clareamento. Incube o tubo em um agitador a 37 graus Celsius por pelo menos dois meses. Troque a solução de clareamento diariamente nos primeiros três dias e depois semanalmente até que o ovário fique transparente.Todos os procedimentos de imunomarcação são realizados a 37 graus Celsius em agitador. Primeiro, lave o ovário em PBST durante 24 horas. Em seguida, incube o ovário no anticorpo primário diluído em PBST por dois dias.Terceiro, remova os anticorpos primários com tampão PBST. Quarto, incube o ovário com o anticorpo secundário desejado em PBST por dois dias. Quinto, remova os anticorpos secundários com PBST.Sexto, transfira o ovário para uma solução de casamento de índice de refração para a homogeneização do IR. Verifique a transparência visual; quando o ovário estiver completamente clareado, ele poderá ser imageado. Primeiro, prepare um recipiente limpo com fundo de vidro.Faça um cilindro de massa plástica e modele-o em formato de ferradura. Pressione a borda externa firmemente contra a lâmina de vidro para criar um espaço selado. A altura da massa plástica deve ser um pouco maior que a do ovário.Posicione cuidadosamente o ovário no centro e adicione a solução de montagem. Coloque uma lâmina sobre a massa e use dois pedaços de massa para fixá-la. Quando o ovário estiver pronto para ser visualizado, pode-se selecionar um microscópio confocal Nikon com objetiva de 16X para obter a imagem.Para a imagem com microscópio confocal, primeiro escolha a lente no painel Ni-E. No painel de aquisição, selecione o número de canais. Primeiro, utilize a guia Eye Port e o joystick controlador XY para mover o tecido até o centro do campo, verificando pelo microscópio através das oculares.Em segundo lugar, após desligar a luz do obturador, clique na guia live para ajustar a potência do laser, o HV e o deslocamento para cada canal. No painel Correção de Intensidade Z, ajuste a aquisição para a camada superior, clique no botão de adição para definir o topo, mova a lente para baixo e configure o HV e a potência do laser apropriados para a base do tecido, adicione as informações da camada mais baixa e clique em To ND para sincronizar as configurações com o painel e a aquisição. E na aquisição, defina primeiro o número de etapas de varredura.Clique nas guias Z e na imagem grande. Em seguida, vá para a janela de varredura da imagem grande para definir o tamanho do campo de acordo com a borda do tecido. Terceiro, retorne à aquisição ND para inserir o tamanho dos campos de varredura e escolher a sobreposição entre 10 e 50%. Em seguida, clique em executar correção Z e aguarde o processo de imageamento.Primeiro, use o imagic para abrir o arquivo NIS original. Clique no botão de imagem, escolha as cores e os canais de exibição, depois clique em arquivo, selecione sequências de imagens e salve-as separadamente como arquivos tiff. Em seguida, use o Imaris para abrir um dos arquivos tiff.Clique no botão de editar e escolha adicionar canais para incluir os demais. O nome e a cor podem ser alterados no ajuste de exibição. A espessura do tecido também deve ser corrigida nas propriedades da imagem.Terceiro, clique no botão de edição e escolha Recortar 3D para cortar a parte extra. Primeiro, clique no botão de filamento e clique em próximo. Vá ao painel de corte, localize um vaso traçado e a distância, depois volte ao Suplente, insira o valor estático e clique em próximo.Segundo, ajuste o ponto inicial e o limite definido. No painel da câmera, selecione, pressione shift e clique no ponto para remover a parte extra. Terceiro, escolha o limite mais alto e clique em próximo.Não selecione os pontos detectados e prossiga. Algumas partes excessivas podem ser removidas no painel de edição. A cor pode ser editada clicando na cor.A arquitetura tridimensional da vasculatura ovariana foi investigada após imunomarcação para CD31. A estrutura 3D pode ser observada por meio de cortes sucessivos ou em sua totalidade por meio de renderização volumétrica. A marcação para CD31 foi realizada na vasculatura folicular de camundongos adultos.Por meio da reconstrução dos capilares pelos filamentos, pudemos demonstrar a relação entre os folículos individuais e seus capilares. O ovário, assim como uma mulher, é sempre ativo e intercambiável. No entanto, devido à limitação da análise histológica tradicional, é muito difícil descrever as relações entre esses constituintes tão complexos.O método recém-desenvolvido, clareza passiva, pode nos ajudar a superar o obstáculo óptico, manter a integridade dos tecidos inteiros e fornecer pistas funcionais.

three-dimensional-reconstruction-vascular-architecture-passive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este estudo apresenta um protocolo para o tecido reversível compensação, imunocoloração, renderização 3D e análise de redes vasculares em amostras de vilosidades da placenta humana na ordem de 1-2 mm3.

Renderização tridimensional e análise de Immunolabeled, esclareceu humana da placenta vilosa redes vasculares

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar os folículos nos ovários culturas de ratos jovens sem seccionamento serial. Usando a imunofluorescência todo órgão e tecido de compensação, seccionamento físico é substituído com seccionamento óptico. Este método de preparação da amostra e visualização mantém a integridade do órgão e facilita a quantificação automatizada de células específicas.

Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

Culturas de tecido ovarianos podem ser usadas como modelos de atresia de folículo, ovulação e desenvolvimento do folículo e indicar mecanismos reguladores de processos dinâmicos de ovário.

Cultura do tecido ovariano Visualizar fenômenos no ovário de Mouse

Aqui, descrevemos, comparamos e contrastamos duas técnicas diferentes para a contagem precisa de folículos de tecidos ovarianos fixos do rato.

Enumeração de folículo preciso em ovários de rato adulto

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para imagens de ovários inteiros para análises quantitativas e qualitativas utilizando imunosscopia de montagem integral, microscopia multifotínica e visualização e análise 3D. Este protocolo acomoda um processamento de alto rendimento, confiável e repetível que é aplicável para toxicologia, diagnóstico clínico e ensaios genômicos da função ovariana.

Imunofluorescência total do ovário, compensação e microscopia multifotínica para análise quantitativa 3D da reserva ovariana em desenvolvimento em mouse

Os pericitos na vasculatura retiniana foram examinados por coloração imunofluorescente com receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas β após injeção retro-orbital de lectina fluorescente de tomate. A retina marcada foi posteriormente tratada com o método de limpeza de tecido e toda montada para visualizar as vistas tridimensionais dos pericitos ao redor da vasculatura retiniana sob um microscópio confocal.

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração 

Alterações no fluxo sanguíneo ovariano durante o período pré-ovulatório são essenciais para a ovulação. A ultrassonografia com Doppler tem sido usada em humanos e animais de grande porte para avaliar a hemodinâmica e a perfusão ovariana. É apresentado um protocolo de aplicação da ultrassonografia com Doppler para avaliação da hemodinâmica ovariana durante as fases pré-ovulatória e periovulatória em camundongos.

Ultrassonografia Doppler para imagens ao vivo e quantificação da função vascular ovariana em camundongos

O método de Hi-C permite a identificação imparciais, de todo o genoma de interações cromatina (1). Oi-C casais ligadura proximidade e seqüenciamento massivamente paralelo. Os dados resultantes podem ser usados ​​para estudar a arquitetura genômica em múltiplas escalas: resultados iniciais identificadas características como territórios cromossomo, a segregação da cromatina abertas e fechadas, e estrutura da cromatina na escala megabase.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

Gerando pluripotentes induzidas de células-tronco (IPSC) produz linhas de linhas de diferentes potencial de desenvolvimento, mesmo quando eles passam por testes padrão pluripotência. Aqui nós descrevemos um protocolo para produzir ratos derivadas inteiramente de iPSCs, que define as linhas iPSC como possuindo pluripotência...

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

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Uma ferramenta analítica que quantifica Alterações morfologia celular de imagens tridimensionais de fluorescência

Aprenda a reconstrução tridimensional da arquitetura vascular ovariana usando o método CLARITY passivo em ovários intactos de camundongo. Esta técnica revela a distribuição capilar em folículos ovarianos.

Reconstrução tridimensional da arquitetura Vascular do ovário passiva Mouse clareza-limpo

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