Reconstrução tridimensional da arquitetura Vascular do ovário passiva Mouse clareza-limpo

O objetivo geral deste protocolo é fornecer uma visão tridimensional completa da distribuição capilar em folículos ovarianos de camundongos e mostrar suas relações. O ovário é um órgão essencial na reprodução e na endocrinologia. Conte cada estágio de desenvolvimento diferente do folículo e das células somáticas.

Além disso, ao contrário de outros órgãos, o ovário não apresenta a ramificação repetida da unidade funcional. O sistema vascular local pode estar junto com o sistema nervoso também são capazes de sofrer grandes mudanças em cada ciclo menstrual em mulheres adultas. A aplicação da clareza passiva no ovário nos permite ver a distribuição geral e a conexão entre essas células e folículos no ovário.

A maior parte da chave dessa medida é que ela tem o menor efeito sobre o ovário e é responsável pela limpeza de vários marcadores. Através da reconstrução da imagem microscópica, fornecemos um mapa do ovário. Alguns detalhes dos vasos, neurônios e folículos podem ser observados claramente.

Para análise de imagens, algumas opções de Imaris foram utilizadas para avaliar as relações entre o ovário e as estruturas. Prepare soluções de profusão de acordo com as instruções do artigo e mantenha-as no gelo. Anestesie os ratos e certifique-se de que o mouse não tenha resposta de beliscão do dedo do pé.

Pulverize etanol, faça uma incisão no átrio direito e, em seguida, profusa instantaneamente o ventrículo esquerdo com 20ml de PBS gelado na velocidade de 10ml por minuto para eliminar o sangue. Em seguida, profusa o animal com solução de hidrogel fria com a mesma velocidade. Colete os ovários, bem como o útero, para manter a integridade da morfologia ovariana.

Transfira os ovários separados para a solução de hidrogel fria. Sob um microscópio estéreo, remova os tecidos adiposos ao redor do ovário. Para melhor resultado da fixação tecidual, recomendamos a remoção da bursa ovariana.

Mantenha os ovários em solução de hidrogel por três dias. Após três dias, transfira os ovários para um tubo de vidro e encha o tubo com solução de hidrogel fresca. Estique o parafilme sobre a parte superior do tubo e, em seguida, enrole outro parafilme ao redor do gargalo do tubo.

Certifique-se de que não haja bolhas entre o parafilme e a solução de hidrogel. Coloque o tubo de vidro em uma incubadora agitadora a 37 graus centígrados por duas horas até que o gel se forme. Remova cuidadosamente o excesso de gel ao redor dos ovários com um filtro de papel.

Coloque os ovários em um tubo de 15ml e encha o tubo com 10ml de solução de limpeza. Coloque o tubo em uma incubadora agitadora a 37 graus centígrados por pelo menos dois meses. Troque a solução de limpeza todos os dias nos primeiros três dias e depois semanalmente até que o ovário seja limpo.

Todos os procedimentos de imunocoloração são feitos a 37 graus centígrados em um agitador. Primeiro, lave o ovário em PBST por 24 horas. Segundo ovário incubado em anticorpo primário diluído por PBST por dois dias.

Terceiro, lave os anticorpos primários com tampão PBST. Quarto, incube o ovário com o anticorpo secundário desejado em PBST por dois dias. Quinto, lave os anticorpos secundários com PBST.

Sexto, transfira o ovário para uma solução de correspondência de índice de refração para homogeneização de IR. Verifique a transparência visual, quando o ovário estiver totalmente esclarecido, ele poderá ser fotografado. Primeiro, prepare um prato com fundo de vidro limpo.

Faça um cilindro de massa e molde-o em forma de ferradura. Pressione a borda externa firmemente na corrediça de vidro para criar um espaço selado. A altura da massa deve ser um pouco mais alta que o ovário.

Mova o ovário com cuidado para o centro e adicione a solução de montagem. Empurre um prato sobre a massa e use dois pedaços de massa para consertá-lo. Quando o ovário estiver pronto para a imagem, o microscópio confocal Nikon com lente 16X pode ser selecionado para obter a imagem.

Para imagens com microscópio confocal, primeiro escolha a lente no painel Ni-E. No painel aquisição, selecione o número de canais. Primeiro, use a guia Eye Port e o joystick do controlador XY para mover o tecido para o centro do campo por meio da verificação por oculares de microscópio.

Em segundo lugar, depois de desligar a luz do obturador, clique na guia ao vivo para ajustar a potência do laser, HV e deslocamento para cada canal. No painel Correção de intensidade Z ajuste a aquisição para a camada superior, clique no botão de adição para definir a parte superior, mova a lente para baixo e defina a potência apropriada de HV e laser para a parte inferior do tecido e adicione as informações da camada mais baixa, clique em Para ND para sincronizar a configuração com o painel e a aquisição. E na aquisição, primeiro defina o número de etapas de verificação.

Clique nas guias de Z e imagem grande. Em segundo lugar, vá para a janela de imagem grande de varredura para definir o tamanho do campo de acordo com a borda do tecido. Terceiro, de volta à aquisição ND para inserir o tamanho dos campos de digitalização e escolher a sobreposição entre 10 e 50%Em seguida, clique em executar correção Z e aguarde o processo de imagem.

Primeiro use o imagic para abrir o arquivo NIS original. Clique no botão de imagem, escolha os canais de cor e exibição, clique em arquivo, escolha as sequências de imagens e salve-as separadamente como arquivos tiff. Em segundo lugar, use o Imaris para abrir um dos arquivos tiff.

Clique no botão editar e escolha adicionar canais para adicionar o restante. O nome e a cor podem ser alterados no ajuste do visor. A espessura do tecido também deve ser corrigida nas propriedades da imagem.

Terceiro, clique no botão editar e escolha Crop 3D para cortar a parte extra. Primeiro, clique no botão de filamento e clique em próximo. Vá para o painel de fatias, encontre um recipiente de rastreamento e distância, depois volte para o Surpass, insira a estática e clique em próximo.

Em segundo lugar, ajuste o limite inicial e o ponto de ajuste. No painel da câmera, escolha a seleção, pressione shift e clique no ponto para remover a parte extra. Terceiro, escolha o limite mais alto e clique em Avançar.

Não selecione pontos de detecção e vá em seguida. Algumas peças em excesso podem ser removidas no painel de edição. A cor pode ser editada clicando na cor.

A arquitetura 3D da vasculatura ovariana foi investigada após a imunomarcação de CD31. A estrutura 3D pode ser observada por fatias através de outras fatias ou por totalidade através da renderização de volume. CD 31 é a coloração da vasculatura folicular de camundongos adultos.

Através da reconstrução dos capilares pelos filamentos, pudemos mostrar a relação entre os folículos individuais e seus capilares. O ovário, como uma mulher, está sempre ativo e intercambiável. No entanto, devido à limitação da análise histológica tradicional, é muito difícil descrever as relações entre esses constituintes complexos.

O método recém-desenvolvido, a clareza passiva pode nos ajudar a superar o obstáculo óptico, manter a integridade de todos os tecidos e fornecer as pistas funcionais.