Síntese de bacteriófagos infecciosa em uma e. coli-com base em sistema de expressão livre de célula

O objetivo geral deste experimento é descrever como os bacteriófagos são sintetizados a partir de seu genoma usando um sistema de tradução de transcrição livre de células E.coli. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia sintética, como elucidar os mecanismos de automontagem molecular em sistemas vivos. A principal vantagem dessa técnica é a versatilidade da plataforma.

Muitos sistemas biológicos podem ser totalmente recapitulados e ajustados para análise experimental. Comece este procedimento com a preparação de placas de fagos, conforme descrito no protocolo de texto. Use a ponta de uma pipeta Pasteur estéril para retirar o núcleo e remover uma única placa.

Sopre a placa nas células diluídas. Em seguida, incube a 37 graus Celsius por duas horas. Para testar a infecção completa, pegue uma amostra de 500 microlitros em um tubo de 1,5 mililitro e adicione 10 microlitros de clorofórmio.

Imediatamente vortex a mistura em alta velocidade e observe se a solução esclarece, o que indica infecção por fagos. Quando as células estiverem totalmente infectadas, incube por mais duas horas. Em seguida, adicione DNase antes de centrifugar as células a 8.000 vezes g e quatro graus Celsius.

Descarte o sobrenadante e, em seguida, suspenda novamente o pellet em 10 mililitros de cloreto de magnésio 1X Tris. Adicione 500 microlitros de clorofórmio e vórtice em alta velocidade para lisar as células. Clarificar por centrifugação a 12 000 vezes g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, retire o sobrenadante em um tubo cônico de 15 mililitros e armazene a quatro graus Celsius. Prepare quatro gradientes de cinco a 45% de sacarose pipetando 2,5 mililitros de sacarose a 45% em quatro tubos de ultracentrífuga. Cubra a camada com aproximadamente 2,6 mililitros de 5% de sacarose, parando quando o líquido atingir dois milímetros da borda do tubo.

Misture os gradientes por rotação do tubo de inclinação usando um instrumento formador de gradiente por 43 segundos a 86 graus e 23 RPM. Usando uma pipeta de um mililitro, adicione 500 microlitros da suspensão de fago agrupada, colocando a ponta em contato com a superfície do líquido e dispensando muito lentamente o volume no topo do gradiente de sacarose, tomando cuidado para não misturar por pipetagem rápida. Centrifugue a 70.000 vezes g por 20 minutos a quatro graus Celsius.

Mergulhe uma cânula romba na solução até que a ponta esteja centralizada na borda superior da banda do fago. Remova a banda puxando o êmbolo da seringa até que a maior parte da banda do fago tenha sido removida. Em seguida, adicione o volume de sacarose com o fago suspenso a três ou quatro tubos de ultracentrífuga.

Encha os tubos entre três e quatro milímetros do topo do tubo com 1XTM frio. Cubra os tubos com filme de parafina e inverta para misturar. Coloque os tubos de volta em uma ultracentrífuga e gaste a 145.000 vezes g por uma hora a quatro graus Celsius.

Despeje rapidamente o sobrenadante e escorra de cabeça para baixo em lenços descartáveis. Divida 200 a 400 microlitros de 1XTM frio em todos os pellets e ressuspenda durante a noite a quatro graus Celsius. Não é necessário agitar.

Um dia antes de fazer os títulos, prepare uma cultura de células hospedeiras de E.coli em 10 mililitros de meio de crescimento LB e deixe a cultura em uma incubadora agitada ajustada para 250 RPM e 37 graus Celsius durante a noite. Em seguida, prepare uma mistura mestre pipetando 5,25 mililitros de ágar superior, 220 microlitros de amostras de fagos diluídas e 50 microlitros de células bacterianas hospedeiras em um tubo de cultura de 14 mililitros. Tampe o tubo de cultura e o vórtice em alta velocidade.

Recupere duas placas de cultura da incubadora de 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 2,5 mililitros de master mix lentamente no centro do primeiro prato. Gire suavemente a placa com a mão para distribuir a mistura principal uniformemente, de modo que ela abranja toda a placa de cultura.

Aguarde 20 minutos para garantir a solidificação do ágar superior. Incube as placas a 37 graus Celsius por quatro a sete horas. Conte as placas e determine a concentração de fagos para cada amostra de reação.

Dilua uma parte do estoque de fagos para 400 microlitros com tampão 1XTM em um tubo novo de 1,5 mililitro. Adicionar um volume igual de trisfenol clorofórmio à diluição. Agite a mistura suavemente em uma espreguiçadeira de laboratório ou com a mão por cinco minutos.

Em seguida, centrifugue a emulsão resultante a 17.000 vezes g em uma centrífuga de bancada por cinco a 10 minutos. Remova a fase aquosa superior para um novo tubo, tomando cuidado para não perturbar o limite da interfase. Repita essas etapas mais duas vezes para um total de três extrações de fenol.

Transferir a fase aquosa para um tubo novo e adicionar um volume igual de clorofórmio. Agitar e centrifugar antes de transferir a amostra de ADN aquosa para um tubo limpo. Em seguida, adicione 0,4 volumes de acetato de sódio de três molares e três volumes de etanol a 95%.

Coloque o tubo em um freezer de menos 20 graus Celsius para precipitação durante a noite. Centrifugue a 17.000 vezes g em uma centrífuga de bancada por 10 a 15 minutos. Remover e rejeitar o sobrenadante, quer por decantação, quer por pipetagem.

Em seguida, adicione 500 microlitros de etanol a 70% e agite suavemente o tubo até que o pellet flutue e solte do fundo do tubo. Após a centrifugação, remova e descarte o etanol, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Depois de adicionar etanol e centrifugar como antes, remover e descartar o etanol uma segunda vez, mais uma vez tomando cuidado para não perturbar o pellet.

Seque o pellet ao ar livre na bancada por 30 a 60 minutos. Depois de seco, adicione 50 microlitros de água bidestilada ao pellet e incube por uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius para ressuspender. Determine a concentração de DNA usando medições de absorção a 280 nanômetros.

Para realizar a reação sem células, alíquota do volume indicado de extrato bruto, 33% do volume final da reação, em um tubo de microcentrífuga. Prepare a mixagem principal conforme listado no protocolo de texto. Adicionar o volume adequado de cada componente ao extracto bruto.

Depois de adicionar o último componente, homogeneizar a reação por vórtice. Em seguida, divida a mistura principal em n tubos de microcentrífuga. Em seguida, adicione os volumes indicados dos componentes variáveis à matriz master mix.

Adicione água a cada reação para atingir o volume de reação final desejado antes do vórtice. Em seguida, incube os tubos da microcentrífuga a 29 graus Celsius por pelo menos oito horas ou durante a noite. Depois de preparar as células para o título do fago, conforme descrito no protocolo de texto, titule a solução final de LB de reação livre de células, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo.

Aqui são mostrados os resultados representativos de uma reação livre de células sintetizando o fago phi X 174. Esta placa de fago mostra uma reação de fago bem-sucedida que foi titulada em uma diluição apropriada, evidente pelo número contável de placas. No entanto, uma reação bem-sucedida pode aparecer mal se o fator de diluição for muito baixo para o rendimento do fago da reação.

Esta placa mostra um número incontável de placas. Aqui é mostrada uma placa com distribuição não homogênea de placas de fago devido ao pré-equilíbrio insuficiente da temperatura da placa de cultura. Durante o título do fago, a placa de cultura solidificou a reação na porção inferior direita da placa.

As condições de aglomeração molecular têm um forte efeito na síntese de fagos para phi X 174 e, T7.In particular, o rendimento de fagos para T7 cai em três ordens de magnitude quando as concentrações de PEG caem de quatro para 2% em peso por volume. Uma vez dominado, a purificação do fago e a extração do DNA podem ser feitas em dois dias, se forem realizadas corretamente. A reação sem células leva apenas algumas horas quando não há problemas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar fagos, extrair e purificar seu DNA e usar o resultado para reconstituir fagos totalmente infecciosos usando o sistema de reação livre de células. Trabalhar com fenol pode ser extremamente perigoso, e precauções como jaleco, proteção para os olhos e luvas devem ser usadas durante a realização deste procedimento. Todo o trabalho com recipientes abertos de fenol deve ser realizado em uma capela de exaustão.