Name: Síntese de bacteriófagos infecciosa em uma e. coli-com base em sistema de expressão livre de célula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Aprenda a síntese de bacteriófagos infecciosos usando um sistema de transcrição-tradução livre de células E. coli. Este método permite estudar mecanismos de auto-montagem molecular em biologia sintética.

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Este material é baseado no trabalho suportado pelo escritório de pesquisa Naval prêmio número N00014-13-1-0074 (V.N.), o programa de ciência de fronteira humana conceder número RGP0037/2015 (a V.N.), e a Fundação científica Binacional conceder 2014400 (V.N.).

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</ol>

Os autores declaram o interesse financeiro concorrentes seguintes: laboratório de Noireaux recebe fundos de pesquisa do MYcroarray, um distribuidor do kit de expressão da proteína sem célula de MYtxtl.

Seguindo a técnica em Chen, et al 14 para SPMC, um passo crítico é atingido quando determinar condições adequadas para o superinfeção. O parâmetro que controla a capacidade de uma estirpe hospedeiro para resistir a superinfeção mais estreitamente com frequência é a concentração inicial do fago infectante. As células hospedeiras devem estar em fase de crescimento logarítmico antes da infecção inicial, com uma pequena quantidade do fago. Eventualmente, a Praga também alcançará crescimento l...

Na última década, a tecnologia de célula livre expressão foi projetada para aplicações de romance endereço em biologia relacionadas a sintética e quantitativos de investigação multidisciplinar emergente áreas. Originalmente usado para expressar proteínas independentes de um organismo vivo, novos sistemas TXTL sem célula foram desenvolvidos para ambas as ciências básicas e aplicadas1,2, ampliar consideravelmente o alcance desta tecnologia. A nova geração de plataformas TXTL foi projetada para ser amigável, mais eficiente (atingindo 2 mg/mL de síntese de proteínas em modo de lote3), a mais versátil a nível de transcrição4e modular para integram facilmente romance natural ou funções sintéticas expandir as capacidades existentes sistemas biológicos5,6. Em particular, sistemas TXTL sem célula tornaram-se útil para a prototipagem rápida de programas genéticos, tais como elementos reguladores ou pequenos circuitos genéticos7,8,9, reduzindo o projeto-compilação-teste a alguns dias do ciclo. Notavelmente, os novos sistemas TXTL também são capazes de processar grandes programas de DNA como a síntese completa de coliphages10,11, demonstrando forte suficiente performances para apoiar a reconstituição da genômica ativo DNA codificado entidades vivas.
Sistemas TXTL apresentam muitas vantagens técnicas em relação ao tradicional em vitro construtivo ensaios bioquímicos. TXTL sem célula vincula o processo de expressão gênica ao produto final em um ambiente aberto e reduzido, em oposição ao complexo citoplasma de uma célula viva. TXTL usa DNA para reconstruir sistemas bioquímicos em vitro, que, com modernas técnicas de montagem de DNA, é acessível e rápido além de não exigir etapas de purificação de proteínas fastidioso. Expressão sem célula fornece acesso direto a maioria dos componentes nas reações bioquímicas, permitindo assim uma dissecação mais profunda das interações moleculares12. Em uma reação TXTL, um pode alterar as configurações de bioquímicas e biofísicas à vontade, que é quase impossível em uma célula viva. Dadas essas vantagens e melhorias recentes, a tecnologia TXTL está se tornando cada vez mais popular como uma plataforma alternativa para a biologia sintética e quantitativa. Enquanto a comunidade de pesquisa usando TXTL está crescendo rapidamente e TXTL está se tornando uma tecnologia padrão em bioengenharia, é essencial para entender como usar tais plataformas a fim de desenvolver práticas adequadas relacionadas com a execução de reações TXTL e para a interpretação dos resultados.
Neste artigo, descrevemos como usar um sistema TXTL de e. coli todos para sintetizar, em um pot-reações, bacteriófagos de seu genoma11, tais como MS2 (RNA, 3,4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5,4 kb) e T7 (dsDNA, 40 kb). Mostramos como a quantidade do fago sintetizado as alterações em relação a algumas das configurações de bioquímica das reações (concentração de magnésio e potássio). Apinhamento molecular, emulado por uma gama de PEG 8000 concentrações, tem um efeito dramático na síntese do fago sobre várias ordens de grandeza. A realização desses grandes sistemas bioquímicos em reações de único tubo de ensaio que recapitular simultaneamente os processos de transcrição, tradução e self-assembly, é interessante para abordar questões básicas relacionadas com a biologia e biofísica 10 (regulação gênica auto-montagem), bem como para desenvolvimento de aplicações, tais como a redefinição de funções do fago para construir novas nanoestruturas13. Além de um prático em TXTL, nós fornecemos métodos para amplificação do fago, extração de genoma e purificação e quantificação do fago por ensaio da chapa. Os métodos apresentados neste manuscrito são adequados para os investigadores que utilizam sistemas de célula livre extrato com base em Escherichia coli e estão interessados em bacteriófagos.
Os protocolos apresentados neste trabalho podem ser resumidos como segue: amplificação do fago 1) (1 dia: preparar inoculação células, dia 2: única placa, o crescimento do fago, múltiplas e concentração e dia 3: purificação do fago), 2) extração de DNA dupla-hélice do genoma (extração fenol/clorofórmio) e 3) sem célula reação do fago e experimento de título (1 dia: células hospedeiras da placa e fazer placas de ágar, dia 2: reação celular livre e anfitrião de células pré-cultura e dia 3: título de cultura e do fago de célula hospedeiro).

<table><tbody><tr><td>Tubos de ultracentrifugação</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Fabricante de gradientes</td><td>BioComp Gradient Master</td><td>ver Anal Biochem. 1985 julho; 148(1):254-9.</td><td></td></tr><tr><td>Seringa e Cânula Romba</td><td>Monoject</td><td>8881513918 e 888202017</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de diâmetro largo</td><td>Fischerbrand</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>Contador de placas</td><td>New Brunswik Scientific</td><td>Colony Counter Modelo C-110</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura</td><td>Fischerbrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Sistema sem células</td><td>Mycroarray Inc</td><td>Mytxtl</td><td></td></tr><tr><td>BioComp Gradient Master</td><td>BioComp Instruments</td><td>Modelo 105ME</td><td></td></tr><tr><td>LB receita de placa de</td><td></td><td></td> ágar <td>25 g/L de meio Luria-Bertani (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents número do produto BP1426) e 15 g/L de Bacto-Agar sólido (Brenton, Dickenson and Company - número do produto 214010).</td></tr></tbody></table>

síntese de bacteriófagos infecciosa em uma e. coli-com base em sistema de expressão livre de célula

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Uma nova geração de sistemas sem célula transcrição-tradução (TXTL), projetado para ter uma maior versatilidade e modularidade, fornecer novos recursos para executar ciências básicas e aplicadas em reações de tubo de ensaio. Na última década, sem célula TXTL tornou-se uma técnica poderosa para uma ampla gama de biologia relacionados quantitativa e sintético de pesquisa multidisciplinar romance áreas. As novas plataformas TXTL são particularmente úteis para construir e interrogar os sistemas bioquímicos através da execução de circuitos de gene sintético ou natural. In vitro TXTL provou conveniente rapidamente elementos reguladores do protótipo e redes biológicas, bem como para recapitular molecular auto-montagem mecanismos encontraram em sistemas vivos. Neste artigo, descrevemos como infecciosos bacteriófagos, tais como MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) e T7 (dsDNA), são sintetizados inteiramente do seu genoma em um pot-reações usando um todos Escherichia coli, célula livre sistema TXTL. Síntese dos três coliphages é quantificada utilizando o ensaio da chapa. Mostramos como o rendimento do fago sintetizado depende das configurações bioquímicas das reações. Apinhamento molecular, emulado por uma concentração controlada de PEG 8000, afeta a quantidade de fago sintetizado por ordens de magnitude. Descrevemos também como amplificar os fago e como purificar seus genomas. O conjunto de protocolos e resultados apresentados neste trabalho deve ser de seu interesse multidisciplinares pesquisadores envolvidos em Bioengenharia e biologia sem célula sintética.

Vamos mostrar quatro resultados representativos. Na Figura 1, apresentamos um conjunto de controles negativos para garantir que o sistema TXTL livre de célula e as existências de ADN do fago não estão contaminadas com vivos células de Escherichia coli . Verificamos que o sistema TXTL sem célula é livre de intacto Escherichia coli célula contaminação por chapeamento uma solução não incubados e incubadas reação vazio de DNA genômico (<strong c...

Uma nova geração de plataformas de transcrição-tradução livre de célula foi projetada para construir sistemas bioquímicos em vitro através da execução de circuitos de gene. Neste artigo, descrevemos como bacteriófagos, como MS2, ΦΧ174 e T7, são sintetizados a partir de seu genoma usando um Escherichia coli célula livre todos os sistema de TXTL.

Síntese de bacteriófagos infecciosa em uma e. coli-com base em sistema de expressão livre de célula

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

O objetivo geral deste experimento é descrever como os bacteriófagos são sintetizados a partir de seu genoma utilizando um sistema celular livre de transcrição e tradução totalmente baseado em E.coli. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na área de biologia sintética, como elucidar os mecanismos moleculares de autoorganização em sistemas vivos. A principal vantagem desta técnica é a versatilidade da plataforma.Muitos sistemas biológicos podem ser totalmente recapitulados e finamente ajustados para análise experimental. Inicie este procedimento com o preparo das placas de fago conforme descrito no protocolo textual. Utilize a extremidade de uma pipeta Pasteur estéril para perfurar e remover uma única placa.Sopre a placa nas células diluídas. Em seguida, incube a 37 graus Celsius por duas horas. Para testar a infecção completa, retire uma amostra de 500 microlitros para um tubo de 1,5 mililitro e adicione 10 microlitros de clorofórmio.Vortex imediatamente a mistura em alta velocidade e observe se a solução fica clara, o que indica infecção por fago. Uma vez que as células estejam completamente infectadas, incubar por mais duas horas. Em seguida, adicionar DNase a

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Bioengineering

Bioengenharia

Este artigo descreve o procedimento para a preparação de uma versão marcada com fluorescência do bacteriófago lambda, infecção...

Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

Source: Rustad, M. et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the amplification and recovery of infectious bacteriophages from E. coli cultures. It outlines the steps for plaque isolation, phage replication, controlled lysis, and purification.

Amplification and Recovery of Infectious Bacteriophages

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp.(2018)This video demonstrates preparation of a bacteriophage lysate containing transducing particles. A donor strain is infected, plaques form, and the soft agar overlay is processed with chloroform to yield a clarified lysate for downstream analysis.

Preparation of Bacteriophage Lysate for Generalized Transduction

Fonte: Chen, Z., et al. Produção de Partículas Semelhantes a Vírus PEGiladas Fluorescentes Induzidas por Conjugação por Química de Dibromomaleimida-dissulfeto. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o método para a expressão controlada da proteína do capsídeo do bacteriófago Qβ em E. coli modificada geneticamente. As proteínas resultantes se autoagrupam em partículas semelhantes a vírus, que são colhidas para bioconjugação subsequente.

Produção de Partículas Semelhantes a Vírus em E. coli Modificada

Este protocolo de cinco dias descreve todos os passos, equipamentos e software suplementar necessário para a criação e execução de um Escherichia coli endógena eficiente baseado TX-TL livre de células sistema de expressão a partir do zero. Com reagentes, o protocolo leva 8 horas ou menos para configurar uma reação, coletar e processar dados.

Protocolos para implementação de uma Escherichia coli Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

Este protocolo descreve o método, materiais, equipamentos e etapas para a preparação de baixo para cima de RNA e proteína susceptíveis de produzir células sintéticas. O compartimento aquoso interno das células sintéticas continha o lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de uma bicamada lipídica (ou seja, lipossomos estáveis), utilizando um método de transferência de emulsão de água no óleo.

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Interação Bacteriófago T4 e E. coli no Intestino Murino: Um Modelo Prototípico para Estudo da Dinâmica Hospedeiro-Bacteriófago In Vivo

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