Derivação livre de integração de células-tronco pluripotentes induzidas por seres humanos com Laminin 521 Matrix

O objetivo geral deste protocolo é derivar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos homogêneos. Este método pode ser usado para derivar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para muitos propósitos, incluindo modelagem de doenças, triagem de drogas ou para derivar células para ensaios pré-clínicos de terapia celular. A vantagem deste protocolo é que ele é robusto e gera células homogêneas que são mantidas em um sistema de cultura fácil de usar, livre de Xeno e totalmente definido quimicamente.

Como as células iPS humanas recapitulam o fundo genético do tecido doador e podem ser potencialmente diferenciadas em qualquer tipo de célula relevante para a doença, elas fornecem excelentes ferramentas para a modelagem de teses. A biópsia, a dissecção e a coleta de colônias são procedimentos complexos. Vê-los realizados com mãos experientes auxilia na compreensão dos procedimentos e facilita a repetição.

Demonstrando o procedimento hoje estarão Harriet RonnHolm e Kelly Day, duas técnicas de laboratório altamente experientes do iPS Core Facility no Karolinska Institutet. As amostras de biópsia de pele podem ser armazenadas em PBS mais 1% de penicilina estreptomicina por até 48 horas a quatro graus Celsius, mas devem ser processadas o mais rápido possível após serem obtidas. Transfira a biópsia para uma placa de 35 milímetros.

Mergulhe a biópsia de pele em uma placa de 35 milímetros com dois mililitros de etanol a 70% por 30 segundos. Adicione um mililitro de solução salina balanceada estéril de Hank suplementada com estreptomicina de 1% de penicilina a um novo prato de 35 milímetros e transfira a biópsia para o novo prato. Transfira a biópsia para um prato de quatro 35 milímetros preenchido com um mililitro de solução de dispase a 0,1% recém-preparada.

Usando bisturis cirúrgicos estéreis e fórceps, corte a biópsia de pele em pedaços de um a dois milímetros cúbicos. Transfira as peças de biópsia com a solução de dispase para um tubo de 15 mililitros e adicione mais dois mililitros de dispase. Lave o prato de 35 milímetros com um mililitro de solução de dispase e transfira a solução lavada para o tubo de 15 ml.

Incube a biópsia a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, adicione quatro mililitros de 0,1% de colagenase I ao tubo com as peças de biópsia e incube a 37 graus Celsius por quatro horas. Trinta minutos antes da semeadura das células, cubra um poço em uma placa de cultura de tecidos de seis poços com um mililitro de gelatina a 0,1% em DPBS.

Incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Após quatro horas de incubação com colagenase, centrifugar as células digeridas a 300 vezes g durante três minutos à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o digestor em dois mililitros de meio fibroblasto.

Remova a solução de gelatina da placa de cultura de tecidos de seis poços previamente preparada. Transfira a suspensão celular, incluindo quaisquer pedaços de tecido restantes, para a placa de seis poços. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em alta umidade.

Os fibroblastos estão prontos para serem passados para um frasco de cultura de tecidos T25 quando 80% confluentes. Os fibroblastos na passagem dois a quatro são ideais para reprogramação, pois a eficiência da reprogramação é geralmente maior para fibroblastos de passagem inferior. Aspirar o meio de cultura de células do balão e lavar as células com um mililitro de DPBS.

Aspire o DPBS e adicione um mililitro de 0,5% de tripsina EDTA. Incube a 37 graus Celsius por cinco minutos ou até que as células se desprendam. Adicione dois mililitros de meio fibroblasto, ressuspenda as células e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros.

Centrifugar a 300 vezes g durante três minutos à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em dois mililitros de meio fibroblasto. Depois de contar os fibroblastos usando um hemacitómetro, semeie cinco vezes 10 elevado às quartas células num poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços.

Incube células a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, como o vírus Sendai será tratado, continue o procedimento em um laboratório BSL-2 designado enquanto usa o equipamento de proteção individual apropriado. Aspirar o meio de cultura celular e adicionar 250 microlitros de solução do vírus Sendai.

Incube a placa a 37 graus Celsius. Um dia antes de colher as colônias, prepare placas de cultura de tecidos de 24 poços revestidas com LN-521. Pipete 250 microlitros de solução LN-521 em um poço de uma placa de 24 poços.

Sele a placa usando parafilme e incube a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, aspire a solução de LN-521 de um poço da placa de 24 poços e adicione 500 microlitros de E8 no poço. Recomenda-se o uso de uma rede de cabelo e máscara de procedimento durante a coleta de colônias sob o microscópio estereoscópico.

As colônias estão prontas para serem colhidas quando atingem um tamanho superior a um milímetro de diâmetro, exibem bordas afiadas e crescem em monocamadas homogêneas. Não escolha colônias com bordas difusas e grandes massas celulares heterogêneas não compactas. Corte cada colônia com um bisturi em pedaços menores em um padrão semelhante a uma grade.

Use uma pipeta de 200 microlitros para raspar mecanicamente as folhas de células do prato e, em seguida, transfira a folha para um poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços previamente revestida com LN-521. A seleção de colônias é fundamental para o sucesso deste protocolo. Escolher algumas colônias adicionais garantirá a fixação em número suficiente.

Deixe as células se ligarem sem alterar o meio E8 por 48 horas. Passe enzimaticamente as células quando as colônias atingem um tamanho superior a cinco milímetros. Aspire o meio de cultura celular das células e lave com 250 microlitros de DPBS.

Aspire o DPBS e adicione 250 microlitros de reagente de dissociação. Incube a 37 graus Celsius por três minutos. Observe que as células começaram a se arredondar.

Separe as células da placa enxaguando-as com reagente de dissociação. Adicione 500 microlitros de meio E8 a um tubo de 15 mililitros e transfira as células e o reagente de dissociação para o tubo. Centrifugar a 300 vezes g durante três minutos.

Aspirar o sobrenadante do tubo de 15 ml e ressuspender o sedimento celular em 500 microlitros de meio E8. Conte as células usando um hemacitômetro e semeie 2,5 a cinco vezes 10 para as quartas células em outro poço pré-revestido de LN-521 previamente preparado contendo 500 microlitros de meio E8 em temperatura ambiente. Adicionar o inibidor de ROCK a uma concentração final de 10 micromolares.

Incube as células a 37 graus Celsius. Usando este protocolo, colônias de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos emergem de fibroblastos transduzidos por volta do dia 12 após a transdução. As colônias estavam prontas para serem colhidas cerca de três a quatro semanas após a transdução.

As características preferidas incluem massas celulares compactas achatadas, crescimento como monocamadas homogêneas e bordas afiadas. Essas imagens de campo brilhante mostram uma linha celular iPS humana homogênea e totalmente reprogramada de passagem inicial em comparação com uma linha celular altamente heterogênea. A perda do vetor do vírus Sendai foi confirmada pela ausência de marcadores específicos do vetor do vírus Sendai em células iPS humanas na passagem 12, em contraste com as células iPS humanas na passagem três.

A coloração imunocitoquímica de células derivadas para os marcadores de pluripotência OCT4, SSEA-4 e NANOG produziu um resultado homogeneamente positivo. A expressão de mRNA de genes de pluripotência endógena foi demonstrada por PCR de transcriptase reversa. Culturas de células contendo células parcialmente reprogramadas que não expressavam fatores de pluripotência foram descartadas.

O potencial de diferenciação de células iPS humanas foi avaliado pela formação de corpos embrióides. A PCR em tempo real após 21 dias de diferenciação do corpo embrióide detectou a expressão de mRNA de marcadores específicos de endoderme, mesoderma e ectoderma, que confirmaram que as células iPS humanas derivadas eram capazes de se diferenciar para as três camadas germinativas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita com cerca de 22 horas de tempo prático durante um período de aproximadamente 16 semanas.

As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos derivados podem ser diferenciadas em qualquer tipo de célula do corpo humano adulto para responder a quaisquer perguntas relevantes para o seu campo de pesquisa. Depois de assistir a este vídeo, esperamos que você tenha uma boa compreensão de como executar as etapas necessárias para derivar células-tronco pluripotentes induzidas de biópsias de pele.