Name: Gravação eletrofisiológica de Drosophila Sensilla Tricoide em resposta aos odorantes de baixa volatilidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprenda a gravar neurônios olfativos de Drosophila usando odorantes de baixa volatilidade em sensílias tricoides. Este método permite estudar feromônios cuticulares e mecanismos de comunicação em insetos.

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Agradecemos a Ye Zhang pela ajuda com os traços da amostra e Tin Ki Tsang pela ajuda com as imagens. Este trabalho foi apoiado por um Prêmio de Carreira Antecipada da Fundação Ray Thomas Edwards e uma concessão NIH (R01DC015519) para concessões de C.-YS e NIH (R01DC009597 e R01DK092640) para JWW

1. Preparação do hardware para a gravação at4 <ol><li> Use um instrumento de extração de pipeta para preparar eletrodos com capilares de vidro de aluminossilicato (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Destrua ligeiramente a ponta do eletrodo de referência com um par de pinças finas para facilitar a inserção no clypeus da mosca ( ou seja, uma placa arredondada na frente da cabeça da mosca, acima das partes bucais). NOTA: os homens WT de 7 dias de idade (Berlim) foram utilizados neste estudo. Use a solução salina AHL 14 como o eletrólito para ambos os eletrodos. </li><li> Prepare 1 L de AHL através da mistura de 900 ml de água destilada, com 6,312 g de NaCl, 0,373 g de KCl, 0,337 g de NaHCO3, 0,1120 g de NaH 2 PO 4, 1,892 g de trealose ּ 2 H 2 O, 3,423 g de sacarose, 1,192 g de HEPES e 8,2 mL de 1 M de MgCl2. Usando água destilada, coloque o volume total até 1 L. Traga o pH para 7,4 usando 1 N de NaOH e esterilize a solução com umSistema de filtro a vácuo. Para armazenamento a longo prazo, mantenha as alíquotas de AHL a 4 ° C. NOTA: Entregas consistentes de ácido palmitoleico dependem da uniformidade entre cartuchos. É fundamental que cada cartucho seja montado de forma reprodutível. </li><li> Usando uma lâmina de barbear, remova 0,9 cm da ponta de uma dica de pipeta de 200 μL para criar a primeira seção do cartucho, medindo 4,1 cm; Consulte as dimensões detalhadas na Figura 1A . Use outra ponta de pipeta de 200 μL e remova 1,7 cm e 1,5 cm da ponta e da base, respectivamente, para criar a segunda seção de cartucho, medindo 1,8 cm ( Figura 1A ). Use uma régua para garantir a reprodutibilidade. </li><li> Use um perfurador de orifício ⅛ para cortar discos de papel de filtro. </li><li> Use fórceps para colocar um disco de papel de filtro na ponta da segunda seção do cartucho. Confirme visualmente que há uma abertura na ponta do cartucho através da qual o ar pode passar. </li><li> Conecte as seções de cartucho primeiro e segundo juntas, como mostrado na Figura 1A . Aumente a segunda seção do cartucho para baixo para facilitar o apontar quadrado para a preparação ( Figura 1B ). </li><li> Conecte o cartucho com o tubo de fornecimento de odor, que é montado em um micromanipulador. NOTA: Este design permite que o cartucho seja girado para fora para facilitar a troca ( Figura 1C ). </li><li> Defina o fluxo de ar humidificado constante para 2 L / min em um controlador de massa e o fluxo de odorantes para 500 mL / min em outro controlador de massa. </li><li> Usando o software (veja a Tabela de Materiais ), programe o procedimento para administrar um sopro de odor de 500 ms. </li></ol> 2. Preparação de Soluções de Odorante de Ácido Palmitoleico para Entrega NOTA: Or47b ORNs respondem tanto ao ácido cis como ao trans -palmitoleico. Como o ácido palmitoleico é instável em RT, os estoques são armazenados a -20 ° C e utilizados dentro de um mês após a abertura. O etanol é o solvente de escolha para o ácido palmitoleico. <ol><li> Use um misturador de vórtice para misturar completamente 10 μL de estoques de ácido cis- ou trans- palmitoleico ou diluições com 90 μL de etanol a 100% para diluições em série de dez vezes em microtubos de 1,7 mL. Prepare diluições frescas de ácido palmitoleico diariamente antes de experiências e use em um dia. NOTA: Para os odorantes que não são solúveis em etanol, recomenda-se um frasco de vidro para a preparação de diluições de odor com outros tipos de solventes orgânicos. </li><li> Usando uma micropipeta P10, aplique 5 μL de soluções de ácido cis- palmitolico das diluições desejadas no papel de filtro em cada cartucho correspondente. NOTA: A dose mais alta (10 -1 ) contém 450 μg do composto. Para as soluções de trans- palmititoleico, aplique 4,5 μL em vez disso, de modo que a dosagem mais alta (10 -1 ) também contém 450 μg de tEle compôs. </li><li> Para evaporar completamente o solvente, coloque os cartuchos de ácido palmitoleico em um dessecador de vácuo durante 1 h à RT e 7,59 mmHg de pressão. NOTA: Os cartuchos podem ser usados ​​por até 4 h na RT. </li></ol> 3. Preparação da Drosophila para o Acesso Prático ao At4 Sensilla para Gravação Eletrofisiológica In Vivo NOTA: As moscas WT (Berlim) são criadas em meio de farinha de milho padrão a 25 ° C em um ciclo luz-escuro de 12:12. Após a eclosão, as moscas são separadas por sexo em grupos de dez, pelo que são alojados em grupo até 7 d de idade. Or47b ORNs em moscas masculinas e femininas respondem ao ácido palmitoleico. Por simplicidade, apenas as moscas do sexo masculino são examinadas no estudo atual. <ol><li> Montar um slide de preparação de moscas: em uma lâmina de vidro, coloque uma lamínula de vidro (18 x 18 mm 2 ) em uma pequena quantidade de argila de modelagem, formando um ângulo de ~ 3 ° com a lâmina de vidro. Coloque fita dupla face no interior eDge do lamínula e na área do slide imediatamente abaixo. Substitua por fita fresca por cada dia de gravação ( Figura 2A ). </li><li> Use um aspirador de mosca 15 para coletar a mosca de interesse na tubulação e, em seguida, coloque uma ponta de pipeta de 200 μL sobre o final da tubulação. Simultaneamente, mova o tubo para a frente enquanto sopra ar para dentro do tubo para empurrar a mosca até o final da ponta da pipeta. Use uma lâmina de barbear para cortar logo abaixo do corpo da mosca e 2 cabeças acima da mosca. </li><li> Tampue a parte inferior da ponta da pipeta com argila de modelagem, empurrando a mosca para cima até que as antenas e o clypeus sejam expostos ( Figura 2B ). Para evitar matar a mosca, adicione apenas argila suficiente para expor as antenas e aristae, pois isso evita que o abdômen da mosca seja esmagado. Além disso, adicione argila lentamente e suavemente para evitar qualquer constrição súbita. Confirme se a mosca está viva procurando por antennalOu movimento de probóscis. </li><li> Use fórceps para manobrar a ponta da pipeta que abriga a mosca. Oriente a cabeça de modo que o clypeus esteja virado para a direita do observador. Ajuste a preparação ao longo da lamínula usando fórceps finos até o lado lateral da antena ficar de encontro à superfície do coxiforme gravado ( Figura 2B ). </li><li> Coloque uma haste de retenção no arista para proteger a antena da fita dupla face para evitar o movimento ( Figura 2B ). NOTA: A haste de retenção é puxada de um capilar de vidro de borosilicato com um extrator de pipeta e mantida em posição com argila de modelagem ( Figura 2A ). </li><li> Coloque a preparação no palco da plataforma ( Figura 2C ). Usando o microscópio, confirme que os trichoides são visíveis ao longo da borda distal-lateral do terceiro segmento da antena. NOTA: Idealmente, a sensilla deve ser claramente mostrada em silhueta em segundo plano, o que simplifica a sua<html> Identifica e facilita a gravação ( Figura 3 ). Nesta preparação, a maioria da sensilla trichóide acessível é do tipo at4. </li><li> Mantenha a preparação sob fluxo de ar humidificado constante (2 L / min) entregue através de um tubo de distribuição de ar separado a uma distância de cerca de 2 cm da preparação ( Figura 4 ), conforme descrito anteriormente 2 , 15 . </li></ol> 4. Gravação da atividade de At4 Sensillum a partir de Or47b ORNs nos Trichoids at4 em Resposta ao Ácido Palmitoleico <ol><li> Insira o eletrodo de referência no clypeus ( Figura 3A ). Para evitar danos nos tecidos, assegure-se de que o eletrodo esteja inserido logo abaixo da superfície, onde pode entrar em contato com a hemolinfa sob a cutícula, com um movimento rápido e suave. </li><li> Abaixe o eletrodo de gravação lentamente até que ele entre no mesmo plano de visão que o sensículo alvo (= &quot;Xfig&quot;&gt; Figura 3B). Gravar sob uma lente objetiva 50X. NOTA: A cutícula tricoide resistente necessita de inserir o eletrodo de gravação na base sensilar, cuja área mais ampla fornece um alvo maior que reduz a probabilidade de o eletrodo ser desviado ( Figura 3B , inserção). </li><li> Antes de aplicar estímulos de odor ao sensilum, observe os seguintes critérios de seleção; Qualquer trichoide que não atinja esses padrões deve ser rejeitado e outro sensilum escolhido em vez disso. <ol><li> Observe uma alta relação sinal-ruído (veja a Figura 3C para um exemplo). </li><li> Observe os picos identificáveis ​​dos neurônios at4A e at4C ( Figura 3C ). NOTA: De notar, a amplitude de espiga at4B parece muito semelhante a at4A 10 e não pode ser facilmente identificada sem estimulação de odor. </li><li> Observe que a taxa de disparo basal dos neurônios at4A éEm torno ou abaixo de 20 Hz. NOTA: Este critério é específico para at4A porque a taxa de disparo basal para o neurônio é maior que a das ORN básicas 2 . Um disparo basal muito maior indica que os neurônios podem ter sido danificados durante a inserção do eletrodo. </li></ol></li><li> Conecte o cartucho ao tubo de entrega de odorantes. Comece com o controle do solvente e depois os odorantes, de baixas a altas concentrações. Use o micromanipulador para manobrar o cartucho em direção à preparação, ao mesmo tempo que apontar o cartucho diretamente na cabeça da preparação. Confirme visualmente que o cartucho é apontado diretamente para a antena ( Figura 4 ) a partir de alguns milímetros de distância. NOTA: O objetivo é orientar a abertura do cartucho diretamente na antena e posicioná-lo próximo ao tecido alvo. </li><li> Certifique-se de que o cartucho odorante esteja separado do eletrodo de gravação à direita por 1 - 2 mm e do pré da moscaP desliza abaixo por aproximadamente 1 mm. NOTA: Na instalação descrita aqui, o cartucho odorante está estreitamente alinhado pelo eletrodo de gravação, o eletrodo de referência e o slide de preparação de moscas ( Figura 4 ). NOTA: Preste atenção na distância entre o cartucho e os eletrodos de gravação / referência. Recomenda-se uma distância de cerca de 4 mm 1 . O contato involuntário pode terminar o sinal e quebrar a ponta do eletrodo de gravação, danificando o neurônio atual e complicando outras gravações. NOTA: Considere a distância que separa o cartucho e o slide de preparação da mosca. Tocar a lamínula também pode desalojar o eletrodo de gravação para interromper a gravação. </li><li> Pressione &quot;Gravar&quot; no software de aquisição de dados para iniciar a gravação. NOTA: Para cada gravação de 10 s, um único pulso de odor de 500 ms é entregue diretamente à antena, conforme descrito no passo 1.9. </li><li> Após aplicação odorante,Retire cuidadosamente o cartucho antes de substituí-lo por um cartucho da próxima concentração mais alta. Continue até que toda a gama de dosagem seja obtida. NOTA: Recomenda-se que apenas um Or47b ORN seja gravado de cada mosca para evitar possíveis efeitos de adaptação. </li><li> Enxaguar completamente o eletrodo de gravação com água destilada depois de terminar a gravação durante o dia. </li><li> Analise e trate os dados usando o software de análise off-line comercialmente disponível. </li></ol>

<ol><li>Lin, H. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+modulation+of+pheromone+detection+enhances+male+courtship+success%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success.</a> Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).</li>
<li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li>
<li>Silbering, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+function+and+integrated+wiring+of+the+evolutionarily+distinct+Drosophila+olfactory+subsystems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems.</a> J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).</li>
<li>Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedicated+olfactory+neurons+mediating+attraction+behavior+to+ammonia+and+amines+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).</li>
<li>Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+class+of+olfactory+neurons+mediates+behavioural+responses+to+a+Drosophila+sex+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone.</a> Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).</li>
<li>Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors+and+neurons+for+fly+odors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Receptors and neurons for fly odors in Drosophila.</a> Curr Biol. 17, 606-612 (2007).</li>
<li>Schlief, M. L., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+processing+and+behavior+downstream+from+highly+selective+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).</li>
<li>Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Pheromone-sensitive+neurons+is+mediated+by+conformational+activation+of+pheromone-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein.</a> Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).</li>
<li>Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligands+for+pheromone-sensing+neurons+are+not+conformationally+activated+odorant+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins.</a> PLoS Biol. 11 (4), e1001546(2013).</li>
<li>Dweck, H. K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromones+mediating+copulation+and+attraction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+USA%22%5BJournal%5D)">Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila.</a> Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).</li>
<li>Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaporation+rates+and+vapor+pressures+of+the+even-numbered+C8-C18monocarboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+A%22%5BJournal%5D)">Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids.</a> J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).</li>
<li>Kimura, K. -I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+back+or+front%3A+the+courtship+position+is+a+matter+of+smell+and+sight+in+Drosophila+melanogaster+males%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males.</a> J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).</li>
<li>Grosjean, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+receptor+for+food-derived+odours+promotes+male+courtship+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila.</a> Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li>
<li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+sensillum+recordings+in+the+insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, descrevemos um procedimento pelo qual as respostas de Or47b ORNs ao ácido palmitoleico podem ser induzidas e registradas de forma robusta. Modificamos um método convencional de entrega de odor de longa distância 2 , 7 , 10 para solucionar o problema da entrega insuficiente de odorantes de feromonas. Abordamos a questão da baixa volatilidade odorante através da entrega do composto através de cartuchos odorantes, cuja abert...

<html> As ORN de Drosophila respondem a um grande número de odorantes, com extensões de cadeia de carbono amplamente variadas e uma variedade de grupos funcionais, incluindo ésteres, álcoois, cetonas, lactonas, aldeídos, terpenos, ácidos orgânicos, aminas, compostos de enxofre, heterocíclicos e aromáticos 2 , 3 . Os odorantes variados em suas características físico-químicas podem ter volatilidades marcadamente diferentes, indicadas pela pressão de vapor do composto. Notavelmente, os odorantes biologicamente relevantes para Drosophila melanogaster diferem enormemente em sua volatilidade. Por exemplo, as ORN Ir92a respondem à amônia 4 , que é altamente volátil, com uma pressão de vapor de 6,432 mmHg a 20 ° C. Em contraste, Or67d ORN responde a um feromônio masculino, cis- acetato de vccencenilo ( c VA) 5 , 6 , cuja pressão de vapor é de 43 mmHg a 20 ° C. Ove_content &quot;&gt; Estudar a resposta olfativa a odorantes de baixa volatilidade é particularmente desafiador com os métodos convencionais de entrega de odor, nos quais os odorantes são entregues através de um fluxo de ar transportador sobre uma distância relativamente longa ( ou seja, vários centímetros). Como tal, as respostas olfativas relatadas Para um determinado odorante de baixa volatilidade pode variar muito, dependendo do design do sistema de entrega de odor. Por exemplo, a resposta relatada de Or67d ORNs a uma dose elevada de c VA varia de ~ 40 7 -&gt; 200 picos / s 6 Além disso, a entrega ineficaz de c VA com métodos de entrega convencionais provavelmente é atribuída a resultados falso-negativos, levando à interpretação de que c VA por si só não é suficiente para ativar Or67d ORNs 8. Essa interpretação foi posteriormente desafiada por outro estudo usando um odor método de entrega de curto alcance 9. é, por conseguinte, imperaPara desenvolver um sistema robusto de entrega de odor para a apresentação efetiva de odorantes de baixa volatilidade. Recentemente, identificamos vários ácidos graxos cuticulares de cadeia longa como ligandos para Or47b ORNs. Eles estão alojados no tipo 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Entre os odorantes de ácidos graxos de cadeia longa, descobrimos que o ácido palmitoleico funciona como um feromônio afrodisíaco que promove o namoro masculino ativando Or47b ORNs 1 . No entanto, em outro estudo usando um método de entrega de odor convencional, o laurate de metilo mostrou provocar respostas de Or47b ORNs, enquanto que o ácido palmitoleico não provocou resposta quando apresentado a partir da mesma distância 10 . Em comparação com c VA, os ácidos gordurosos de cadeia longa são ainda menos voláteis, com pressões de vapor inferiores a 0,001 mmHg a 25 ° C 11 . A baixa volatilidade intrínseca de odorantes de ácidos graxos de cadeia longa, que impede a apresentação eficiente à antena viaSistemas convencionais de entrega de odor, provavelmente representaram os resultados falso-negativos 10 . Esta inconsistência destaca a inadequação dos sistemas convencionais de entrega de odor na apresentação de odorantes de baixa volatilidade. Foi anteriormente demonstrado que a entrega efetiva de odores cuticulares de mosca requer proximidade próxima entre a fonte de odor e o tecido alvo 6 . Assim, para caracterizar completamente os efeitos das feromonas biologicamente ativas, imitando a distância a partir da qual provavelmente são encontradas pelas moscas da fruta na natureza 12 , 13 , concordamos que a distância mínima deve ser dada prioridade em nosso procedimento. Nosso método possui outras vantagens, incluindo a compatibilidade com plataformas e técnicas de eletrofisiologia padrão. Configurações de plataforma pré-existentes requerem modificações mínimas para acomodar este protocolo, e a maioria das etapas de SSR requerem apenas pequenos ajustes. esteTorna nossa técnica prontamente acessível para pesquisadores experientes em SSR. Além disso, nossa técnica permite a apresentação de odorantes de baixa volatilidade com início e deslocamento nítidos, correlacionando o estímulo com a resposta neuronal. Finalmente, o layout de hardware facilita trocas rápidas entre cartuchos odorantes, agilizando a coleta de dados em uma faixa de dosagem desejada. Começamos por revisar a preparação de eletrodos de referência e de gravação, solução de Hemolinflamadinha Adulto (AHL), cartuchos de entrega de odorantes e o correspondente olfatômetro. Em seguida, discutimos a preparação das soluções de odorantes com ácido palmitoleico, seguido da preparação da mosca para gravação. Continuamos a considerar os critérios para a seleção de um sensil trichoid para registrar e examinar mais de perto o posicionamento do cartucho odorante antes de apresentar dados representativos adquiridos usando este método. Finalmente, concluimos explorando aplicações úteis desta técnicaAlguns problemas encontrados e suas soluções.

<table><tbody><tr><td><forte>Configuração de preparação e Materiais Diversos</td>Instrumento Extrator de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas&nbsp;</td><td>Sutter Instruments Novato CA USA</td><td>P97</td><td>Extrator de Pipetas</td></tr><tr><td>Capilares de Vidro Borosilicato</td><td>World Precision Instruments Sarasota FL EUA</td><td>1B100F-4</td><td>para fazer hastes de retenção</td></tr><tr><td>Capilares de Vidro de Aluminossilicato&nbsp;</td><td>Sutter Instruments Novato, CA, EUA</td><td>AF100-64-10</td><td>para fazer eletrodos</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio Superfrost</td><td>Fisher Scientific Pittsburgh, PA, EUA</td><td>12-550-143</td><td>para estação de preparação para moscas</td></tr><tr><td>Fita dupla face permanente</td><td>Scotch St. Paul MN USA</td><td>NA</td><td>para estação de preparação para moscas</td></tr><tr><td>Microscópio vertical</td><td>Olympus Shinjuku Tóquio Japão</td><td>BX51</td><td>para equipamento de gravação</td></tr><tr><td>Plastalina massa de modelar</td><td>Van Aken North Charleston SC EUA</td><td>B0019QZMQQ</td><td>para estação de preparação e para estabilizar a haste de retenção</td></tr><tr><td>Unidade de Filtro Descartável Estéril de Fluxo Rápido com Membrana SFCA, 0,45 mm</td><td>Nalgene Rochester NY EUA#</td><td>156-4045</td><td>para esterilizar solução AHL</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td>Número do Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Cartridge Materials</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Ponta de pipeta L</td><td>VWR Radnor PA USA</td><td>53508-810</td><td>para fazer cartuchos de odor e preparação de moscas</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Whatman Maidstone Kent UK</td><td>740-E</td><td>para fazer cartuchos de odor&nbsp;</td></tr><tr><td>Dessecador a Vácuo</td><td>Cole-Parmer Vernon Hills IL USA</td><td>VX-06514-30</td><td>para vaporizar solvente de etanol</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Materiais Odorantes</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>cis-palmitoleic acid</td><td>Cayman Chemical Ann Arbor MI USA</td><td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td><td>Or47b odorante</td></tr><tr><td>ácido trans-palmitoleico</td><td>Cayman Chemical Ann Arbor MI USA</td><td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td><td>Or47b odorante</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Spectrum Chemical MFG.&nbsp; New Brunswick NJ USA</td><td>E1028-500MLGL</td><td>para diluir ácido palmitoleico&nbsp;</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Materiais de Configuração do Rig</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Micromanipulador de cartucho </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odorant</td><td>Siskiyou Grants Pass OR USA</td><td>MX130R</td><td>para posicionar o olfatômetro</td></tr><tr><td>Software Flow Vision&nbsp;</td><td>Alicat Tuscon, AZ, EUA</td><td>, FLOWVISIONSC</td>, <td>software para controlar a vazão</td></tr><tr><td>Controlador de Massa</td><td>Alicat Tuscon, AZ, EUA</td>, <td>MC-2SLPM-D</td><td>para controlar a vazão de ar umidificado</td></tr><tr><td>Controlador de Massa</td><td>Alicat Tuscon, AZ, EUA</td>, <td>MC-500SCCM-D</td><td>para controlar a vazão para estimulação de odores,</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices Sunnyvale, CA, EUA</td>, <td>Ver. 10.4</td><td>Software de aquisição de</td></tr><tr><td>dados Tubo de entrega de ar</td><td>Ace Glass Vineland NJ USA</td><td>8802-936&nbsp;</td><td>para fornecer ar umidificado</td></tr><tr><td>Lente objetiva 50X&nbsp;</td><td>Olympus Shinjuku Tóquio Japão</td><td>LMPLFL50X</td><td>equipamento de gravação</td></tr><tr><td>Clampfit 10</td><td>Molecular Devices Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>software para análise de picos&nbsp;</td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>WaveMetrics Lake Oswego OR USA</td><td>Ver. 6.37</td><td>software para análise de dados&nbsp;</td></tr><tr><td>Monitor de Áudio</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXB-AUDIS-08B</td><td>Relata auditivamente picos individuais</td></tr><tr><td>Amplificador Extracelular</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXT-02F</td><td>para aumentar a amplitude dos sinais elétricos</td></tr><tr><td>Controlador de Válvula</td><td>Warner Instruments&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>VC-8</td><td>para controlar a abertura da válvula para estimulação de odor</td></tr><tr><td>Eletrodo de Gravação Micromanipulador</td><td>Sutter Instruments Novato CA USA</td><td>MP-285</td><td>para posicionar o eletrodo de gravação</td></tr><tr><td>Amplificador de Headstage</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA</td><td>EQ-16.0008</td><td>para aumentar a amplitude dos sinais elétricos</td></tr><tr><td>Osciloscópio</td><td>Tektronix Beaverton OU EUA</td><td>TDS2000C</td><td>Relatório visual de picos individuais</td></tr></tbody></table>

gravação eletrofisiológica de<em&gt; drosophila</em&gt; sensilla tricoide em resposta aos odorantes de baixa volatilidade

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Os insetos dependem do seu odor do sono para orientar uma ampla gama de comportamentos que são críticos para sua sobrevivência, como busca de alimentos, evasão de predadores, oviposição e acasalamento. Muitos produtos químicos de volatilidades variáveis ​​foram identificados como odorantes naturais que ativam os neurônios de receptores olfatórios de insetos (ORNs). No entanto, o estudo das respostas olfativas a odorantes de baixa volatilidade foi dificultado pela incapacidade de apresentar efetivamente tais estímulos usando métodos convencionais de entrega de odor. Aqui, descrevemos um procedimento que permite a apresentação efetiva de odorantes de baixa volatilidade para a Gravação Single-Sensillum in vivo (SSR). Ao minimizar a distância entre a fonte de odor e o tecido alvo, este método permite a aplicação de odorantes biologicamente salientes, mas até então inacessíveis, incluindo o ácido palmitoleico, um feromônio estimulante com efeito demonstrado sobre ORN envolvidos no namoro e comportamento de acasalamento 1 .Nosso procedimento permite, assim, uma nova via para ensaiar uma série de odorantes de baixa volatilidade para o estudo da olfação de insetos e da comunicação de feromonas.

Nossa técnica foi aplicada com sucesso para determinar a eficácia relativa dos isómeros trans ( Figura 5A ) versus cis ( Figura 5B ) do ácido palmitoleico. Nossos dados representativos demonstram que o ácido trans -palmitoleico é um ligando mais efetivo para Or47b ORNs quando comparado à isoforma cis ( Figura 5C ). Um único neurônio foi registrado de cada mosca, c...

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar como apresentar odorantes de baixa volatilidade para a gravação de sensibilidade única a partir de neurônios receptores olfativos de Drosophila que respondem a feromonas cuticulares de cadeia longa.

Gravação eletrofisiológica de<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensilla Tricoide em resposta aos odorantes de baixa volatilidade

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

O objetivo geral desta técnica é apresentar odores de baixa volatilidade de forma eficaz aos neurônios receptores olfativos e drosófilas para registro eletrofisiológico. Esses neurônios estão alojados na sensila tricóide e respondem a feromônios cuticulares de cadeia longa. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da comunicação de feromônios de insetos, fornecendo uma técnica aprimorada de entrega de odor.A principal vantagem desta técnica é que ela permite que odores que antes eram inacessíveis devido à sua baixa volatilidade sejam efetivamente apresentados durante a gravação in vivo. Especificamente, os feromônios são apresentados a distâncias próximas que simulam o alcance entre cortejar machos e fêmeas-alvo. A preparação do componente do cartucho de entrega de odor para gravações AT4 começa com a remoção de 0,9 centímetros da extremidade estreita de uma ponta de pipeta de 200 microlitros.Em seguida, a partir de uma segunda ponta de pipeta, remova 1,7 centímetros da extremidade estreita e 1,5 centímetros da extremidade larga para fazer um comprimento de 1,8 centímetros. Em seguida, use uma pinça para colocar um disco de papel de filtro de 1/8 de polegada de diâmetro na ponta da seção de 1,8 centímetro. Deixe uma pequena abertura por onde o ar possa passar.Em seguida, prenda as seções da pipeta junto com a seção menor inclinada para baixo para apontar para a preparação. Agora use um P10 para aplicar o odorante na diluição desejada ao papel de filtro. Em seguida, para evaporar o solvente, deixe os cartuchos carregados em um dessecador a vácuo por uma hora.Primeiro, monte uma lâmina de preparação de moscas. Em uma lâmina de vidro, prenda uma lamínula de vidro com massa de modelar, para criar um ângulo de cerca de três graus entre a lâmina e a lamínula. Em seguida, prenda a fita dupla-face em dois lugares, a borda interna da lamínula e a corrediça imediatamente abaixo da lamínula.Sempre use fita nova. Agora colete a mosca de interesse em um tubo aspirador. Em seguida, coloque uma ponta de pipeta de 200 microlitros sobre a extremidade do tubo e, simultaneamente, mova o tubo enquanto sopra, para empurrar a mosca para a extremidade da ponta da pipeta.Em seguida, use uma lâmina de barbear para cortar a ponta logo abaixo do corpo da mosca. Agora carregue cuidadosamente a argila de moldagem na extremidade larga da ponta para forçar a cabeça da mosca na abertura menor. Assim que ambas as antenas estiverem expostas, pare de embalar em argila.Agora use uma pinça para posicionar a preparação no slide. Posicione o clipeus voltado horizontalmente com o lado lateral da antena contra a superfície da lamínula com fita adesiva. Em seguida, coloque a haste de retenção no arista para prender a antena à fita.Em seguida, coloque a preparação no palco do equipamento. Confirme se os tricóides são visíveis ao longo da borda lateral distal do terceiro segmento da antena. A sensila deve ser claramente recortada contra o fundo.Mantenha a preparação sob um fluxo de ar umidificado constante fornecido por meio de um tubo separado a uma distância de cerca de dois centímetros. Para fazer gravações, insira o eletrodo de referência no clipeu usando um movimento rápido e suave. Coloque-o logo abaixo da cutícula, onde estará em contato com a hemolinfa.Em seguida, abaixe lentamente o eletrodo de gravação até que ele entre no mesmo plano de view que o sensillum alvo. Em seguida, insira o eletrodo de registro na base sensilar. Antes de prosseguir, certifique-se de que haja uma alta relação sinal-ruído, com picos identificáveis de neurônios AT4-A e AT4-C.Os neurônios AT4-A não devem disparar mais rápido do que 20 hertz. Agora conecte o cartucho ao tubo de entrega de odor. Comece com o controle do solvente e progrida em direção à maior concentração de odor.Neste caso, um cartucho de ácido palmitoleico é conectado. Em seguida, use o micromanipulador para manobrar o cartucho em direção à preparação enquanto o aponta para a cabeça. Posicione a ponta do cartucho apontando diretamente para a antena a uma distância de cerca de quatro milímetros.O cartucho também deve estar cerca de um milímetro acima da corrediça. O posicionamento preciso do cartucho em relação à preparação é a etapa mais crítica deste procedimento. Respostas neuronais consistentes dependem da posição reprodutível do cartucho em todas as tentativas.O cartucho pode estar próximo dos eletrodos e da lâmina. Idealmente, deve estar a pelo menos quatro milímetros de cada eletrodo. Para estimulação, defina o controlador de fluxo de odor para rajadas de 500 milissegundos e use uma taxa de fluxo de 500 mililitros por minuto.Para cada explosão de estímulo, registre a atividade elétrica por 10 segundos. Após uma aplicação de odor, retraia cuidadosamente o cartucho antes de substituí-lo por um cartucho contendo a próxima concentração mais alta. Depois de fazer todas as gravações do dia, enxágue bem o eletrodo de gravação com água destilada.Usando os métodos descritos em moscas selvagens de Berlim machos de sete dias de idade, a eficácia relativa do ácido palmitoleico trans e cis foi comparada. O trans-palmitoleico foi um estimulante mais forte dos neurônios receptores olfativos de Or47b. De cada mosca, apenas um único neurônio foi registrado.A distância entre a abertura do cartucho de odor e a cabeça da mosca teve uma influência significativa nas respostas neuronais. A quatro milímetros, havia muito mais espinhos disparados em resposta ao ácido palmitoleico. A uma distância de 11 milímetros, quase não houve respostas observáveis dos neurônios O47b.A apresentação de curto alcance do ácido palmitoleico foi muito importante para estudar seus efeitos como odorante. Esperamos que, depois de assistir a este vídeo, você tenha uma compreensão clara de como apresentar ácido palmitoleico ou outros odores de baixa volatilidade em seus neurônios receptores olfativos de drosophila durante a gravação in vivo de um único sensillum. Uma vez que essa técnica é dominada, o registro de uma curva de dosagem inteira de uma única mosca pode ser alcançado em cerca de 20 minutos.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do olfato de insetos explorarem a neurofisiologia e os mecanismos de transdução de sinal para detecção de feromônios.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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