Avaliação da densidade de sinapse em fatias Hippocampal cérebro de roedor

O objetivo geral deste protocolo de imunocoloração é avaliar a densidade sináptica em fatias cerebrais ex vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência e é útil ao estudar as mudanças na densidade das sinapses, como observado em doenças neurodegenerativas. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma estimativa semiquantitativa da densidade de sinapses, que pode ser comparada entre as condições experimentais preparadas ao mesmo tempo.

Comece colocando o cérebro do rato em uma placa de Petri. Em seguida, remova o cerebelo e uma pequena seção do córtex frontal com um bisturi, antes de hemisseccionar na linha média do cérebro. Vire um hemisfério para o lado que acabou de ser cortado e cole-o no palco de um vibratome.

Despeje ACSF gelado na câmara do micrótomo e oxigene a solução. Corte seções de 200 a 300 mícrons de espessura de toda a região de interesse. Para o hipocampo, aproximadamente três a quatro fatias devem ser obtidas por hemisfério.

Use uma pipeta de plástico Pasteur para transferir as fatias para uma câmara com temperatura controlada submersa em ACSF oxigenado. Mantenha a 34 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos, transfira as fatias para uma placa de 24 poços contendo 4% de paraformaldeído com 4% de sacarose e fixe por 20 minutos a uma hora em temperatura ambiente.

Após a fixação, lave as fatias três vezes em 1x PBS por 10 minutos de cada vez. Para iniciar a coloração imunofluorescente, substitua o PBS nos poços de fatia por tampão de bloqueio e permeabilização e incube em temperatura ambiente por quatro a seis horas no agitador. No final da etapa de bloqueio, dilua o anticorpo em vGlut1 de um a 2.000 no tampão de bloqueio e permeabilização.

Observe que essa diluição pode diferir dependendo da empresa e do lote do anticorpo usado. Incube as fatias na solução primária de anticorpos durante a noite a quatro graus Celsius. Use uma plataforma agitada com movimento vigoroso.

A distribuição uniforme dos anticorpos primários e secundários é importante para uma coloração ideal. Em nossa experiência, a agitação vigorosa permite a melhor penetração de anticorpos. Após a incubação em anticorpo primário, lave as fatias três vezes em PBS por 10 minutos de cada vez, como antes.

Durante a última lavagem, diluir os anticorpos secundários apropriados de um a 500 no tampão de bloqueio. Em seguida, incube as fatias nesta solução por duas a três horas em temperatura ambiente. Certifique-se de que as fatias estejam protegidas da luz, pois os anticorpos secundários são sensíveis à luz.

Depois de lavar as fatias, como antes, use um pincel para remover cuidadosamente as fatias da placa de 24 poços e coloque-as uniformemente em lâminas de vidro pré-rotuladas. Adicione uma gota de meio de montagem em cima de cada fatia. Em seguida, coloque delicadamente uma lamínula de vidro em cima das fatias, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas de ar.

Proteja da luz e deixe as lâminas secarem por no mínimo três a quatro dias em temperatura ambiente. Armazene as lâminas a quatro graus Celsius a curto prazo. Mas para armazenamento de longo prazo, mantenha-os a menos 20 graus Celsius.

Comece usando uma objetiva de 10x ou 20x para identificar a região do hipocampo a ser fotografada, neste caso, as sinapses entre os neurônios piramidais CA1 e os axônios colaterais de Schaffer. Mude para uma objetiva de imersão em óleo de 40x ou 63x e certifique-se de que a anatomia da fatia esteja intacta, identificando neurites contínuos e uma estrutura organizada. Use um marcador neuronal, como MAP2, como referência.

Ajuste as configurações de cada canal para obter o sinal ideal e contraste com uma resolução de 1.024 por 1.024 pixels. Defina a intensidade de cada laser para evitar a saturação de pixels. Avalie a profundidade onde a coloração é uniforme e, em seguida, configure o software para adquirir pilhas de imagens de pelo menos oito planos equidistantes de 250 nanômetros.

Em seguida, pegue três pilhas de imagens representativas adjacentes da mesma área de interesse por fatia. Repetir a aquisição em pelo menos três fatias por condição e de seis a oito animais por grupo de tratamento. As sinapses excitatórias podem ser identificadas pela colocalização entre vGlut1 e PSD95, conforme indicado pelas setas brancas na imagem de maior ampliação.

O bloqueio da sinalização Wnt no hipocampo adulto induzindo o antagonista Wnt Dkk1 desencadeia a perda de sinapse excitatória, especificamente no estrato radiato CA1. A porcentagem de sinapses excitatórias entre camundongos controle e iDkk1 foi quantificada e considerada significativamente menor em animais transgênicos iDkk1. As sinapses inibitórias podem ser identificadas pela colocalização entre vGat e Gefirina.

A porcentagem de sinapses inibitórias entre camundongos controle e iDkk1 foi quantificada e nenhuma diferença significativa foi detectada. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de tomar o máximo de cuidado possível com as fatias. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a densidade sináptica em fatias cerebrais ex vivo.