Fourier-com base em análise de difração de viver Caenorhabditis elegans
13 de setembro de 2017
Este manuscrito descreve como distinguir diferentes nemátodes usando assinaturas de difração consideravelmente-campo. Comparamos a locomoção de 139 tipo selvagem e 108 "rolo" c. elegans por uma média de frequências associadas a assinatura de difração de Fraunhofer temporal em um único local usando um laser de onda contínua.
O objetivo geral desta análise de difração baseada em fourier é caracterizar a locomoção de C elegans em tempo real à medida que a espécie se move livremente em um espaço tridimensional. Este método pode responder a questões-chave no campo da neurobiologia, descrevendo as respostas das espécies a diferentes densidades de mutantes de solução ou locomotores. Este método serve como uma linha de base para a análise de quatro espécies microscópicas.
Tem a vantagem de que cada espécie microscópica terá seu próprio espectro de fourier. Embora esse método possa fornecer informações sobre a locomoção de C elegans, ele também pode ser aplicado a outros microrganismos. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque encontrar o nematóide na cubeta, sob o feixe de laser, pode ser um desafio.
Tivemos a ideia desse método pela primeira vez na tentativa de aprender sobre o comportamento de natação a partir do sinal de difração temporal, em si, um sinal ruidoso. Para começar, prenda um laser de néon de hélio próximo ao canto esquerdo traseiro da bancada óptica e conecte-o a uma fonte de alimentação. Coloque um filtro de densidade neutra entre o laser e o local da amostra, de modo que o feixe de laser percorra o filtro antes de atingir a amostra.
Usando dois espelhos de direção de alumínio de superfície frontal, construa um periscópio prendendo o primeiro espelho após o filtro de densidade neutra. Em seguida, prenda o segundo espelho cerca de 10 centímetros abaixo do primeiro espelho para dar espaço para direcionar o feixe de laser. Insira uma cubeta entre os espelhos e alinhe o feixe de laser e a cubeta de modo que o feixe de laser viaje verticalmente através da cubeta.
Em seguida, prenda o fotodiodo diretamente em frente ao segundo espelho para que seu sensor fique voltado para o espelho. Em seguida, coloque uma cubeta cheia de água em um suporte. Ajuste a altura do suporte e os ângulos dos espelhos um e dois para que o feixe de laser viaje através da cubeta e seja direcionado para perto, mas não diretamente para o fotodiodo.
Use uma alavanca para garantir que o suporte forme uma superfície nivelada para a cubeta. Se o suporte não estiver nivelado, faça os ajustes apropriados até nivelar. Por fim, conecte o fotodiodo ao osciloscópio digital usando o cabo USB fornecido e conecte-o ao computador.
Carregue o software do osciloscópio e defina a taxa de amostragem para pelo menos oito hertz para resolver o ciclo de destruição do worm o suficiente. Use um palito de fio de platina fino e achatado para transferir quatro nematóides adultos para uma placa de Petri cheia de ágar NGM fresca. Em seguida, remova uma cubeta de plástico descartável de sua embalagem, tomando cuidado para tocar apenas na cubeta nas laterais estriadas.
Em seguida, use uma micropipeta para pipetar água destilada em uma cubeta até que a cubeta esteja aproximadamente 80% cheia de água destilada. Coloque a placa de Petri contendo os C elegans sob uma luneta de dissecação. Em seguida, use a palheta de platina para remover um C elegans maduro da placa de Petri e mergulhe a palheta na cubeta.
Mova a picareta em círculos para desalojar o nematóide, se necessário. Manuseie os nematóides com cuidado e não agite a cubeta. Agitar a cubeta pode fazer com que os vermes parem de responder.
Para evitar a formação de bolhas na cubeta, encha a cubeta com água destilada até que ela se mova levemente sobre a parte superior da cubeta. Em seguida, encha a tampa com água e coloque-a rapidamente na cubeta. Usando papel para lentes, remova quaisquer gotas de água que possam ter derramado na cubeta.
Além disso, use papel para lentes para remover quaisquer pequenas gotículas restantes. Ligue o laser de néon de hélio e ajuste a configuração de frequência para que produza um feixe vermelho. Em seguida, ligue o sensor.
Segure a cubeta em seus lados estriados e incline-a suavemente até que o nematóide esteja aproximadamente no centro da cubeta. Em seguida, coloque a cubeta no suporte do sistema óptico, centralizando o verme dentro do feixe de laser que passa do espelho um para o espelho dois. Em seguida, coloque o fotodiodo no padrão de difração de forma que a localização do fotodiodo e o máximo central do padrão de difração não coincidam.
Em seguida, gire os filtros de densidade neutra para que haja uma saída de tensão notável do fotodiodo. Certifique-se de limitar a luz usando o filtro de densidade neutra, para evitar a saturação do fotodiodo. Uma linha plana indica supersaturação ou falta de intensidade.
Assim que o padrão de difração em movimento estiver visível, colete dados com o fotodiodo clicando no botão Iniciar do software, controlando o osciloscópio enquanto monitora o movimento do worm. Continue fazendo medições até que o verme saia do feixe de laser e o padrão de difração desapareça. Se a cubeta estiver arranhada, descarte-a e o verme e comece de novo.
Após cerca de 20 segundos, interrompa o processo de coleta de dados clicando no botão de parada no software do osciloscópio. Salve os dados de cada teste em valor separado por vírgula ou formato de texto. Colete pelo menos 50 conjuntos de dados para cada fenótipo e use de oito a 10 animais por teste.
Exemplos de movimento sequencial de vermes modelados e padrões de difração correspondentes são mostrados aqui. Os padrões de difração modelados se assemelham qualitativamente aos padrões experimentais e indicam que a simulação modelou com sucesso o nematóide. Além disso, a assinatura de difração temporal do rolo e do tipo selvagem c elegans pode ser mostrada quantitativamente.
Como visto aqui, cada nematóide se debate em diferentes taxas e amplitudes. As transformadas digitais médias de Fourier permitem que o nematóide seja identificado pela amplitude de seu espectro de frequência de difração. O espectro de vermes do tipo selvagem é dominado por frequências mais baixas do que o espectro de movimento do rolo.
Aqui está um exemplo da oscilação w que pode ser pensada como dois movimentos opostos do mar. Em contraste, o rolo formará principalmente um c para um lado e terá a seguinte aparência. Ao examinar as frequências, o movimento w é mais complexo, revelando mais baixas frequências secundárias do que o movimento c.
Uma vez dominado, um conjunto de dados pode ser coletado em cerca de dois minutos se a técnica for executada corretamente. Demora cerca de 20 a 30 minutos para configurar a óptica para uma série de conjuntos de dados. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear os C elegans com cuidado, de modo a preservar a integridade de sua locomoção.
Seguindo este procedimento, podemos aplicar outros métodos, como uma reconstrução de trator e análise não linear, para aprender mais sobre o movimento de C elegans. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores em neurobiologia estudarem com mais profundidade mutantes locomotores em C elegans. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar padrões de difração para nematóides vivos e como analisá-los.
Não se esqueça de que trabalhar com lasers pode ser extremamente perigoso e tomar precauções, como não fazer com que os lasers viajem ao nível dos olhos, devem ser tomadas durante a execução do procedimento.
Visão Geral
Este estudo apresenta um método de análise de difração baseado em Fourier para caracterizar a locomoção de C. elegans em tempo real. Ao analisar as assinaturas temporais de difração de Fraunhofer, os pesquisadores podem distinguir entre fenótipos do tipo selvagem e fenótipos do tipo "Roller" com base em seus padrões de locomoção.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurobiologia
- Biofísica
- Microscopia
Contexto
- C. elegans atua como organismo modelo para o estudo da locomoção e da neurobiologia.
- Cada espécie microscópica possui um espectro de Fourier único que pode fornecer informações sobre seu comportamento.
- A análise da locomoção pode ajudar a compreender as respostas das espécies a mudanças ambientais.
- Existem desafios na localização de nematoides dentro da configuração experimental.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para análise em tempo real da locomoção de C. elegans.
- Distinguir entre diferentes fenótipos com base em seus padrões de locomoção.
- Fornecer uma referência para análise de Fourier aplicável a diversas espécies microscópicas.
Métodos Utilizados
- Configuração de um laser de hélio-neônio e sistema óptico para análise de difração.
- Uso de um fotodiodo e osciloscópio digital para coletar dados sobre o movimento de nematoides.
- Preparação de amostras de C. elegans em um ambiente controlado.
- Coleta e análise de dados de padrões de difração para identificar características da locomoção.
Resultados Principais
- Padrões de difração distintos foram observados para o tipo selvagem e C. elegans Roller.
- Transformadas digitais médias de Fourier revelaram diferenças nas frequências de locomoção.
- O método modelou com sucesso o movimento dos nematódeos e forneceu insights quantitativos.
- A coleta de dados foi eficiente, permitindo múltiplos ensaios em um curto período de tempo.
Conclusões
- A análise de difração baseada em Fourier é eficaz para estudar a locomoção de C. elegans.
- Este método pode ser adaptado para outros organismos microscópicos.
- Compreender os padrões de locomoção pode contribuir para a pesquisa neurobiológica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a caracterização em tempo real e sem marcadores da locomoção de microrganismos por meio da análise de Fourier de assinaturas de difração, fornecendo uma leitura fenotípica quantitativa para aplicações em neurobiologia e biofísica. Ele permite a validação de alvos ao associar mutações genéticas a saídas comportamentais mensuráveis, facilitando a redução de riscos mecanicistas no estágio inicial de descoberta. A abordagem oferece uma plataforma escalável e reutilizável para triagem de fenótipos locomotores em espécies microscópicas, aumentando a confiança preditiva em sistemas modelo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da correlação entre perturbações genéticas e espectros distintos de frequência de locomoção.
- Valor Operacional: Oferece triagem fenotípica em tempo real e sem marcadores, sem necessidade de marcadores fluorescentes ou repórteres genéticos.
- Valor Preditivo: Distingue fenótipos selvagens e mutantes por meio de padrões de difração transformados por Fourier, apoiando a redução de riscos biológicos de alvos locomotores.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera saídas quantitativas e reprodutíveis no domínio da frequência, adequadas para triagem fenotípica de alto conteúdo.
- Escalabilidade: Permite a coleta de mais de 50 conjuntos de dados por fenótipo utilizando 8–10 animais por ensaio, possibilitando robustez estatística.
- Reutilização da plataforma: Serve como base para análise de Fourier aplicável a qualquer espécie microscópica com assinaturas espectrais únicas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Relaciona fenótipos neurocomportamentais em C. elegans com possíveis déficits locomotores relevantes para doenças em modelos superiores.
- Redução de Riscos Mecanicistas: Utiliza espectros de Fourier médios para validar modelos computacionais da dinâmica da forma do verme, aumentando a confiança nas associações fenótipo-genótipo.
- Apoio à Decisão: Permite decisões de avançar/não avançar com base na divergência espectral entre linhagens, reduzindo a ambiguidade na validação funcional.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial, posicionando a caracterização fenotípica após a manipulação genética e antes da identificação de compostos líderes, ao fornecer pontos finais locomotores quantificáveis para a validação de vias.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao converter comportamentos complexos de natação em padrões de frequência analisáveis por meio da transformação de Fourier.
- Triagem: Fornece leituras padronizadas baseadas em difração que permitem a comparação da atividade locomotora entre diferentes origens genéticas ou tratamentos com compostos.
- Análise: Gera espectros de frequência e amplitude que possibilitam a discriminação entre linhagens fenotípicas com base nos modos de oscilação predominantes.
- Pesquisa Translacional: Conecta métricas microscópicas de locomoção à função neurobiológica, apoiando a extrapolação para modelos pré-clínicos de distúrbios do movimento.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma óptica transferível para triagem fenotípica baseada em Fourier em diversos modelos de micro-organismos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo por meio da fenotipagem objetiva no domínio da frequência da locomoção.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de uma configuração óptica padronizada e normalização do sinal (divisão pela intensidade máxima).
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir fenotipagem rápida (2 minutos por conjunto de dados) após configuração inicial de 20–30 minutos.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização ajustada ao risco ao quantificar a divergência fenotípica entre linhagens selvagens e mutantes.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em alinhamento óptico e segurança com laser para evitar saturação e garantir a formação adequada do padrão de difração.
- Depende de um laser de hélio-neônio estável, fotodiodo e osciloscópio digital com taxa de amostragem ≥8 Hz para resolver as frequências de locomoção.
- Necessita manipulação cuidadosa da amostra para evitar a formação de bolhas ou estresse nos nematoides, o que poderia distorcer as assinaturas temporais.
- Envolve a transferência manual de nematoides utilizando uma alça de fio de platina, o que representa um gargalo para a adaptação de alto rendimento.
- Limitado a organismos pequenos o suficiente para permanecerem suspensos no trajeto do laser sem sedimentação ou efeitos de parede durante a medição.
