Name: Estabelecimento de um mímico valioso de doença de Alzheimer em modelo Animal de rato por injeção Intracerebroventricular de proteína Beta amiloide compostos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda a criar um modelo de doença de Alzheimer em ratos por injeção intracerebroventricular de Aβ25-35 combinado com cloreto de alumínio. Este método permite avaliar prejuízos de memória espacial e alterações neuronais para triagem de fármacos.

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O projeto foi apoiado pela Fundação de ciência Natural Provincial Hebei (n. º C2009001007, H2014406048), a administração de Hebei Provincial de medicina tradicional chinesa (n. º 05027) e o projeto de construção de chave de assunto da faculdade Provincial de Hebei, China.

Este procedimento foi em conformidade com os regulamentos de Experimental Animal administração emitido pelo Comité de estado da ciência e tecnologia da China em 31 de outubro de 198811. Os cientistas devem seguir as diretrizes estabelecidas e aprovadas por suas organizações reguladoras animais institucionais e nacionais.
Nota: Animal e regentes: ratos Sprague-Dawley machos de quatro meses (300-350 g) foram fornecidos para este experimento. Todos os ratos foram alojados em grupos (quatro ou cinco por gaiola), a uma temperatura de 23 ± 1 ° C, com um ciclo de claro-escuro de 12-h. Comida e água eram disponíveis ad libitum. Os ratos foram aclimatados para as condições de habitação de 7 dias antes que o procedimento foi executado. Aβ25-35 foi dissolvido em solução salina de DMSO de 1% para 1 mg/mL e lisados por 5 min em um oscilador ultra-sônico até dissolver completamente. AlCl3 e RHTGF-β1 foram dissolvidos em solução salina em 1% e 0,1 mg/mL, respectivamente. Vermelho Congo, nitrato de prata e outros produtos químicos foram de grau analítico e foram adquiridos a partir de fontes comerciais comuns.
1. ato cirúrgico
Nota: 20 ratos Sprague-Dawley machos foram injetados com Aβ composto no ventrículo lateral e anterodorsal núcleo talâmica e designados como o grupo composto de Aβ-tratados. Outros 20 ratos estavam sujeitos à mesma operação mas receberam microinjeção salina de 0.1% DMSO e designado como o grupo de operação.
<ol><li>Anestesiar os ratos com 100% de isoflurano por inalação e então frear um aparelho estereotáxica cerebral.</li>
	<li>Raspar a pele sobre o vértice da cabeça com uma tesoura cirúrgica e desinfectar com Iodofor. Em seguida, cobrir a toalha cirúrgica descartável na cabeça.</li>
	<li>Fazer uma incisão na pele cabeça ao longo da calvaria longitudinal mediana com bistouries cirúrgicos e tesoura.</li>
	<li>Separe o tecido subcutâneo e fáscia, limpe a calvária de crânio com um algodão seco estéril para parar o sangramento e marcar o bregma com uma caneta.</li>
	<li>Referir-se o rato cerebral estereotáxica mapa12; Considerando o bregma como o ponto de origem, marcar os três pontos, o núcleo talâmica anterodorsal (ad) (posterior (P): 2,0 mm para o bregma; lateral (L): 1.4 mm para a linha média) para injectar RHTGF-β1 e fixação de um parafuso, a (área do ventrículo lateral (LV) posterior (P): 0,8 mm para o bregma; lateral (L): 2,0 mm para a linha média) para injetar Aβ25-35 e AlCl3 e o segundo parafuso fixação lugar (frontal (F): 2,0 mm para o bregma; lateral (L): 1,5 mm para a linha média).</li>
	<li>Delicadamente, perfurar três furos de 1 mm de diâmetro com uma broca de osso flexível, designada nos três pontos acima do crânio (1.5. etapa). Não aperte mais profundo do que o necessário para evitar a esfaquear o tecido cerebral.</li>
	<li>Parar o sangramento e limpe a superfície do crânio repetidamente com algodão seco estéril.</li>
	<li>Inserir uma agulha ligada à bomba de micro-injeção, para o cérebro a 4,6 mm de profundidade e delicadamente Injete 1 μL RHTGF-β1 (10 ng) para a área de anúncio. Fique agulha 2 min após a injeção e lentamente, retirar a agulha (arquivo suplementar 1).</li>
	<li>Fixar os dois parafusos sobre o crânio, designado nos pontos do anúncio e o segundo lugar do crânio para fixação (que foram designados em 1.5. passo) com uma pequena chave de fenda. Não aperte mais profundo do que o necessário para evitar a esfaquear o tecido cerebral.</li>
	<li>Montar o sistema de implantação de cânula (suplemento 2 de arquivo), inserir a cânula manequim dentro da cânula guia após desinfecção por alta pressão.</li>
	<li>Inserir a cânula de guia de tubos de aço inoxidável para o cérebro a 4,6 mm área de LV através do orifício do crânio (Supplemental arquivo 3), com a ajuda de titular da cânula estereotáxica aparelho dos ratos.</li>
	<li>Misture o material de base de dentadura com água base de dentadura a proporção de 1,5 g por 1 mL, colocar a pasta para cobrir o suporte de plástico de cânula guia e dois parafusos para a cânula guia de imobilização e até cobrir a incisão de pele inteira para evitar a infecção de pele.</li>
	<li>No dia 2 da operação, anestesiar os ratos com isoflurano inalação usando a máquina de anestesia de animais pequenos. Retirar a cânula de manequim, inserir a cânula interna da cânula guia e aparafuse o parafuso de fixação para imobilizar a cânula interna.</li>
	<li>Conjunto do tubo de polietileno que liga a bomba de microinjeção para a cânula interna e regular a velocidade de injeção de 1 µ l/min. Microinject a Aβ25-35 ou AlCl3 para o LV.</li>
	<li>Microinjeção 4 μg (1 μL) Aβ25-35 diariamente durante 14 dias, de manhã e 3 μL AlCl3 (% 1) diariamente por 5 dias à tarde sob anestesia de isoflurano.</li>
	<li>Espere 5 min depois de terminar a injeção, delicadamente retire a cânula interna e inserir a cânula manequim novamente dentro da cânula guia.</li>
	<li>No post do dia 15 a cirurgia (que corresponde ao último dia de injeção de Aβ25-35) desmontar o sistema de implantação de cânula. Suavemente retire o sólido de material base da dentadura com tesoura cirúrgica e fórceps, desaparafuse os dois parafusos, retirar a cânula guia e desinfectar a ferida com betadine. Preencher o buraco do crânio com cimento ósseo e sutura da pele com um método simples sutura interrompida.</li>
	<li>Executar a mesma operação com o grupo de operação e microinjeção de solução salina de DMSO de 0,1%.</li>
	<li>
Enfermagem no pós-operatório
	<ol>
<li>Casa 2 ratos por gaiola depois da operação e prestação de alimentos por 30 dias. Nota: 18 ratos na operação grupo sobreviveu (90% taxa de sucesso da operação) e 19 ratos tratados com compostos Aβ grupo sobreviveu (taxa de sucesso de 95% da operação).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. triagem para ratos de modelo de sucesso e avaliação de memória espacial com labirinto de Morris água
<ol><li>
Labirinto de água Morris Nota: O labirinto de água Morris foi usado para avaliar o rato memória espacial13. O labirinto de água de Morris é um tanque circular de aço inoxidável com 120 cm de diâmetro e 50 cm de profundidade. O teste de labirinto de água foi realizado, com base no paradigma da "padrões de ouro" descrito em neurociência comportamental por J. Nunez14.<ol>
<li>Escurecer a água da piscina com algumas gotas de corante alimentar.</li>
		<li>Manter a profundidade da água a 31,5 cm e a temperatura de 23 ± 1 ° C.</li>
		<li>Defina uma plataforma circular de acrílico transparente de 1,5 cm abaixo da superfície da água.</li>
		<li>Manter-se de que todos os sinais espaciais ao redor do labirinto de água são invariáveis durante os testes de labirinto de água.</li>
		<li>Divida a piscina em 4 quadrantes iguais por linhas imaginárias para coleta de dados descritivos.</li>
		<li>Coloque a plataforma escondida no primeiro quadrante (Q1) do labirinto de água.</li>
		<li>Capture o rato nadando comportamentos (medidos pelo número de cruzamento, trajetória ou latência) através de uma câmera de vídeo, sobre o labirinto de água ligado a um software analítico de gráficos baseados em computador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Triagem para ratos de modelo de sucesso ao grupo de compostos Aβ-tratados
	<ol>
<li>No dia 45 de cirurgia, execute o labirinto de água Morris treinamento durante 4 dias consecutivos para tela de ratos com deficiência de memória modelo de sucesso e recolher a taxa de rastreio (SR). Nota: O SR é definido como a latência média de cada rato composto Aβ-tratados e o grupo de operação de ratos para encontrar a plataforma escondida debaixo de água de superfície no dia 4 de água formação de labirinto. "A" é a latência média de cada rato Aβ-Tratado composto para encontrar a plataforma escondida e "B" é a latência média do grupo operação de ratos para encontrar a plataforma escondida, no dia 4 de labirinto de água de formação, na seguinte equação: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56157/56157eq1.jpg"> Quando SR era maior do que 0,2 para um rato composto Aβ-tratados, o rato foi considerado como um rato de modelo de sucesso com a memória prejudicada de rato Aβ-tratados compostos15. O desempenho de memória intradiário foi calculado para os dados de 2 ensaios pelo valor médio de ratos para encontrar a plataforma escondida. O processo de teste de labirinto da água Morris foi projetado tais que os ratos foram autorizados a nadar no tanque de labirinto de água e pesquisa para a plataforma escondida dentro de 60 s. Se um rato não descobriu a plataforma escondida dentro de 60 s, então o rato foi colocado na plataforma com a mão do experimentador. Quando um rato chegou na plataforma escondida (independentemente ou assistida), o rato era deixe ficar lá por 20 s. Então, o rato foi removido do tanque e permitiu uma recuperação física para 10 s entre os 2 ensaios.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. exame neurônio
<ol><li>No dia 86 pós cirurgia, sob anestesia de isoflurano, eutanásia em ratos por decapitação (Figura 1).</li>
	<li>Coloque o cérebro no gelo e delicadamente, separe os dois hemisférios da Rafe. Tirar mancha de hemisfério esquerdo do quiasma óptico e correção em formol 4% para a observação de luz microcopy de hematoxilina neurônio e eosina (HE), vermelho Congo ou nitrato de prata (ver seções 4-6). Corrigi a área do hipocampo CA1 hemisfério direito em glutaraldeído 2,5% para observação de microcopy elétron (secção 7).</li>
	<li>Processo do cérebro para a preparação da amostra microcopy Luz/elétron, como descrito anteriormente,16,17.</li>
</ol>4. neurônio mancha
<ol><li>Deparaffinize cada slide (20 min cada), com gradiente álcool (álcool 100%, 95%, 90%, 80% e 70%) para a água em uma coifa destilada.</li>
	<li>Mancha para 3 min com hematoxilina (0,5% p/v) e em seguida enxaguar com água corrente para remover o corante desvinculado das laminas.</li>
	<li>Enxaguar com 0,1% de ácido clorídrico em álcool por 1 s para remover a cor dos núcleos imaculados.</li>
	<li>Imergir em solução de amônia 0,5% por 2 min até que o fundo se transforma luz azul.</li>
	<li>Mancha para 1 min com eosina 1%.</li>
	<li>Desidrata-se por 5 min com gradiente álcool (álcool 70%, 80%, 90%, 95% e 100%).</li>
	<li>Claras em xilol e montar com meio de montagem resinoso.</li>
	<li>Observar e contar os neurônios vivos da mancha por 0,125 mm no meio CA1 do hipocampo e por 0,0352 mm2 no córtex cerebral em uma ampliação de 400 x com microscópio óptico por uma pessoa cegado para o delineamento experimental.</li>
</ol>5. a mancha para análise do neurônio Aβ fardo vermelho Congo
<ol><li>Deparaffinize cada slide (20 min), com gradiente álcool (álcool 100%, 95%, 90%, 80% e 70%) para a água em uma coifa destilada.</li>
	<li>Manchar-se por 20 min com vermelho Congo solução (0,5 g vermelho de Congo, 80 mL de álcool metílico, glycerinum de 20 mL) de trabalho.</li>
	<li>Enxaguar em água destilada por 5 min.</li>
	<li>Diferenciar-se rapidamente com solução alcalina de 80% de álcool (0,2 g álcool/100 mL de hidróxido de potássio) por 3 s.</li>
	<li>Lave duas vezes, cada um por 5 min com água destilada.</li>
	<li>Counterstain em hematoxilina de Gill para 3 min.</li>
	<li>Enxaguar em água da torneira por 2 min.</li>
	<li>Mergulhe em água amônia (adicione algumas gotas de hidróxido de amónia para água da torneira e misture bem) por 30 s ou até as seções ficarem azuis.</li>
	<li>Enxaguar em água da torneira por 5 min.</li>
	<li>Desidratam com gradiente álcool (álcool 70%, 80%, 90%, 95% e 100%).</li>
	<li>Claras em xilol e montar com meio de montagem resinoso.</li>
	<li>Observar e contar as células coradas com vermelho Congo em uma ampliação de 400x, com microscópio óptico por uma pessoa cegado para o delineamento experimental.</li>
</ol>6. de nitrato de prata para análise do neurônio NFT formação de coloração
<ol><li>Deparaffinize cada slide (20 min), com gradiente álcool (álcool 100%, 95%, 90%, 80% e 70%) para a água em uma coifa destilada.</li>
	<li>Imergir em solução de nitrato de prata 20% e agente tampando por 20 min no escuro.</li>
	<li>Lavar em água destilada duas vezes, 5 minutos de cada vez.</li>
	<li>Imergir em solução de amônia prata. Gota de solução de amoníaco em solução de nitrato de prata 20% e adicione até que a solução passa de turbidez para esclarecimento. Simultaneamente, agitar a solução com uma vareta de vidro por 15 min e coloque o hidróxido de amônio 1% diluído por 2 min.</li>
	<li>Coloque o deslize-o para a solução de trabalho de desenvolvimento para 3-7 min até que o bloco preto no axônio pode ser observado.</li>
	<li>Mergulhe na solução 0,1% diluído amônia para 1 min e depois enxaguar com água por 1 min.</li>
	<li>Descarte-se com tiossulfato de sódio 5% por 2 min e depois enxaguar com água por 5 min.</li>
	<li>Desidratam com gradiente álcool (álcool 70%, 80%, 90%, 95% e 100%).</li>
	<li>Claras em xilol e montar com meio de montagem resinoso.</li>
	<li>Observar e registar a célula para mancha de nitrato de prata em uma ampliação de 400 x com microscópio óptico por uma pessoa cegado para o delineamento experimental.</li>
</ol>7. hippocampal neurônio ultraestrutura de medição
<ol><li>Corte o hipocampo de rato CA1 em vários cubos (1 x 1 x 1 mm3) e coloque em glutaraldeído 2,5% para 2 h a 4 ° C.</li>
	<li>Lave os cubos com PBS três vezes (pH 7.2, 10 min para cada vez).</li>
	<li>Corrigir os cubos no ácido ósmico de 1% para 2 h a 4 ° C.</li>
	<li>Lave os cubos em água bidestilada 3 x (10 min para cada vez).</li>
	<li>Desidratam com gradiente álcool 50%, 70% e 90% (10 min para cada), 100% duas vezes (15 min para cada vez).</li>
	<li>Substitua pelo óxido de propileno, duas vezes (15 min para cada vez), óxido de propileno: resina em 1:1 (60 min. para cada hora à temperatura ambiente) e óxido de propileno: resina 1:4 (60 min. para cada hora à temperatura ambiente). Mergulhe em resina (120 min, à temperatura ambiente).</li>
	<li>Incorporar em EPON 812 e polimerizar (5h/35 ° C, 60 ° C/5h, 80 ° C/5h).</li>
	<li>Cortar as seções semithin (1 µm), mancha de azul de metileno e localizar sob o microscópio.</li>
	<li>Manchar as seções ultra-finas (50 nm) com citrato-ó-acetato de uranilo e chumbo.</li>
	<li>Examine sob um microscópio JEM-1400 e coletamos imagens.</li>
</ol>

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<li>Puzzo, D., Gulisano, W., Palmeri, A., Arancio, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+Alzheimer%27s+disease+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 10, 703-711 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

É sabido que a perda de memória e aprendizagem são principais sintomas clínicos em pacientes2. O procedimento descrito aqui é um método na vivo para estudar AD; Nós adaptamos um protocolo previamente publicado que testou um medicamento para aliviar os déficits de memória e lesões neuronais em um rato modelo4. Nosso protocolo fornece detalhes importantes para obter dados valiosos, bem como uma alta de sobrevida dos animais que o modelo com sucesso a operação, déficits de memória, lesões de neurônio, fardo Aβ e deposição de NFT, para imitar o AD (no presente experimento, a taxa de sobrevivência e taxa de sucesso do modelo de operação são mais de 90%). Estes ratos de modelo de sucesso foram usados para medir a sua memória espacial com o teste de labirinto de água de Morris. O julgamento de navegação posicionamento encontrado que os compostos Aβ pode causar perda de aquisição de memória em ratos; o julgamento de sonda encontrou que os compostos Aβ pode diminuir a retenção da memória de rato; e a julgamento de reversão encontrado que o Aβ composto pode resultar em re-aprendizagem imparidade de rato. Esses dados de teste de labirinto de Morris água mostram que os compostos Aβ pode induzir memória espacial de rato. Em geral, injetando ratos intracerebroventricularly com Aβ25-35, em combinação com AlCl3 e TGF-β1 criou um viável e credível no vivo AD-como modelo animal para o laboratório.
Estudos anteriores mostraram que o volume do cérebro em pacientes AD é 10% inferior de indivíduos saudáveis. Atrofias vários podem ser encontradas no hemisfério cerebral por observação visual. O grau de atrofia cortical está positivamente relacionado com o comprometimento de memória19. A histologia, o grande número de perda de neurônio e grave patologia morfológica perturba diretamente a função de memória em pacientes de AD20. No presente estudo, a observação microscópica de Luz/elétron encontrado que os ratos injetados com compostos Aβ exibido dramáticas alterações neuropatológicas, incluindo perda de neurônio e o rompimento de estrutura neuronal e subcellular. Este resultado corrobora o distúrbio de memória espacial de rato induzido por compostos Aβ e é semelhante ao estado de pacientes.
É sabido que a carga Aβ do cérebro e agregação de NFT são considerados os traços mais importantes do histopathogenic em AD. Eles podem destruir a estrutura neuronal, perturbar a sinalização neural, interromper a função neuronal e resultar em demência avançada17. O presente modelo animal encontrado fardo Aβ e agregação de NFT no cérebro, que de acordo com o estado de paciente de AD. Portanto, as lesões de neurônio presente em ratos induzidos por compostos Aβ podem ser usadas como um modelo para estudar patologia neuronal e estratégia de tratamento de AD.
Os seguintes são exemplos de efeitos de drogas em modelos do rato AD de triagem: Zhao et al, relatada que ambos os flavonoides de Scutellaria caules e folhas (SSF) e Scutellaria barbata (SBF) pode atenuar a perda de memória de rato e apoptose induzida por compostos Aβ8,9. Guo et al, também relataram que SBF pode inibir a agregação de NFT e phosphorylation de excesso da proteína tau no lado Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 e Thr231 e diminuir a expressão de proteínas e RNAm GSK-3beta, CDK5 e PKA em ratos tratados com Aβ compostos21 . Simultaneamente, Shang et al, também relataram que SBF pode suprimir a proliferação de astrocyte e micróglia e inferior Aβ1-40, Aβ1-42, e β-site APP fendendo a enzima 1 (BACE1) a expressão de RNAm no cérebro de Aβ composto ratos22. Baseado nos resultados acima, nosso modelo animal é vantajoso sobre outro modelo AD-como, que envolvem mais função neuronal e desordem da estrutura.
Sobre outro modelo AD-como, injeção intracerebroventricular único de Aβ para ratos pode causar déficits de memória de rato, perda de neurônio e proliferação de neurogliocyte, mas pode ou não ter Aβ e NFT deposição23. Ratos expostos a doses elevadas de Al parecem ter uma elevada taxa de sucesso, imitar AD e um econômico modelo animal, com deficiência de memória, perda de neurônio, proliferação de neurogliocyte e placa senil (SP) e agregação de NFT no cérebro. No entanto, a dose alta de Al pode causar lesões do fígado de ratos e anorexia, acompanhado com diminuição de peso24. O rato envelhecido é outro AD-como modelo. Os ratos envelhecidos demonstram déficits de memória, as alterações patológicas da estrutura neuronal/subestrutura, deposição de lipofuscina, mas sem carga Aβ e agregação de NFT. Ratos de mais de 24 meses de idade são considerados idosos para este modelo e, portanto, requer um longo período de alimentação e, assim, o custo é maior de17,25. SAMP8 e APP ratos transgénicos são os imitam mais próximo ao anúncio e eles são o mais ideais modelos para investigar AD. Mas ambos os modelos animais são fixados o preço mais alto e limitam-se a usar na laboratório26,27. Em comparação com os modelos animais acima, nosso modelo de compostos modelo animal Aβ-Tratado tem um custo mais baixo e alto desempenho, tornando-se uma ferramenta ideal para estudar AD.
Em conclusão, injeção intracerebroventricular de Aβ25-35 combinado com AlCl3 e TGF-β1 para ratos oferece um valioso na vivo modelo animal para entender melhor o comprometimento de memória espacial, lesões neuronais, fardo Aβ e deposição de NFT AD subjacente. Este modelo fornece um rápido e relativamente simples protocolo experimental com um animal de alto sobreviver taxa e taxa de sucesso alta modelo de operação, bem como uma alta taxa de duplicação, que mostrou ser mais económico. O presente modelo animal é um modelo eficaz para imitar AD e ainda mais pode validar-se por ser usado para imitar a várias outras doenças.

É sabido que o anúncio é uma doença neurodegenerativa crónica e progressiva, com perda gradual de memória como a principal síndrome clínica. Na patologia geral, há atrofia do tecido nervoso, neurônio e perda de sinapse, bem como neuronal subcellular distúrbios estrutura e função, que todos estão envolvidos no desenvolvimento e manifestação clínica da AD1,2. É relatado que, quando os animais eram intracerebroventricularly injetado com Aβ, alguns neurotóxicos eventos ocorrem no cérebro envolvendo perda de neurônio, rompimento de homeostase de cálcio, neurônio apoptose e de excesso de produção de espécies reativas de oxigênio3. No entanto, múltiplos fatores estão envolvidos na patogênese da AD e, portanto, é essencial estabelecer um modelo melhor de AD.
Um protocolo detalhado é descrito aqui para estabelecer na vivo imitar AD modelo através de injeção intracerebroventricular de Aβ25-35 e AlCl3, combinado com a injeção de núcleo talâmica anterodorsal de RHTGF-β1 para ratos. Este rato modelhighly imita a função neuronal humana e histopathogenesis do anúncio, incluindo deficiência de memória, perda de neurônio e dano de estrutura, apoptose, fardo Aβ intracelular e NFT agregação4,5,6 , 7 , 8 , 9. o AlCl3 impede que o Aβ depositada formando Aβ solúvel, e o RHTGF-β1 pode promover a produção de Aβ depositada e facilitar a ocorrência de AD10. Este ataque de vários fatores para o neurônio está em conformidade com a patogênese multi da AD.
Todo o experimento durou 86 dias: a Figura 1 mostra um cronograma do projeto experimental, com ponto de tempo de cirurgia animal, triagem de modelo animal, teste de memória espacial animal e preparação da amostra. No primeiro dia de operação, RHTGF-β1 foi injetadas para o núcleo talâmica anterodorsal. No segundo dia da operação, Aβ25-35 e AlCl3 foram injetadas em ventrículo lateral diariamente por 14 dias consecutivos de manhã e 5 dias consecutivos, no período do tarde, respectivamente. Todos os ratos foram autorizados a recuperar durante 45 dias após a operação. O labirinto de água Morris foi usado para a tela para ratos de modelo de sucesso, com comprometimento de memória e para avaliar a memória espacial dos ratos. Os ratos foram submetidos a 4 dias consecutivos de labirinto de água treinando com 2 ensaios por dia, e no dia 4 do treinamento, os ratos foram avaliados com o desempenho de labirinto de Morris água para perda de memória. Todos os ratos continuaram a ser alimentados com 37 dias após a exibição do modelo animal. A memória espacial de ratos foi testada no labirinto de água Morris por 7 dias consecutivos, de 79 de dia para dia 85 após a operação. Todos os ratos foram sacrificados por decapitação no dia 86 para preparação de amostras de cérebro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56157/56157fig1.jpg"> Figura 1. Cronograma do projeto experimental. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56157/56157fig1large.jpg">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Rato Sprague-Dawley</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China</td><td>SCXK (Jing) 2012-0001</td><td>300- 350 g</td></tr><tr><td>Morris labirinto aquático</td><td>Academia Chinesa de Ciências Médicas e Instituto de Pesquisa Médica da União de Pequim, China</td><td>Nenhum</td><td></td></tr><tr><td>anestesio móvel para pequenos animais</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>R580</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho Estereotáxico Cerebral</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>68001</td><td></td></tr><tr><td>Broca óssea flexível</td><td>Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China</td><td>BW-sD908</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de transmissão</td><td>Japan Co., Ltd. Japão</td><td>JEM-1400</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de microinjeção de dois canais</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>RWD202</td><td></td></tr><tr><td>EM micrótomo</td><td>Hitachi Co., Ltd. China</td><td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td>Cânula fictícia</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>62001</td><td>0.D.0.64× I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html</td></tr><tr><td>Cânula de guia</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>62101</td><td>0.D.0.40mm/M3.5</td></tr><tr><td>Cânula interna</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>62201</td><td>0.D.0.41× I.D.0.25mm/<img alt="Special" src="/files/ftp_upload/56157/special01.jpg">M3.5</td></tr><tr><td>Aperte a porca</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>62501</td><td>0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5</td></tr><tr><td>Parafuso de fixação</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>62514</td><td>M1.2× L2.0mm (100BAO)</td></tr> <tr><td>A chave de fenda</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>62999</td><td>45 * 1mm</td></tr><tr><td>PE Tubing</td><td>RWD Life Science Co., Ltd. China</td><td>62302</td><td></td></tr><tr><td>Amilóide beta 25-35</td><td>Sigma Aldrich Co. EUA</td><td>SCP0002-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento transformador humano recombinante -β 1</td><td>PeproTech Inc. EUA</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Tricloreto de alumínio</td><td>Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China</td><td>3011080</td><td></td></tr><tr><td>Congo red</td><td>Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China</td><td>3010016</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de prata</td><td>Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China</td><td>20150720</td><td></td></tr><tr><td>Material de base de dentadura</td><td>Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. China</td><td>20170609</td><td></td></tr></tbody></table>

estabelecimento de um mímico valioso de doença de alzheimer em modelo animal de rato por injeção intracerebroventricular de proteína beta amiloide compostos

Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer's Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein

A doença de Alzheimer (AD) é uma doença cerebral progressiva, irreversível que lentamente destrói a memória e é acompanhada pela mudança de perda e estrutura do neurônio. Com o aumento de pacientes em todo o mundo, a patologia e o tratamento da doença tornou-se um foco na indústria farmacêutica internacional. Assim, o estabelecimento do modelo animal para imitar AD no laboratório é de grande importância.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para o estabelecimento de uma mímica do anúncio em um animal de rato modelo embora injeção intracerebroventricular de amiloide beta proteína 25-35 (Aβ25-35) combinado com tricloreto de alumínio (AlCl3) e núcleo talâmica anterodorsal injeção de recombinante humano transformando o fator de crescimento-β1 (RHTGF-β1) para ratos. Os marcadores relacionados de AD foram medidos, incluindo: memória espacial, estrutura neuronal e subestrutura, neuronal Aβ e produção neurofibrilares (NFT). Este modelo de rato demonstra comprometimento de memória espacial, estrutura neuronal e alterações patológicas de subestrutura, fardo Aβ intracelular neurônio e agregação NFT e fornece um mímico perto do transtorno de estrutura e função neuronal ao de clínica Pacientes de AD. Assim, o apresentado AD rato modelprovides uma ferramenta valiosa na vivo para explorar a função neuronal, patologia neuronal e triagem de drogas de AD.

Este é um protocolo para imitar a doença de Alzheimer em ratos por uma avaliação de imparidade de memória espacial, alterações patológicas neuronais, fardo de proteína (Aβ) beta amyloid neuronal, e agregação neurofibrilares, induzida pela injeção de Aβ25-35 combinado com tricloreto de alumínio e recombinante humano transformando β1-fator de crescimento.

Estabelecimento de um mímico valioso de doença de Alzheimer em modelo Animal de rato por injeção Intracerebroventricular de proteína Beta amiloide compostos

Alzheimer&#39;s disease (AD) is an irreversible, progressive brain disease that slowly destroys memory and is accompanied by neuron loss and structure ...

Este método pode ajudar a responder questões-chave na área de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer. A principal vantagem desta técnica é que ela simula a doença de Alzheimer no modelo animal rato por meio da injeção intracerebroventricular do peptídeo A-beta 25 a 35, combinada com cloreto de alumínio e fator de crescimento transformador beta um humano recombinante. Além disso, oferece um protocolo experimental rápido e relativamente simples, com alta taxa de sobrevida dos animais, alta taxa de sucesso do modelo e alta taxa de duplicação, o que demonstrou ser mais econômico.As implicações dessa técnica estendem-se à avaliação da eficácia de fármacos contra a DA, pois esse modelo animal apresenta déficits de memória e distúrbios neuronais semelhantes aos estados de pacientes com DA. O procedimento será demonstrado por Cheng Jianjun, um técnico do meu laboratório. Em uma rata anestesiada, comece cortando os pelos no vértice da cabeça com uma tesoura cirúrgica e desinfete com iodóforo.Em seguida, faça uma incisão na pele da cabeça ao longo da calota craniana mediana longitudinal com bisturis cirúrgicos e tesoura. Separe o tecido subcutâneo e a fáscia, limpe a calota craniana com peróxido de hidrogênio a 0,3% e marque o bregma com uma caneta marcadora. Em seguida, marque três pontos: o núcleo talâmico anterodorsal para injeção de RHTGF beta um e fixação de um parafuso, a área do ventrículo lateral, ou LV, para injeção de A-beta 25-35 e AICI3, e, por fim, o local para fixação do segundo parafuso.Faça cuidadosamente três furos de um milímetro de diâmetro com uma broca óssea flexível nos três pontos marcados no crânio. Interrompa o sangramento e limpe repetidamente a superfície do crânio com algodão estéril e seco. Em seguida, insira uma agulha ligada à bomba de microinjeção no cérebro a uma profundidade de 4,2 milímetros e injete suavemente um microlitro de RHTGF beta um na área ad.Mantenha a microinjeção por dois minutos após a injeção. Em seguida, retire-a lentamente. Fixe os dois parafusos no crânio, nos pontos previamente marcados, com uma chave de fenda pequena.Após a colocação dos parafusos, monte o sistema de implantação da cânula inserindo primeiro a cânula simuladora na cânula guia, após desinfecção por imersão em álcool 75% por 24 horas. Em seguida, insira a cânula guia de tubo de aço inoxidável no cérebro até a área do Ventrículo Lateral (VL) em 4,6 milímetros através do orifício no crânio, com a ajuda de um suporte para cânula no aparelho estereotáxico do rato. A seguir, misture o material da base da prótese com água para base de prótese na proporção de 1,5 gramas por um mililitro.Coloque a pasta para cobrir o pedestal de plástico da cânula-guia e os dois parafusos para imobilizar a cânula-guia. Cubra toda a incisão cirúrgica para evitar infecção da pele. No dia seguinte, retire a cânula falsa e insira a cânula interna na cânula-guia.Parafuse o parafuso de fixação para imobilizar a cânula interna. Conecte o tubo de polietileno que liga a bomba de microinjeção à cânula interna e regule a velocidade de injeção para um microlitro por minuto. Microinjete o A-beta 25-35 no ventrículo lateral (LV). Aguarde cinco minutos após a conclusão da injeção e retire suavemente a cânula interna.Em seguida, insira novamente a cânula fictícia na cânula guia. No dia 15 após a cirurgia, desmonte o sistema de implante de cânula removendo o material da base da prótese dentária solidificado com tesoura cirúrgica e pinça, e desinfete a ferida com iodóforo. Por fim, preencha o orifício do crânio com cimento ósseo e feche a pele com o método de sutura interrompida simples.Comece por escurecer a água da piscina com corante alimentício preto. Mantenha a profundidade da água em 31,5 centímetros e a temperatura em 23 mais ou menos um grau Celsius. Em seguida, posicione uma plataforma circular transparente de plexiglás com 1,5 centímetro abaixo da superfície da água.Em seguida, divida o compartimento em quatro quadrantes iguais por linhas imaginárias para a coleta descritiva de dados. Coloque a plataforma oculta no primeiro quadrante, ou Q1, do labirinto aquático. Por fim, grave os comportamentos de natação da rata por meio de uma câmera de vídeo, acima do labirinto aquático, conectada a um software analítico gráfico baseado em computador.Esses resultados indicam que o grupo de ratos submetido à cirurgia simulada sempre nadou livremente, enquanto os ratos do grupo tratado com A-beta compósito sempre nadaram ao redor da periferia da piscina em nado adaptativo no labirinto aquático de Morris. Ao longo dos quatro dias de triagem para identificação de ratos com modelo de déficit de memória, todos os ratos apresentaram tempos progressivamente decrescentes para encontrar a plataforma submersa. Além disso, as latências do grupo tratado com A-beta compósito para encontrar a plataforma submersa foram significativamente maiores do que as do grupo submetido à cirurgia simulada, demonstrando que o A-beta compósito pode agravar o déficit de reaprendizagem da memória em ratos.No teste de retenção de memória de um dia, o grupo tratado com beta-amiloides compostos levou menos tempo nadando, percorreu menor distância e realizou menor número de travessias dentro de 60 segundos, em comparação com o grupo submetido a cirurgia simulada. Por fim, além das alterações patológicas, o número de neurônios também foi significativamente reduzido no hipocampo e no córtex cerebral do grupo tratado com beta-amiloides compostos em comparação com o grupo submetido a cirurgia simulada. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em 20 a 30 minutos se for realizada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de evitar que a cânula guiada se solte do parafuso craniano. Após este procedimento, outros métodos, como testes de labirinto, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se o modelo de DA simulado foi bem-sucedido. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de neurociência explorarem doenças neurodegenerativas in vivo.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estabelecer modelos animais de mimetização da DA por meio da injeção intracerebroventricular de A-beta 25 a 35 combinada com cloreto de alumínio e fator de crescimento transformador beta um recombinante humano em ratos. Não se esqueça de que trabalhar com metil metacrilato pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de máscaras e luvas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Este vídeo demonstra o procedimento de injeção de peptídeos amilóides monoméricos no prosencéfalo de peixes-zebra adultos para gerar toxicidade amilóide, imitando o dano neuronal observado na doença de...

Estabelecendo um modelo de doença de Alzheimer no cérebro de peixe-zebra por meio de injeção de peptídeo amilóide

Este vídeo demonstra o procedimento para injetar peptídeos beta-amilóides, cloreto de alumínio e um fator de crescimento neuroinflamatório, que coletivamente auxilia na formação de placas amilóides tóxicas na região do hipocampo. Isso causa comprometimento da memória no rato, característico da doença de Alzheimer.

Estabelecendo um modelo de rato com doença de Alzheimer por meio de uma injeção de peptídeo beta-amilóide

Este vídeo demonstra a infusão estereotáxica precisa de beta amilóide no giro dentado para estabelecer um modelo de camundongo da doença de Alzheimer. A determinação precisa de coordenadas e a entrega controlada de proteínas beta amilóides resultam em degradação neuronal, interrompendo o processamento da memória e contribuindo para o desenvolvimento da doença de Alzheimer.

Infusão cerebral estereotáxica direta de proteínas beta-amilóide para um modelo de doença de Alzheimer

Aqui, apresentamos um protocolo para infusão cerebral estereotáxica direta de beta-amilóide. Esta metodologia fornece um modelo alternativo de camundongo in vivo para abordar os efeitos de curto prazo da beta-amilóide nos neurônios cerebrais.

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

Para investigar a doença co-mórbida de Alzheimer (DA) ea condição acidente vascular cerebral em um novo modelo, três tarefas de comportamento estão descritos que avaliar tanto o controle motor e comportamentos cognitivos. Essas tarefas incluem a tarefa beam-pé, a tarefa cilindro e Morris labirinto de água.

Motor e hipocampo aprendizagem espacial Dependente e Avaliação de Memória de Referência em um rato transgénico modelo da doença de Alzheimer com AVC

O amilóide-β (Ap) -injected modelo animal permite a administração de uma quantidade e espécie de fragmentos de Ap definidos e reduz as diferenças individuais dentro de cada grupo de estudo. Este protocolo descreve a injecção intracerebroventricular (ICV) de Ap sem instrumentos estereotáxicas, permitindo a produção de anormalidades comportamentais Alzheimer-like em ratinhos normais.

Injeção intracerebroventricular de peptídeos amilóide-beta em ratos normais para induzir Acutely déficits cognitivos Alzheimer-like

Para estudar os efeitos de Aβo in vivo, desenvolvemos um modelo baseado em infusões repetidas de Aβo solúvel no hipocampo juntamente com infusão contínua de anticorpo Aβo (6E10) no hipocampo usando bombas osmóticas para neutralizar o efeito neurotóxico de Aβo.

Neurodegeneração em um modelo animal de Chronic beta-amilóide Oligï¿½ero Infusion é contrariada pelo anticorpo Tratamento infundido com bombas osmóticas

Desenvolvemos uma metodologia para 3D quantitativa na modelagem silico (q3DISM) de amilóide cerebral-β (Aâ) fagocitose por fagócitos mononucleares em modelos de roedores da doença de Alzheimer. Este método pode ser generalizado para a quantificação de praticamente qualquer evento fagocítica in vivo.

3D quantitativa In Silico Modelagem (q3DISM) de beta-amilóide cerebral fagocitose em modelos de roedores da doença de Alzheimer

Este protocolo descreve a síntese, caracterização e injeção de peptídeos monomérico amiloide-β42 para gerar toxicidade amiloide no zebrafish adulto para estabelecer um modelo de doença de Alzheimer, seguido de análise histológica e detecção de agregações.

Toxicidade do Amyloid-β42 de modelagem e neurodegeneração no cérebro adulto de Zebrafish

Este protocolo ilustra um método de encapsulamento da pilha pela gelação física rápida do alginato para imobilizar pilhas. Os microgrânulos obtidos permitem a secreção controlada e sustentada de amiloide-β ao longo do tempo e podem ser usados para estudar os efeitos do amilóide-β secretado em modelos in vitro e in vivo.

Fabricação de microgrânulos de alginato de secreção de amiloide-β para uso na modelagem da doença de Alzheimer

Aprenda a criar um modelo de doença de Alzheimer em ratos por injeção intracerebroventricular de Aβ25-35 combinado com cloreto de alumínio. Este método permite avaliar prejuízos de memória espacial e alterações neuronais para triagem de fármacos.

Estabelecimento de um mímico valioso de doença de Alzheimer em modelo Animal de rato por injeção Intracerebroventricular de proteína Beta amiloide compostos (Vídeo) | JoVE Journal

Estabelecimento de um mímico valioso de doença de Alzheimer em modelo Animal de rato por injeção Intracerebroventricular de proteína Beta amiloide compostos

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