Name: Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Aprenda a detectar colonização de EHEC em camundongos usando bioluminescência in vivo não invasiva. Este método permite monitorar a presença bacteriana em tempo real sem sacrificar os animais, facilitando estudos de patogenicidade.

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Reconhecemos o Chi-Chung Chen do departamento de pesquisa médica, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) pela ajuda no mouse, infecção e o apoio do centro de animais de laboratório da Universidade Nacional de Cheng Kung. Este trabalho é apoiado pelo Ministro da ciência e tecnologia (a maioria) concede (mais 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011,-005 and106-2321-B-006) para CC.

Cuidado: EHEC O157: H7 é um nível de biossegurança 2 (BSL-2) patógeno de acordo com o Centers for Disease Control and Prevention (CDC) instrução de biossegurança (https://www.cdc.gov/). Portanto, todos os procedimentos experimentais envolvendo EHEC devem ser executados em uma facilidade BSL-2. Use luvas e jalecos de laboratório durante a realização do experimento. Trabalho em uma gabinete de biossegurança certificada (BSC). Desinfete a bancada experimental, antes e após o procedimento experimental com etanol a 70%. Todos os instrumentos ou equipamentos que EHEC contato (ou potencialmente contato) deve ser desinfectado com etanol 70% ou água sanitária. Resíduos contaminados (ou potencialmente contaminados) devem ser selado e esterilizado com cuidado. Use uma máscara, óculos de proteção, luvas duplo ou um macacão, se necessário. Os ratos fêmeas C57BL/6 de 6 semanas de idade foram comprados e mantidos pela Universidade de laboratório Animal centro de Nacional Cheng Kung (NCKU). As experiências com animais foram aprovadas pelo cuidado de Animal institucional e Comitê de uso de NCKU (número de aprovação 104-039).
1. geração de bactéria EHEC Bioluciferase-etiquetado
<ol><li>Mix 50 ng o Ácido desoxirribonucleico (DNA), 1 μL de cada 10 μm para a frente e reverter as primeiras demão, desoxinucleótidos de 2,5 mM 2 μL (dNTPs), 2 μL de 10x buffer, 0,2 µ l de DNA polimerase e água de bidestilada estéril (ddH2O) para um volume final de 20 μL para amplificar o antigaveta canamicina, de gene nptII 24. O modelo de DNA é de pBSL18024, que é comprado de projeto nacional de BioResource (NBRP). As condições PCR são listadas na tabela 1 e a sequência de cartilha está disponível na tabela 2.</li>
	<li>Ligam os produtos PCR para um vetor de clonagem comercial seguindo o kit protocolo (consulte Tabela de materiais).</li>
	<li>Excisar o fragmento do gene nptII do vetor clonagem por NsiI e SmaI e clonar em pBBR1MCS4, que é digerido pela ScaI e NsiI pAKlux29 -criar o plasmídeo canamicina resistente, pWF27813.</li>
	<li>Excisar o operon luxCDABE , do luciferase expressando de shRNA9, pAKlux2, pela SpeI-HF e ScaI e clone SpeI-HF e SmaI digerido pWF278 para gerar canamicina resistente e luciferase expressando de shRNA, pWF27913. Nota: Para as extrações do plasmídeo e purificações o fragmento extirpado, use a extração comercial do plasmídeo e o kit de extração do gel, respectivamente. Para a digestão enzimática, misturar 100 ng DNA, 1 μL de buffer x 10, 1 μL de cada enzima de restrição selecionada e ddH estéril2O para um volume total de 10 μL e incubar a 37 ° C para 2,5-3 h.</li>
	<li>Transforme o plasmídeo pWF279 em células competentes de Escherichia coli O157: H7 EDL933 por eletroporação com 2.500 V para ms 4.</li>
	<li>Incube as células de bactérias transformadas em 1 mL de meio de Luria-Bertani (LB) a 37 ° C por 1h.</li>
	<li>As bactérias em uma placa de ágar LB suplementado com 50 µ g/mL de canamicina a 37 ° C por 16-18 h da placa.</li>
	<li>Verificar o sinal bioluminescente da placa por um na vivo de imagem máquina no dia seguinte. Escolher uma única colônia da placa e a cultura em 3 mL LB suplementado com 50 canamicina µ g/mL a 37 ° C por 16-18 h.</li>
	<li>Prepare o suporte de ações bacteriana diluindo 100% glicerol em ddH estéril2O tornar a solução de glicerol de 30%.</li>
	<li>Congelar a canamicina resistente bactéria de e. coli O157: H7 EDL933 abrigando o plasmídeo luciferase como um estoque bacteriano em uma tampa de rosca cryovial como uma proporção de 1:1 de solução de glicerol cultura e 30% bactérias a-80 ° C. A concentração final de glicerol é 15%.</li>
</ol>2. preparação de bactéria EHEC bioluminescentes para inoculação Oral
Nota: O fluxograma cronograma dos procedimentos experimentais para a preparação de EHEC e gavagem oral rato é apresentado na Figura 1 para auxiliar na preparação experimental.
<ol><li>Raia e. coli O157: H7 EDL933 as bactérias abrigando plasmídeo luciferase em uma placa de ágar LB com 50 canamicina µ g/mL de estoque-80 ° C. Crescem as bactérias para 16-18 h a 37 ° C.</li>
	<li>Escolha uma única colônia da placa durante a noite e cultura no meio de 3 mL LB com 50 canamicina µ g/mL para 16-18 h em uma incubadora de 37 ° C a 220 rpm.</li>
	<li>Subcultura as bactérias (diluição de 1: 100) em canamicina (50 µ g/mL) contendo caldo LB para 2,5-3 h em uma incubadora de 37 ° C a 200 rpm. (Por exemplo, adicione 2 mL a noite cultivadas bactérias para 200 mL LB suplementado com canamicina (50 µ g/mL)).</li>
	<li>Incubar as bactérias para 2,5-3 h e medir o valor de densidade óptica em 600 nm (OD600) até o valor é entre 0,9 a 1. O número de células bacterianas é em uma densidade de cerca de 108 colônia formando unidades (CFU) / mL.</li>
	<li>Centrifugar as bactérias re-cultivadas em 8.000 x g durante 30 minutos, 4 ° C.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante sem agitar o sedimento de bactérias e lave a pelota com 100 mL 0,9% solução salina normal estéril por agitação suave.</li>
	<li>Repita os passos de 2.5 e 2.6 uma vez.</li>
	<li>Após a lavagem, centrifugar a cultura bacteriana a 8.000 x g por 30 min, 4 ° C e descartar o sobrenadante suavemente.</li>
	<li>Condensado a pelota em 100 vezes com solução salina normal estéril 0,9%. Por exemplo, se são centrifugadas bactérias de 200 mL, adicione salina 2 mL para suspender o sedimento.</li>
	<li>Confirme as bactérias CFU (deve ser aproximadamente 109 UFC/100 μL após a condensação em solução salina normal) com chapeamento concentradas bactérias através de um de 10 vezes de diluição serial25.</li>
</ol>3. Mouse gavagem Oral de EHEC
<ol><li>Trate de camundongos C57BL/6 fêmeas de 6 semanas com água de estreptomicina (5 g/L) por 24 h.</li>
	<li>Após 24h, mude para regular água potável para outro 24h antes de gavage. Após o tratamento com água normal para 24h, os ratos estão prontos para gavagem oral de EHEC.</li>
	<li>Encha a seringa com bactérias EHEC 100 μL, puxando o êmbolo para trás. Não garantir nenhuma bolha de ar na seringa. Remova as bolhas, encaixe a seringa com os dedos.</li>
	<li>Levante o animal delicadamente e coloque-o no topo da gaiola com cuidado.</li>
	<li>Segure o mouse pela cauda cuidadosamente, e o animal vai agarrar o topo da gaiola e tentar te afastar de mim.</li>
	<li>Contenha suavemente o mouse segurando a pele solta do pescoço e costas o animal com o polegar e o indicador para evitar que a cabeça do rato se mova.</li>
	<li>Segure o mouse na posição vertical para inserir a agulha de gavagem e garantir que a cabeça de rato é imobilizado e vertical.</li>
	<li>Insira a agulha de gavagem para a boca do rato após o céu da boca e mover para baixo no esôfago e em direção ao estômago.</li>
	<li>Quando a agulha inserida é metade ou o comprimento de dois terços no mouse, injete 100 bactéria EHEC μL, que contêm aproximadamente 109 células CFU.</li>
</ol>4. visualização
<ol><li>Após a intubação oral, detecta os sinais bioluminescentes em 1 a 2 dias.</li>
	<li>Antes de examinar os sinais bioluminescentes de animais, anestesia, colocando-os em uma câmara de isoflurano em 2,5% 1,5 L/min de oxigênio.</li>
	<li>Espere por 2-5 min até que todos os ratos se tornar inconsciente e parada em movimento. Animais estão prontos para a deteção em vivo de bioluminescência.</li>
	<li>Detectar e imagem bioluminescentes sinais dos animais por um na vivo sistema de imagem. Por favor, veja a seção 5 "Aquisição de dados" para operação de software. Durante o processo de geração de imagens, todos os animais estão sob um fornecimento contínuo de isoflurano em 2,5% 1,5 L/min de oxigênio.<ol>
<li>Clique em arquivo > ao vivo e manualmente o foco do mouse.</li>
		<li>Selecione a intensidade de laser e tempo de exposição.</li>
		<li>Clique em adquirir > capturar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para a imagem latente ex vivo , eutanásia os ratos por deslocamento cervical e retire o intestino inteiro de ratos infectados. Coloque os intestinos em uma placa de Petri-9cm e imagem pelo na vivo sistema de imagem. A configuração é o mesmo que na vivo imagens exceto o campo de visão é definida como A/B. Por favor consulte a seção 5 "Aquisição de dados" para obter detalhes. Nota: Método por deslocamento cervical: conter os ratos no topo da gaiola agarrando a cauda com uma mão, para que os animais agarrar a gaiola. Coloca uma caneta ou o polegar e o primeiro dedo da outra mão contra o pescoço na base do crânio. Rapidamente empurre para a frente com a mão ou objeto, enquanto a cabeça de restrição e puxar para trás com a mão segurando a cauda. Olhe com cuidado para confirmar respiratória e sem pulsação.</li>
</ol>5. aquisição de dados
Nota: O software utilizado para aquisição de dados é listado na Tabela de materiais.
<ol><li>Para aquisição de imagem, abra o painel de controle de aquisição do software (Figura 2).</li>
	<li>Selecione "Luminescentes", "fotografia" e "Sobreposição".</li>
	<li>Definir o tempo de exposição, como "Auto". Definir Binning como "Meio".</li>
	<li>Luminescentes e 8 estabelecem ƒ/parar como 1 para fotografia. Ƒ/parar controles a quantidade de luz recebida pelo detector CCD.</li>
	<li>Defina o campo de visão, com base no campo de imagens que são de interesse para adquirir. Opção "D" pode caber cinco ratos de 6 semanas de idade e imagem-los todos em um tempo. "C" pode imagem três ratos de 6 semanas de idade em um campo.</li>
	<li>Uma vez que os ratos/amostras estão prontas para tratamento de imagens, clique em "Adquirir" para aquisição de imagens.</li>
	<li>Abra os dados de imagem que foi adquiridos.</li>
	<li>Abra o painel de paleta de ferramentas (Figura 3).</li>
	<li>Selecione Ferramentas ROI. Recomendamos o círculo (o um mais à esquerda) para variar a área bioluminescente em imagens (Figura 4).</li>
	<li>Clique em "Medida ROIs" (ícone de lápis) para medir a intensidade de superfície bioluminescente (Figura 3). O painel de medições de ROI e os valores de quantificação aparecem (Figura 5).</li>
	<li>Use a medida de configurar no canto esquerdo do painel de medições de ROI para selecionar as valores/informações necessárias (Figura 6), caso contrário clique em "Exportar" para exportar esta tabela de dados e salvar como arquivo. csv (Figura 5).</li>
	<li>Use os valores da coluna "Fluxo Total (p/s)" como a quantificação de intensidade bioluminescentes no arquivo. csv.</li>
</ol>

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<li>Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Plasmid+Maintenance+in+the+Attenuated+Live+Vector+Vaccine+Strain+Salmonella+typhiCVD+908-htrA%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA.</a> Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).</li>
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<li>Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+%28EHEC%29+infection+and+hemolytic+uremic+syndrome+%28HUS%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS).</a> BMC Med. 10, (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Tem sido relatado que EHEC transformada com o plasmídeo luciferase tem sido utilizada para examinar sua localização em hosts ou expressão de gene em vivo8,11,12. O modelo murino demonstrado aqui também tem sido relatado para detectar o sincronismo de EHEC colonizado e localização no anfitrião murino8. Não obstante, nós fornecemos o protocolo de detalhe de como administrar a inoculação de EHEC aos...

EHEC O157: H7 é um patógeno que causa diarreia1, HS2, HUS3e insuficiência renal aguda mesmo4 através de água ou alimentos contaminados. EHEC é um enterobacterium patogênico e coloniza para o trato gastrointestinal dos seres humanos1. Quando EHEC primeiro aderir ao epitélio intestinal do hospedeiro, eles injetam os fatores de colonização em células hospedeiras através do sistema de secreção de III do tipo (T3SS) que funciona como uma seringa molecular induzindo um anexar e apagar (A/E) lesão posteriormente para impor adesão (colonização)5. Estes genes envolvidos na formação da lesão de A/E são codificados pelo locus do enterócito (LEE) de apagamento de ilha de patogenicidade5.
Bioluminescência é uma reação química produzindo a luz, na qual luciferase catalisa sua Luciferina de substrato para gerar luz visível6. Este processo enzimático, muitas vezes, requer a presença de oxigênio ou trifosfato de adenosina (ATP)6. Bioluminescência (BLI) de imagem permite que os pesquisadores a visualização e a quantização das interações patógeno-hospedeiro em animais vivos7. BLI pode caracterizar o ciclo de infecção bacteriana em animais vivos, seguindo as bactérias bioluminescentes que migrar para e invadir tecidos diferentes7; Isto revela uma dinâmica progressão da infecção. Além disso, a carga bacteriana nos animais está relacionada com o sinal bioluminescentes8; assim, é um conveniente indicador para estimar as condições patológicas de animais experimentais em uma maneira simples e direta.
O plasmídeo utilizado aqui contidos o operon do luciferase, luxCDABE, que é a partir da bactéria Photorhabdus luminescens que codifica seu próprio substrato de luciferase7,9. Transformando este plasmídeo luciferase-expressando em bactérias, os processos de colonização e infecção podem ser monitorados, observando estas bactérias bioluminescentes em animais vivos. Em geral, BLI e rotulado de bioluminescência bactérias permitem aos investigadores monitorar os números bacterianos e localização, viabilidade bacteriana com antibióticos/terapia tratamento e expressão de gene bacteriano em infecção/colonização6, 7. numerosas bactérias patogênicas têm sido relatadas que expressam o operon luxCDABE para examinar a sua expressão de ciclo e/ou gene infecção na infecção. Estas bactérias, incluindo uropathogenic e. coli10, EHEC8,11,12,13, enteropatogênica Escherichia coli (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, e Vibrio cholerae20, foram documentados.
Vários modelos experimentais foram desenvolvidos para facilitar o estudo da EHEC colonização in vitro e in vivo21,22,23. No entanto, há uma falta de modelos animais apropriados para estudar o EHEC colonização na vivoe, portanto, uma escassez resultante de detalhes. Para facilitar o estudo da EHEC colonização mecanismo na vivo, que é valioso para construir modelos animais para observar e quantificar a colonização de EHEC em animais vivos em um método não-invasivo.
Este manuscrito descreve um modelo de colonização de rato-EHEC que usa um sistema expressando bioluminescente para monitorar a colonização de EHEC ao longo do tempo em hospedeiros vivos. Ratos intragastrically são inoculados com bioluminescência-rotulado EHEC e o sinal bioluminescente é detectado em ratos com um não-invasivo na vivo de imagem de sistema13. Camundongos infectados com bioluminescência-rotulado EHEC mostrou sinais bioluminescentes significativos em seu intestino, depois de 2 dias pós infecção, que sugeriu que essas bactérias colonizaram no intestino hospedeiro após 2 dias pós infecção. Dados de imagem ex vivo mostram que esta colonização é especificamente no ceco e cólon de ratos. Usando este modelo de rato-EHEC, a colonização de EHEC bioluminescente pode ser detectada no hospedeiro vivo por um na vivo de imagem de sistema, para estudar os mecanismos detalhados da colonização de bactérias entéricas, que pode promover uma compreensão mais em EHEC-induzido por alterações fisiológicas e patológicas.

<table><tbody><tr><td>Incubadora Shaker</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>incubação de bactérias&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubadora de agitação orbital</td><td>FIRSTEK</td><td>S300</td><td>incubação de bactérias&nbsp;</td></tr><tr><td>fonte pBSL180</td><td></td><td></td><td>do gene nptII</td></tr><tr><td>fonte pAKlux2</td><td></td><td></td><td>do operon luxCDABE</td></tr><tr><td>T& Um Kit de Clonagem</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYC001-20P</td><td>uso para clonagem de TA&nbsp;</td></tr><tr><td>Nsi I</td><td>NEB</td><td>R0127S</td><td>uso para clonagem de plasmídeos&nbsp;</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>NEB</td><td>R0122S</td><td>uso para clonagem de plasmídeos&nbsp;</td></tr><tr><td>Spe I-HF</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td>uso para clonagem de plasmídeos&nbsp;</td></tr><tr><td>Sma I&nbsp;</td><td>Uso do NEB</td><td>R0141S</td><td>para clonagem de plasmídeos&nbsp;</td></tr><tr><td>Uso de T4 ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td>para clonagem de plasmídeos&nbsp;</td></tr><tr><td>Ex Taq</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>uso para amplificação de PCR</td></tr><tr><td>10X Ex Taq Buffer</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>uso para amplificação de PCR</td></tr><tr><td>dNTP Mistura&nbsp;</td><td>Uso de TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>para amplificação de PCR</td></tr><tr><td>Máquina de PCR</td><td>aplicada Biosystem&nbsp;</td><td>2720 Termociclador</td><td>&nbsp; para amplificação de PCR</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>SIGMA</td><td>G5516-1L</td><td>uso para solução de estocagem de bactérias</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434-5KG-R</td><td>químico para fazer meio LB, 10 g / L</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1612.00</td><td>químico para fazer meio LB, 10 g / L</td></tr><tr><td>Extrato de levedura em pó</td><td>Affymetrix</td><td>23547-1 KG</td><td>químico para fazer meio LB, 5 g / L</td></tr><tr><td>Ágar</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1802.00</td><td>químico para fazer ágar</td></tr><tr><td>LB canamicina&nbsp;</td><td>Antibióticos Sigma</td><td>K4000-5G</td><td>, uso para seleciton</td></tr><tr><td>estreptomicina&nbsp;</td><td>Antibióticos Sigma</td><td>S6501-100G</td><td>, eliminam a microbiota em camundongos</td></tr><tr><td>Célula competente EDL933</td><td>Método caseiro</td><td></td><td>está em documento suplementar&nbsp;</td></tr><tr><td>Eletroporador</td><td>MicroPulser</td><td></td><td>para eletroporação</td></tr><tr><td>Cuvetes de eletroporação</td><td>Gene Pulser/MicroPulser</td><td>1652086</td><td>para eletroporação</td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidade</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti, J-26S XP</td><td>use para centrifugar bactérias&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotor de Ângulo Fixo</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA25.5</td><td>use para centrifugar bactérias&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotor de Ângulo Fixo</td><td>Beckman Coulter</td><td>JLA10.5</td><td>use para centrifugar bactérias&nbsp;</td></tr><tr><td>garrafas de centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>REF357003</td><td>uso para centrifugar bactérias&nbsp;</td></tr><tr><td>garrafas de centrífuga</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>3141-0500</td><td>use para centrifugar bactérias&nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf Biofotômetro Plus&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>AG 22331 hamburgo</td><td>para medir o valor OD600 de</td></tr><tr><td>bactérias C57BL/6 camundongos&nbsp;</td><td>Centro de Animais de Laboratório da NCKU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>jaleco, luvas</td><td></td><td></td><td>para proteção pessoal&nbsp;</td></tr><tr><td>isoflurano&nbsp;</td><td>Panion & BF Biotech Inc.</td><td>G-8669</td><td>para anestesia de camundongos, seringa de grau farmacêutico</td></tr><tr><td>de 1ml&nbsp;</td><td></td><td></td><td>uso para gavagem oral de camundongos</td></tr><tr>Agulha <td></td> de<td>alimentação reutilizável de 22 G com ponta de bola</td><td>&phi; 0,9 mm X L 50 mm</td><td>uso para gavagem oral de camundongos</td></tr><tr><td>tesouras cirúrgicas</td><td></td><td></td><td>uso para experimento com camundongos</td></tr><tr><td>Sistema de imagem Xenogen IVIS 200</td><td>Perkin Elmer</td><td>Uso do espectro IVIS</td><td>para captura de imagens bioluminescentes&nbsp;</td></tr><tr><td>Software de imagem viva</td><td>Perkin Elmer</td><td>versão 4.1</td><td>uso para quantificar os dados da imagem</td></tr></tbody></table>

deteção de colonização enterohemorrhagic escherichia coli murino host pelo sistema não-invasivo na vivo bioluminescência

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157: H7, que é um patógeno de origem alimentar que causesdiarrhea, (HS), a colite hemorrágica e Síndrome hemolítico-urêmica (HUS), colonizar para o trato intestinal de seres humanos. Para estudar o mecanismo detalhado da colonização de EHEC in vivo, é essencial ter modelos animais para monitorar e quantificar a colonização de EHEC. Demonstramos aqui um modelo de colonização de rato-EHEC, transformando o plasmídeo expressando bioluminescente de EHEC para monitorar e quantificar a colonização de EHEC em hospedeiros vivos. Animais inoculados com bioluminescência-rotulado EHEC mostram sinais bioluminescentes intensos em camundongos por detecção com um não-invasivo na vivo sistema de imagem. Após 1 a 2 dias pós infecção, sinais bioluminescentes poderiam ainda ser detectados em animais infectados, o que sugere que o EHEC colonizar em hospedeiros pelo menos 2 dias. Também demonstramos que estes EHEC bioluminescentes localizar de intestino de rato, especificamente no ceco e cólon, de imagens ex vivo . Este modelo de colonização de rato-EHEC pode servir como uma ferramenta para fazer avançar o conhecimento atual do mecanismo de colonização EHEC.

Nós administramos bioluminescência-rotulado EHEC (~ 109 células bacterianas) para 6 semana de idade camundongos C57BL/6 fêmeas, por gavagem oral. Após a inoculação oral de EHEC aos ratos dentro de 1h, os animais foram examinados pelo sinal bioluminescente, na vivo sistema de imagem como mostrado na Figura 7. Os resultados mostraram um forte sinal bioluminescente em camundongos gavage com bioluminescência-rotulado EHEC. Examinamos os sinais...

Um protocolo detalhado de um modelo de mouse para enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) colonização usando bactérias bioluminescência-etiquetado é apresentado. A detecção destas bactérias bioluminescentes por um não-invasivo na vivo sistema de animais vivos de imagem pode avançar nossa compreensão atual da colonização de EHEC.

Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

O objetivo geral deste experimento é detectar a colonização por E.coli enterohemorrágica em camundongos utilizando um sistema de imagem in vivo não invasivo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de patogenicidade da E.coli enterohemorrágica, como a colonização. A principal vantagem desta técnica é que a colonização por EHEC pode ser detectada em animais vivos sem a necessidade de sacrificar o animal.Para começar, plaqueie uma estirpe de -80 graus Celsius de bactérias E.coli O157:H7 EDL933 contendo um plasmídeo luciferase em uma placa de ágar LB com 50 microgramas por mililitro de canamicina. Incube as bactérias por 16 a 18 horas a 37 graus Celsius. Escolha uma única colônia da placa de cultura de 16 horas e inóculo três mililitros de meio LB com 50 microgramas por mililitro de canamicina.Em seguida, incubar a cultura a 37 graus Celsius e 220 rpm por 16 a 18 horas. No dia seguinte, preparar dois mililitros de uma diluição de 1 para 100 da cultura de overnight e inoculá-la em 200 mililitros de LB com canamicina. Incubar a cultura a 37 graus Celsius e 200 rpm por 2,5 a três horas ou até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja entre 0,9 e 1.Em seguida, centrifugue as bactérias recultivadas a 8000 ×g e quatro graus Celsius por 30 minutos. Descarte o sobrenadante sem perturbar o pellet e lave as bactérias com 100 mililitros de solução salina normal estéril 0,9% mediante agitação suave. Após a lavagem, centrifugue novamente a cultura bacteriana e descarte cuidadosamente o sobrenadante.Em seguida, utilize solução salina normal estéril a 0,9% para concentrar o pellet 100 vezes. Após tratar os camundongos com água contendo estreptomicina por 24 horas de acordo com o protocolo descrito no texto, encha uma seringa com 100 microlitros de bactérias EHEC. Levante suavemente o animal e coloque-o com cuidado sobre a parte superior da gaiola.Em seguida, segure cuidadosamente o camundongo pela cauda, de modo que o animal se agarre à parte superior da gaiola e tente escapar. Restrinja suavemente o camundongo usando o polegar e o indicador para segurar a pele solta do pescoço e das costas do animal, impedindo que a cabeça se mova. Em seguida, mantenha o camundongo em posição vertical e certifique-se de que a cabeça do camundongo permaneça imobilizada nesta posição.Insira a agulha de gavagem na boca do animal seguindo o palato e avance pelo esôfago em direção ao estômago. Quando a agulha inserida estiver pela metade ou dois terços do caminho no camundongo, injete os 100 microlitros de bactérias EHEC que contêm aproximadamente 10 elevado à nona UFCs de células. Após visualizar as células bioluminescentes de acordo com o protocolo descrito no texto, abra o Painel de Controle de Aquisição do software.Selecione luminiscência, fotografia e sobreposição. Defina o tempo de exposição como automático. Em seguida, defina o binning como médio.Defina o F/parada em um para luminescência e oito para fotografia. O F/parada controla a quantidade de luz recebida pelo detector CCD. Quando as amostras de camundongos estiverem prontas para a aquisição de imagens, clique em adquirir para iniciar a aquisição da imagem.Abra os dados da imagem que foram adquiridos e, em seguida, abra o painel da paleta de ferramentas. Selecione ferramentas de ROI, como o círculo, para definir a área bioluminescente nas imagens. Em seguida, utilizando o ícone de lápis, clique em medir ROIs para medir a intensidade da bioluminescência superficial.O painel de medição de ROI e os valores de quantificação serão exibidos. Em seguida, no canto esquerdo do painel de medições de ROI, use a configuração de medição para selecionar os valores/informações necessários. Caso contrário, clique em Exportar para exportar esta tabela de dados e salvá-la como um arquivo csv.Finalmente, utilize os valores da coluna de fluxo total p/s como a quantificação da intensidade da bioluminescência no arquivo csv. Como demonstrado nesta imagem, um sinal de bioluminescência forte foi observado em camundongos expostos à gavagem oral com inóculo de EHEC marcado com bioluminescência. Nesta figura, camundongos inoculados com EHEC selvagem EDL933 marcado com bioluminescência exibiram sinais bioluminescentes intensos mesmo dois dias após a infecção, sugerindo que o EHEC colonizou os hospedeiros dentro de dois dias.No entanto, camundongos infectados com uma cepa mutante de E.coli com defeitos nas lipopolissacarídeos não exibiram bioluminescência, sugerindo que um número reduzido ou nenhum bacilo colonizou esses animais. Para localizar as bactérias marcadas com bioluminescência, os intestinos de animais sacrificados foram imageados ex vivo. Os órgãos de camundongos infectados com EHEC marcado por bioluminescência mostraram um sinal significativo de bioluminescência no ceco e no cólon, indicando colonização nesses órgãos.Em contraste, camundongos infectados com um mutante de LPS apresentaram diminuição da bioluminescência no tecido intestinal, o que é consistente com a imagem in vivo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como conduzir o experimento utilizando o sistema IV para monitorar a colonização por EHEC em camundongos.

detection-enterohemorrhagic-escherichia-coli-colonization-murine-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Métodos de imagem de bioluminescência de infecções bacterianas em animais vivos são descritos. Patógenos são modificados para expressar luciferase permitindo que imagens de corpo inteiro óptico de infecções em animais vivos. Modelos animais podem ser infectados com patógenos luciferase expressar eo curso resultante de doença visualizadas em tempo real pela imagem de bioluminescência.

Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

Este artigo descreve a administração...

Imagem bacteriana Bioluminescent<em&gt; Em Vivo</em

Fonte: Valentine, M. E., et al. Geração de mutantes de deleção de genes em Pseudomonas aeruginosa e teste de atenuação de virulência em um modelo simples de infecção em camundongos. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o uso da bioluminescência para visualizar e comparar o comportamento in vivo de cepas bacterianas virulentas e atenuadas em camundongos. Ele descreve a preparação de suspensões bacterianas bioluminescentes e sua injeção intraperitoneal em camundongos. A cepa virulenta exibe...

Rastreando a dinâmica da infecção bacteriana em um camundongo usando bioluminescência

Fonte: Kuo, C., et al. Detecção de colonização entero-hemorrágica por Escherichia coli em hospedeiro murino por sistema de bioluminescência in vivo não invasivo. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra a preparação de uma suspensão de Escherichia coli entero-hemorrágica que expressa luciferase a partir de estoque congelado para uso como inóculo oral em modelos animais. Isso permite o rastreamento bioluminescente em tempo real da colonização intestinal durante estudos de infecção in vivo.

Preparação de inóculo de Escherichia coli enterohemorrágica bioluminescente

Fonte: de Vries, C. R., et al., Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de feridas por Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra uma técnica de imagem bioluminescente para monitorar a progressão da infecção bacteriana em um modelo de camundongos vivo. Bactérias patogênicas modificadas com o sistema repórter luxABCDE emitem luz no local da infecção, permitindo a visualização de bactérias metabolicamente ativas. Ao imagear o camundongo ao longo do tempo, os...

Imagem por Bioluminescência de Infecções Bacterianas em Camundongos

Fonte: Seman, B. G., et al. Um modelo de imagem neonatal para sepse bacteriana gram-negativa. J. Vis. Exp. (2020)O vídeo demonstra um modelo neonatal de camundongo para estudar infecção sistêmica usando bactérias bioluminescentes encapsuladas. Filhotes neonatais são injetados com suspensões bacterianas de alta ou baixa dose e retornados à mãe para cuidados pós-natais. As bactérias encapsuladas escapam da detecção imune precoce, se espalham sistêmicamente e são visualizadas ao longo do tempo por...

Modelagem da Infecção em Camundongos Neonatais Usando Bactérias Bioluminescentes Encapsuladas

Fonte: Valentine, M. E., et al., Geração de mutantes de deleção gênica em quadro em Pseudomonas aeruginosa e Teste para Atenuação de Virulência em um Modelo Simples de Infecção em Camundongo. J. Vis. Experiência (2020)Este vídeo demonstra o uso de uma abordagem de imagem baseada em bioluminescência para monitorar infecção bacteriana em um modelo de camundongo vivo. Imagens bioluminescentes e por raios X sequenciais permitem visualização em tempo real e localização anatômica da infecção...

Imagem em tempo real de infecção bacteriana em um modelo de camundongo usando bioluminescência

Fonte: Luyts, N., et al. Acompanhamento longitudinal de infecções do trato urinário e seu tratamento em camundongos usando imagem por bioluminescência. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra a indução e o rastreamento da infecção do trato urinário em um modelo camundongo usando E. coli bioluminescente injetada na bexiga, onde ocorrem adesão, invasão bacteriana e replicação intracelular. A luz emitida pelo operon bioluminescente serve como marcador em tempo real da carga bacteriana durante a...

Visualização da Infecção do Trato Urinário em um modelo de camundongo usando bioluminescência

De imagem multi-modalidade é uma abordagem útil para estudar a colonização bacteriana em modelos de animais pequenos. Este protocolo descreve a infecção de camundongos com...

4D Multimodalidade de imagens de<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecções em Ratos

Este manuscrito descreve a administração intravesical de bactérias uropatômicas com um operon lux para induzir uma infecção do trato urinário em camundongos e posterior análise longitudinal in vivo da carga bacteriana usando imagens de bioluminescência.

Acompanhamento longitudinal de infecções do trato urinário e seu tratamento em camundongos usando bioluminescência imagem

O parto prematuro (parto &lt; 37 semanas) é um problema de saúde global urgente com opções de prevenção e tratamento abaixo do ideal. Apresentamos um modelo de camundongo de parto prematuro induzido por infecção bacteriana vaginal ascendente e descrevemos como analisar a morbidade e mortalidade neonatal resultante.

Modelagem de infecção vaginal ascendente, parto prematuro e morbidade neonatal em camundongos

Aprenda a detectar colonização de EHEC em camundongos usando bioluminescência in vivo não invasiva. Este método permite monitorar a presença bacteriana em tempo real sem sacrificar os animais, facilitando estudos de patogenicidade.

Deteção de colonização Enterohemorrhagic Escherichia Coli murino Host pelo sistema não-invasivo na Vivo bioluminescência

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