Name: Derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Aprenda a derivar linhas de células-tronco embrionárias de blastocistos de rato com alta eficiência usando fibroblastos de pele humana como células alimentadoras. Este protocolo simplificado facilita pesquisas em medicina regenerativa.

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Agradecemos Jonatan Lucas pela sua assistência técnica com a cultura de pilha do alimentador, serviço Estabulari de la UAB para cuidados com animais e Domènec Martín para gravar o vídeo. Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Economia y AGL2014 competitividade-52408-R e a Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC é beneficiário de uma bolsa de PIF-UAB.

o uso dos animais descritos nas seções abaixo foi aprovado pelo Comitê de ética em pesquisa humana da Universitat Autònoma de Barcelona e Animal e pelo departamento d &#39; Agricultura, Ramaderia, Pesca eu Alimentació da Generalitat de Catalunya (protocolo #8741).
 1. armazenamento e inativação de célula alimentador Nota: fibroblastos humanos prepúcio (HFF-1) foram previamente congelados em 1 mL de solução de congelação composta de 90% soro Fetal bovino (FBS) e 10% de dimetil sulfóxido ( DMSO) e armazenados em nitrogênio líquido até uso.
<ol><li>Descongelar um frasco criogênico do HFF-1 (1 mL) mergulhando o frasco em banho maria a 37 ° C.</li>
	<li>Adicionar o conteúdo descongelado do frasco criogênico para pré-aquecido Dulbecco &#39; s Modified Eagle &#39; s médio (DMEM) suplementado com 10% FBS tornar um 01:10 diluição.</li>
	<li>As células diluídas (10 mL) de sementes num balão T75 e cultura-los a 37 ° C e 5% de CO 2.</li>
	<li>No dia seguinte, mudar o meio para eliminar os restos de DMSO. Retire o meio e adicione 10 mL de DMEM pré-aquecido suplementado com 10% FBS.</li>
	<li>Cultura os HFFs e mudar o meio cada 48 h até a cultura atinge o estágio confluente. Isto pode demorar cerca de 7 a 10 dias.</li>
	<li>Para preparar a solução de inactivação, diluir mitomicina C em DMEM suplementado com 10% FBS em uma concentração final de 10 µ g/mL. Incubar as células com a solução de inativação por 3 h a 37 ° C e 5% de CO 2.</li>
	<li>Remover a solução de inactivação e enxágue as células três vezes com 2 mL de Hanks equilibrado sal solução (HBSS) para eliminar os restos de mitomicina C.</li>
	<li>Para desprender as células inactivadas, adicionar 1 mL de solução de tripsina-EDTA pré-aquecido e incubar durante 5 min a 37 ° C e 5% de CO 2.</li>
	<li>Observar as células sob um microscópio invertido para garantir que eles são desanexados (10 x objetivo com 0,3 abertura numérica ou nd). Se não forem, incube-los por mais uns minutos a 37 ° C e 5% de CO 2. Verifique as células novamente sob o microscópio invertido.</li>
	<li>Pipetar a solução com uma pipeta Pasteur para dissociar as touceiras de celular.</li>
	<li>Neutralizar a solução enzimática adicionando 4 mL de DMEM suplementado com 10% FBS e ressuspender.</li>
	<li>Tomar uma alíquota da suspensão celular e faça uma diluição de 1: 100 em HBSS. Para determinar o número de células, carregar 10 µ l da diluição em um Neubauer &#39; câmara de s. Contar as células, localizadas em uma das grandes praças da câmara sob um microscópio invertido (objetivo de x 20 com um at 0.45).
	<ol><li>Repetir a contagem em um total de quatro quadrados grandes. Calcular o número total de células (N) como N = número médio de células contadas x volume total x diluição x 10 4.</li>
	</ol></li> <li>Centrifugar o resto da amostra durante 5 min à 200 x. g. descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com o congelamento solução em uma concentração de 10 6 células / mL.</li>
	<li>Alíquota a suspensão em frascos criogênicos com 10 6 células (1 mL) cada. Coloque os frascos criogênicos num recipiente frio e congelar a -80 ° C.</li>
	<li>No dia seguinte, conservar os frascos criogênicos em azoto líquido.</li>
</ol> 2. Cultura de pilha alimentador <ol><li>um a quatro dias antes de iniciar o processo de derivação, descongelar um frasco criogênico contendo 1 x 10 6 inativada HFF-1 células em um banho de água a 37 ° C.</li>
	<li>Fazer uma diluição de 1:6 do HFF-1 descongeladas em pré aquecido DMEM suplementado com 10% FBS e manter a temperatura a 37 ° C.</li>
	<li>Encha cada poço de uma placa de 4 com 500 µ l de gelatina previamente aquecido de 0,2% de pele suína e manter a placa a 37 ° C durante 10 min.</li>
	<li>Remover a 500 µ l de gelatina de poços e adicionar 500 µ l da diluição HFFs. Agitar suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme dos HFFs no fundo dos poços. Evite movimentos circulares, caso contrário, as células irão concentrar-se no centro do poço.</li>
	<li>Incubar a placa pelo menos 24 h a 37 ° C e 5% CO 2 para obter uma monocamada de HFFs inactivadas em cada poço.</li>
	<li>No dia seguinte, observar as células sob um microscópio invertido (objetivo de X 10 com 0,3 ND) e verifique se eles estão anexados e homogeneamente distribuídos. Mude o meio para eliminar os restos de DMSO. Remover o meio e adicione 500 µ l de DMEM pré-aquecido suplementado com 10% FBS.</li>
</ol> 3. Colheita de embriões e cultura <ol><li>quatro dias antes da colheita de embriões, administrar 5 IU de égua grávida &#39; gonadotropina do soro s por injeção intraperitoneal de ratos fêmeas de 6 a 12 semana. 
	Nota: Nós usamos fêmeas do 129S2 ou estirpes de B6CFAF1, embora as fêmeas de outras tensões do mouse podem ser usadas. No entanto, quando trabalhar com fêmeas de cepas não-permissivo (por exemplo, CBA), médio deve ser complementado com 2i como mencionado na etapa 4.2.</li>
	<li>Após 48 h, administrar 5 UI de gonadotrofina coriônica humana por injeção intraperitoneal e acasalar as fêmeas com os machos, pelo menos 8 semanas de idade, na proporção de 1:1. Separar as fêmeas os machos no dia seguinte.</li>
	<li>No dia anterior a colheita de embriões, preparar uma cultura de células de 35mm placa de Petri com vários 40 gotas de µ l de KSOMaag suplementado com 4 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) e encher o prato com óleo mineral para cobrir totalmente as gotas. Incubar o prato em 37 ° C e 5% CO 2 para equilibrar o meio.</li>
	<li>Para preparar pipetas de manipulação do embrião, aqueça a parte mais fina de um vidro com ponta longa pipeta Pasteur usando um bico de Bunsen. Depois de macio, tire-a da chama e separar as duas extremidades. Quebrá-lo para o comprimento desejado. O diâmetro interno na ponta deve ser de 100-150 µm.</li>
	<li>Eutanásia de ratos fêmeas por deslocamento cervical 45-48 h post-coitum (p.c.).</li>
	<li>Dissecar os ratos para expor na cavidade abdominal por um corte a pele com curva suave tesoura afiada e o peritônio com tesoura afiada em linha reta. Pegar um útero com fórceps, cortar o oviduto usando tesouras afiadas direto e colocá-lo no tampão Hepes CZB médio (HCZB) 13 a 37 ° C. Repita o processo para remover outro oviduto.</li>
	<li>Flush os ovidutos com uma seringa de 1 mL carregados com HCZB mantido no lugar por pinças de relojoeiro para coletar os embriões de 2 células. 
	Nota: Para preparar a tomada de agulha-lavagem uma agulha hipodérmica de 30g, corte a extremidade e à terra para uma ponta romba sobre uma pedra abrasiva.</li>
	<li>Usando o aparelho de pipeta de boca, pegar os embriões, lavá-los com HCZB e cultura-los a placa de cultura de embrião previamente preparado em 37 ° C e 5% de CO 2 até o estágio de blastocisto. Até 50 embriões podem ser cultivados em cada gota de 40 µ l. Monitorar o desenvolvimento do embrião cada 24 h sob um estereomicroscópio. 
	Nota: Como alternativa, os embriões podem ser coletados na fase de blastocisto para encurtar em vitro cultura de embriões. Neste caso, abater as fêmeas no dia 3.5-4.5 p.c., dissecar o útero. e nivelá-lo com HCZB.</li>
</ol> 4. Derivação de células-tronco <ol><li>preparação das placas de derivação <ol><li>no dia da semeadura de embrião, prepare o suporte de derivação, complementando o meio DMEM com 100 µM 2 β Mercaptoetanol, 1 x não-aminoácidos essenciais , 20% de substituição do soro e 10 3 U/mL LIF.</li>
		<li>Se desejar, adicione também 1 µM do inibidor MEK PD0325901 e 3 µM do inibidor GSK3 CHIR99021 para obter um meio de 2i.</li>
		<li>Levar a placa com a monocamada de HFFs inactivadas (passo 2.6) de 4 a incubadora. Remover o meio e adicionar 800 µ l de meio de derivação pré-aquecido a cada poço. Devolve a chapa para a incubadora.</li>
	</ol></li> <li>Remoção de Zona pelúcida e embrião semeadura <ol><li>preparar uma cultura celular de 35 mm placa de Petri com gotas de três 30 µ l de ácido Tyrode &#39; s solução 14 e gotas de três 30 µ l de meio de derivação. Cubra as gotas com óleo mineral e mantenha o prato em 37 ° C.</li>
		<li>Retirar o prato de cultura de embrião da incubadora. Um por um, transferir os blastocistos de gotas a cultura para um ácido Tyrode &#39; gota de solução de s usando uma pipeta de manipulação do embrião. Se possível, selecione apenas os blastocistos expandidos para iniciar o processo de derivação.</li>
		<li>Monitor a zona pelúcida digestão sob o microscópio. Assim que a zona pelúcida desaparece, transferência de blastocisto para uma queda média de derivação para lavar o ácido Tyrode &#39; solução de s.</li>
		<li>Levar o prato de derivação 4-poço de incubadora e semente de uma zona livre de blastocisto no alimentador de células em cada poço.</li>
		<li>Retornar a chapa 4-poço de derivação para a incubadora e a cultura em 37 ° C e 5% de CO 2.</li>
	</ol></li> <li>Crescimento de células-tronco de monitoramento e médio mudam <ol><li>monitorar as culturas cada 24 h sob um microscópio invertido (objetivo de X 20 com at 0.45). É importante observar se há sinais de diferenciação de células-tronco, como as células inchadas refractivas circundante a consequência natural ou mesmo empurrando o alimentador células lado.</li>
		<li>Todos os outros dias, alterar o meio de cultura. Retirar a placa de 4 a incubadora, remover o meio de cada poço e adicionar 800 µ l de meio de derivação pré-aquecido suplementado com LIF e 2i, se usado. Manter a cultura até Humanisme é observados (6-8 dias).</li>
	</ol></li></ol> 5. Manutenção e cultura de células-tronco <ol><li>preparar Kolle, como alças e pipetas de manipulação de células-tronco. Siga os passos 3.4 para preparar pipetas de manipulação de células-tronco com um diâmetro interno na ponta de 250-300 µm. Use a outra parte da pipeta Pasteur puxada para preparar o cabo de Kolle, como. Aqueça e moldá-la até a obtenção de um gancho.</li>
	<li>Levar o prato de cultura 4-bem fora da incubadora e localize a consequência sob um estereomicroscópio. Use a alça para afastar as células diferenciadas e os alimentadores que cercam a consequência. 
	Nota: Para evitar eventual diferenciação da consequência, é importante remover todas as células diferenciadas da borda da consequência a.</li>
	<li>Aspire a consequência de uma pipeta de manipulação de células-tronco e coloque-o em um prato novo em uma gota de tripsina-EDTA 50 µ l.</li>
	<li>Usar um bisturi para cortar a consequência em várias partes a fim de desagregá-lo tanto mecanicamente e enzimaticamente.</li>
	<li>Imediatamente, transfira os fragmentos de consequência em uma gota fresca de proveniência média para neutralizar a ação da tripsina.</li>
	<li>Transferir os fragmentos de consequência natural para uma nova placa de 4 com uma monocamada de alimentadores. Transferência de até 10 fragmentos por alvéolo e cultura-los com proveniência média em 37 ° C e 5% de CO 2.</li>
	<li>Manter as culturas de células-tronco, como pelo menos seis semanas antes de considerar a linha mESC estabelecida. Alterar o meio de todos os outros dias e subcultura-los uma vez por semana.</li>
</ol>

<ol><li>Biswas, A., Hutchins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells.</a> Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).</li>
<li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+stem+cell+states%3A+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).</li>
<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells%3A+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).</li>
<li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prot%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Smith, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pluripotential+embryonic+stem+cell+differentiation+by+purified+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.</a> Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).</li>
<li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).</li>
<li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).</li>
<li>Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+germline+transmission+of+mouse+embryonic+stem+cells+grown+in+synthetic+serum+in+the+absence+of+a+fibroblast+feeder+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer.</a> Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Wakayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+establishment+of+mouse+embryonic+stem+cell+lines+from+single+blastomeres+and+polar+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+%28Dayton%2C+Ohio%29%22%5BJournal%5D)">Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).</li>
<li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2760894">An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro.</a> J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).</li>
<li>Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).</li>
<li>Lee, K. H. <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/pluripotent-stem-cells/conditions-and-techniques-for-mouse-embryonic-stem-cell-derivation-and-culture">Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture.</a> Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+foreskin+fibroblast+produces+interleukin-6+to+support+derivation+and+self-renewal+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).</li>
<li>Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+generation+of+C57BL%2F6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).</li>
<li>Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+medium+composition+and+serum+or+serum+replacement+concentration+influences+on+the+maintenance+of+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells.</a> Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).</li>
<li>Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+difference+in+establishment+of+mouse+embryonic+stem+%28ES%29+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines.</a> Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).</li>
<li>Gonzalez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+culture+conditions+support+distinct+states+associated+with+different+developmental+stages+and+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency.</a> Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Embora a derivação de linha mESC é um procedimento bem conhecido rotineiramente utilizado em muitos laboratórios, sua eficiência não é sempre tão alta quanto o esperado devido os múltiplos fatores que podem perturbar a manutenção da pluripotência. No presente artigo mostramos, passo a passo, como estabelecer linhas de mESC com alta eficiência usando um protocolo simples e confiável. Estas eficiências são semelhantes aos relatados na literatura.
Para garantir a máxima eficiência, é importante c...

Células-tronco embrionárias (ESC) são pluripotentes células derivadas de embriões pré-implantação, que mantêm a capacidade de renovar o Self ou diferenciar sob condições específicas1. Baseado sobre essas propriedades, ESC tornaram-se uma ferramenta útil para a medicina regenerativa, modelagem de doença e de estudos engenharia de tecido2.
ESC foram derivados pela primeira vez embriões pré-implantação do mouse, originando linhas ESC (mESC) rato com sucesso baixa3,4. Durante anos, a eficiência de derivação permaneceu baixa devido à dificuldade de manutenção da pluripotência em vitro. Além disso, a presença de alimentador células5, que melhoram a eficiência de derivação, promover a fixação da colônia e realçar estabilidade espectofotômetro6, várias modificações das protocolo conduzir a uma melhoria na manutenção da pluripotência. As mais importantes foram a adição de fator inibitório de leucemia (LIF) mESC meio de cultura7,8, a utilização de embriões da 129S2 fundo permissiva9 e a cultura dos mESC com suplementado com definido soro, livre de potenciais fatores de diferenciação10. Mais recentemente, evidências convincentes tem mostrado que a adição de um coquetel de dois moduladores da pequeno-molécula de vias de sinalização para o meio de cultura de mESC (conhecido como 2i) é melhor manter a pluripotência. O cocktail de 2i consiste numa combinação de inibidor MEK PD0325901, que reduz os sinais de diferenciação por inibição da via de quinase (MAPK) proteína mitogen-ativado, e o inibidor de GSK3β CHIR99021, que aumenta a sobrevivência da pilha de baixa densidade Ativando o Wnt caminho11.
No presente artigo, descrevemos um protocolo simples derive eficientemente mESC linhas de blastocistos de rato. Seguimos os procedimentos padrão, cultivo de embriões de estirpes permissivas em células alimentador suplementado de derivação com LIF e uma substituição de soro12. Seguir este protocolo, mESC linhas pode ser derivada com eficiências equivalentes às obtidas no meio de 2i. Apesar disso, 2i pode ser adicionado para evitar possíveis problemas com manutenção de pluripotência, ou quando se trabalha com cepas não-permissiva.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>2-&beta;-mercaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 4 poços</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Solução ácida de Tyrode&nbsp;</td><td>Caseiro</td><td></td><td>Ver receita em Nagy et al, 2003. Para armazenamento de curto prazo (até 1 mês), mantenha-o a 4 ° C. Alternativamente, para armazenamento de longo prazo, mantenha-o a -20 ° C. Se a eficiência da solução diminuir, ela deve ser acidificada pela adição de uma pequena gota de HCl 1M.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-rato de frango, sondas moleculares Alexa Fluor 488</td><td>- Invitrogen</td><td>A-21200</td><td>diluição 1:500. Anticorpo secundário para anticorpos de camundongo Oct4, Tuj1, &alpha;SMA e AFP.&nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR990212</td><td>Axônio Medchem&nbsp;</td><td>1386</td><td>Reconstituir com 2,15 ml de DMSO por cada mg de pó, para obter uma solução-mãe de 1 mM. Alíquota no volume desejado e armazene a -20&C. Evite ciclos de congelamento e descongelamento.&nbsp;</td></tr><tr><td>CryoTube</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>3754518</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41640</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>BioWest</td><td>L0107</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td>Inative-o antes de usar aquecendo por 30 minutos a 56&ordm;C. Alíquota e armazene a -20&ordm; C</td></tr><tr><td>Agulha de lavagem</td><td>BD&nbsp;</td><td>304000</td><td>Corte a ponta da agulha e triture até obter uma ponta romba em uma pedra abrasiva</td></tr><tr><td>Gelatina de pele suína</td><td>Fluka</td><td>48724</td><td>Diluir a 0,2% em água destilada e autoclavar. Cada diluição pode ser usada por um mês.</td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra, sondas moleculares Alexa Fluor 594</td><td>- Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>diluição 1:500. Anticorpo secundário para o anticorpo de coelho Sox2.&nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>BioWest</td><td>L0611</td><td></td></tr><tr><td>CZB&nbsp; Tamponado com Hepes</td><td></td><td></td><td>Caseiro Ver composição em Chatot et al, 1989</td></tr><tr><td>Gonadotrofina coriônica humana</td><td>Divasa-Farmavic</td><td>Veterin-Corion 3000 UI</td><td>Diluir em NaCl 0,9% a 50 UI / ml. Alíquota em 1 ml e armazenar a -20&ordm; C por até dois meses. Depois de descongelado, não congele novamente.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fibroblastos de prepúcio humano</td><td>ATCC</td><td>ATCCSCRC-1041</td><td>Para armazenamento a longo prazo, recomenda-se armazená-los em nitrogênio líquido.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; 10828-028</td><td>Fotossensível. Recomenda-se alíquota em pequenos volumes, como 10 ml, e armazená-la a -20&ordm; C (verifique a data de validade). Evite ciclos de congelamento e descongelamento.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>KSOMaag Evolve</td><td>Zenith Biotech</td><td>ZEKS-050</td><td>Suplemento com 4 mg/ml BSA. Equilibre em 37&ordm; C e 5% de CO2 por dia antes do uso.</td></tr><tr><td>Fator Inibidor de Leucemia</td><td>Merk Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos&nbsp;</td><td>Charles River/Harlan</td><td></td><td>Recomenda-se o uso de camundongos de uma cepa permissiva em termos de derivação mESC (como 129S2 ou C57BL). No entanto, as linhagens endogâmicas são menos eficientes na produção de embriões. Portanto, recomenda-se o uso de uma cepa híbrida, como 129S2 x C57BL ou B6CBAF1 para aproveitar o vigor híbrido.</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Embrião testado. Fotossensível.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Serva</td><td>2980501</td><td>Reconstituir o pó com água MilliQ a 0,5 mg/ml. Armazenar a 4&ordm; C protegido da luz. Atenção, é prejudicial e suspeito de causar câncer.</td></tr><tr><td>Anti-tubulina de camundongo &beta; III (Tuj1)</td><td>Biolegend</td><td>MMS-435P</td><td>diluição 1:500</td></tr><tr><td>Camundongo monoclonal anti-&alfa;SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>Diluição 1:200</td></tr><tr><td>Camundongo monoclonal anti-AFP</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1368</td><td>diluição 1:50</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti Oct3/4&nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>Sc-5279</td><td>Diluição 1:50</td></tr><tr><td>Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Life Technologies</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axônio Medchem&nbsp;</td><td>1408</td><td>Reconstituir com 2,08 ml de DMSO por cada mg de pó, para obter uma solução-mãe de 1 mM. Alíquota no volume desejado e armazene a -20&C. Evite ciclos de congelamento e descongelamento.</td></tr><tr><td>Placa de Petri (35mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri (60mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Soro de égua grávida gonadotrofina</td><td>Foligon</td><td>Foligon-1000 UI</td><td>Diluir em NaCl 0,9% a 50 UI/ml. Alíquota em 1 ml e armazenar a -20&ordm; C por até dois meses. Depois de descongelado, não congele novamente.&nbsp;</td></tr><tr><td>Coelho policlonal anti-Sox2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5603</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>T75 falcão</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 10x</td><td>BioWest</td><td>X0930</td><td>Diluir 1:10 em HBSS para obter uma solução 1x</td></tr></tbody></table>

derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivação de células-tronco embrionárias (mESC) do mouse é o processo pelo qual pluripotentes linhagens celulares estabelecidas dos embriões pré-implantação. Estas linhas mantêm a capacidade de renovar o Self ou diferenciar sob condições específicas. Devido a essas propriedades, o mESC são uma ferramenta útil na medicina regenerativa, modelagem de doença e estudos de engenharia de tecidos. Este artigo descreve um protocolo simples para obter linhas de mESC com eficiências de alta derivação (60-80%) pelo cultivo de blastocistos de estirpes de rato permissiva em células alimentador definido suplementado com fator inibitório de leucemia. O protocolo também pode ser aplicado derive eficientemente mESC linhas de cepas não-permissiva do mouse, pela simples adição de um coquetel de dois inibidores da pequeno-molécula ao meio de derivação (2i médio). Os procedimentos detalhados sobre a preparação e a cultura de células de alimentador, coleta e cultura de embriões de rato e derivação e cultura das linhas mESC são fornecidos. Este protocolo não requer equipamento especializado e pode ser realizado em qualquer laboratório com conhecimentos de cultura de pilha mamífera básica.

Na sequência deste protocolo, mais 95% da formação de consequência deve ser alcançado após a primeira semana da cultura (figura 1A). Estabelecimento de linhas de mESC após seis passagens é variável entre repetições experimentais, com uma média de 60-80% de sucesso. A adição de 2i não melhorar significativamente os resultados ao trabalhar com cepas de rato permissivas, tais como aqueles com antecedentes de 129S2, mas é necessário quando se trabalha com cepas n...

Este artigo descreve um protocolo para eficientemente derivar e cultura linhas de células-tronco pluripotentes de embriões de rato no estágio de blastocisto.

Derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

As células-tronco são células pluripotentes e especializadas caracterizadas por sua autorrenovação de longo prazo e pela capacidade de gerar células diferenciadas dos três folhetos germinativos sob certas condições. Devido a essas propriedades, as células-tronco possuem um grande potencial na medicina regenerativa, modelagem de doenças e engenharia animal. Por anos, linhagens de células-tronco embrionárias destinadas a fins de pesquisa foram derivadas principalmente de embriões de camundongo, mas, em geral, as eficiências de derivação alcançadas têm sido baixas.Neste vídeo, mostramos um protocolo simples para derivar linhagens de células-tronco embrionárias de camundongo utilizando condições padrão, que fornece eficiências de derivação razoavelmente altas, comparáveis às obtidas ao se usar moduladores de vias de sinalização, como o 2i. Neste protocolo, utilizaremos fibroblastos de pele fetal humana como células de suporte para a derivação e cultura de ESCs. Antes de iniciar o processo de derivação de ESCs, é necessário inativar as células de suporte.Primeiro, pegue um tubo criogênico de fibroblastos de prepúcio humano armazenado em nitrogênio líquido e descongele-o mergulhando o tubo em banho-maria a 37 graus C. Após o descongelamento, dilua o conteúdo em DMEM suplementado com soro bovino fetal. Semee a diluição em um frasco Falcon e cultive até atingir o estágio de confluência. Em seguida, para inativar os fibroblastos, dilua a mitomicina C em DMEM suplementado com soro bovino fetal e incube as células por três horas nesta solução de inativação.Em seguida, remova a solução de inativação e lave as células três vezes com solução salina balanceada de Hanks para eliminar os resíduos de mitomicina C. Para destacar as células alimentadoras inativadas, adicione um mililitro de solução de tripsina-EDTA e incube as células por cinco minutos. Depois disso, observe as células em um microscópio invertido para garantir que tenham sido destacadas do frasco de cultura.Em seguida, pipete as células com uma pipeta de Pasteur para dissociar os agregados celulares e neutralize a solução enzimática adicionando quatro mililitros de DMEM suplementado com soro bovino fetal. Retire uma pequena alíquota, dilua em solução salina e determine o número de células utilizando uma câmara de Neubauer. Em paralelo, centrifugue o restante da amostra.Descarte o sobrenadante e dilua o precipitado na solução de congelamento até uma concentração final de um milhão de células por mililitro. Aliquote a suspensão em frascos criogênicos. E, finalmente, coloque os frascos criogênicos em um recipiente de congelamento e os mantenha a menos 80 graus Celsius. No dia seguinte, armazene-os em nitrogênio líquido.Um a quatro dias antes de iniciar o processo de diferenciação, retire um criotubo contendo células alimentadoras inativadas armazenadas em nitrogênio líquido e descongele-o em banho-maria a 37 graus C. Em seguida, dilua as células em DMEM pré-aquecido suplementado com soro bovino fetal e pipete suavemente para garantir uma mistura homogênea. Adicione 500 microlitros de solução de gelatina pré-aquecida a cada poço de uma placa de quatro poços e mantenha-a a 37 graus C por 10 minutos. Imediatamente após, remova a gelatina de cada poço.Adicione 500 microlitros da diluição das células alimentadoras a cada poço e balance suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme das células alimentadoras no fundo dos poços. Evite movimentos circulares, pois isso concentraria as células no centro do poço. Em seguida, coloque a placa no incubador a 37 graus e 5% de dióxido de carbono por pelo menos 24 horas.No dia seguinte, observe as células em um microscópio invertido e verifique se estão aderidas e bem distribuídas. Por fim, troque o meio das células alimentadoras por DMEM pré-aquecido suplementado com soro bovino fetal para remover resíduos de DMSO. Antes da coleta dos embriões, induza a superovulação em fêmeas de camundongo por meio de injeção intraperitoneal de cinco unidades internacionais de gonadotrofina de soro de égua prenhe e gonadotrofina coriônica humana, com intervalo de 48 horas entre elas.Acasale as fêmeas com machos e separe-os 24 horas depois. Para coletar embriões em estágio de duas células, eutanazie as fêmeas 48 horas após o coito, dissecione os camundongos fêmeas para obter os ovidutos e uma pequena porção dos cornos uterinos e coloque-os em uma placa com meio CZB tamponado com HEPES. Em seguida, sob microscópio estereoscópico, lave os ovidutos um a um com meio CZB tamponado com HEPES para coletar os embriões.Transfira os embriões de dois pronúcleos para uma placa de cultura preparada no dia anterior com várias gotas de meio de cultura embrionária cobertas com óleo mineral. Mantenha os embriões no incubador até o estágio de blastocisto. Monitore o desenvolvimento embrionário a cada 24 horas.Espera-se que os embriões alcancem a fase de blastocisto 48 horas após o início do cultivo in vitro. Se possível, selecione apenas blastocistos expandidos para iniciar o processo de derivação. No dia da semeadura dos embriões, prepare o meio para derivação de células-tronco.Adicione o fator inibidor de leucemia, ou LIF, ao DMEM suplementado com 2-mercaptoetanol, aminoácidos não essenciais e substituto sérico KnockOut. Se desejado, adicione um inibidor de MAPC e um inibidor de GSK-3 para obter um meio 2i. Retire a placa de quatro poços com a monocamada de células de suporte do incubador.Remova o meio e adicione 800 microlitros do meio de diferenciação recém-preparado. Antes de semear os blastocistos sobre as células de apoio, a zona pelúcida deve ser removida. Para tanto, transfira um embrião da placa de cultura para uma gota de solução ácida de Tyrode e mantenha-o ali até que a zona pelúcida seja digerida.Certifique-se de que a zona pelúcida foi completamente removida ajustando o foco e o contraste do microscópio estereoscópico. Em seguida, lave o embrião sem zona em várias gotas de meio de derivação e semeie-o em uma monocamada de células de suporte. Repita o processo com os demais embriões.Cultive a placa a 37 graus C e 5% de dióxido de carbono. Monitore as culturas a cada 24 horas sob um microscópio invertido para avaliar seu crescimento e identificar possíveis sinais precoces de diferenciação, como células inchadas e refratéis ao redor da expansão ou até mesmo deslocando as células de suporte. Troque o meio da cultura a cada dois dias.Para tanto, retire a placa de quatro poços do incubador, remova o meio de cada poço e adicione 800 microlitros de meio de diferenciação pré-aquecido, suplementado com LIF e 2i, se utilizado. Retorne as placas ao incubador e mantenha a cultura até que sejam observados crescimentos externos. De seis a oito dias após o semeio dos blastocistos, deve-se observar um crescimento externo, que precisa ser subcultivado.Para este procedimento, são necessários pipetas com pontas semelhantes a alças e pipetas para manipulação de células-tronco. Para fabricá-las, pegue uma pipeta de Pasteur com ponta longa e aqueça a parte mais fina usando um bico de Bunsen. Uma vez macia, retire a pipeta da chama e puxe as duas extremidades em sentidos opostos até que se separem.Utilize a parte mais grossa como pipeta para manipulação de células-tronco. Aqueça a ponta da parte mais fina e modele-a até obter um gancho, para preparar uma alça semelhante a uma alça de cull. Para repicar o crescimento celular, localize-o sob o microscópio estereoscópico.Com a ajuda do cabo, afaste as células diferenciadas que envolvem o crescimento. Para evitar uma diferenciação eventual, é importante ser rigoroso ao remover as células diferenciadas da borda do crescimento. Usando uma pipeta de manipulação de células-tronco, aspire o crescimento e coloque-o em uma gota de solução de tripsina-EDTA previamente aquecida.Com a ajuda de um bisturi, corte o crescimento em vários pedaços para desagregá-lo mecanicamente e enzimaticamente. Recupere os fragmentos de crescimento e coloque-os em uma gota de meio de derivação pré-aquecido para neutralizar a ação da tripsina. Por fim, semeie os fragmentos de crescimento em uma placa de quatro poços com uma monocamada de células alimentadoras e cultive-os em meio de derivação a 37 graus C e 5% de dióxido de carbono.Os cultivos com características de células-tronco devem ser mantidos por pelo menos seis semanas antes que uma linhagem de células-tronco embrionárias possa ser considerada estabelecida. Durante esse período, é necessário trocar o meio a cada dois dias e subcultivá-los uma vez por semana. À medida que os números de passagem aumentam, a morfologia das colônias muda progressivamente de uma forma arredondada para uma morfologia mais alongada e achatada.Após seis passagens, linhagens de ESC de camundongo expressam constitutivamente marcadores de pluripotência, como Oct 4 e Sox 2. Além disso, após induzir a diferenciação in vitro de ESC cultivando-as em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal e sem células de apoio, marcadores de diferenciação representativos dos três folhetos germinativos podem ser detectados por imunofluorescência. Aqui, mostramos a detecção da proteína anti-tubulina beta-3 como marcador do ectoderma, da actina alfa do músculo liso para o mesoderma e da alfafetoproteína para o endoderma.Após seguir este procedimento simples, células-tronco embrionárias podem ser derivadas de blastocistos de camundongo com eficiências que variam de 60% a 78%. Ao realizar este procedimento, é importante controlar as células diariamente ou em dias alternados, pois os tempos fornecidos aqui são apenas ilustrativos. Se as colônias de células-tronco embrionárias crescerem em excesso, elas ficam mais escuras devido ao acúmulo celular e tendem a se diferenciar mais facilmente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão da derivação e cultura de células-tronco embrionárias de camundongo utilizando condições padrão.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este protocolo detalhes a derivação de células-tronco hematopoéticas para transplante de células-tronco embrionárias de rato (ESC) e sua posterior injeção em camundongos letalmente irradiados destinatário. Brevemente, ESC são diferenciados como corpos embrióides, que depois são infectadas com HoxB4 retroviral e co-cultivados com células do estroma OP9 e citocinas hematopoiéticas.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A capacidade de células estaminais embrionárias humanas para a auto-renovar e diferenciar em todos os tipos de células do corpo sugere que eles são uma grande promessa para aplicações médicas e como ferramenta de pesquisa para abordar questões fundamentais no desenvolvimento e na doença. Aqui, fornecemos uma concisa, protocolo passo a passo para a derivação de células estaminais embrionárias humanas a partir de embriões pelo isolamento immunosurgical da massa celular interna.

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

A capacidade de células germinais embrionárias de se diferenciarem em células germinativas primordiais durante estágios iniciais de desenvolvimento é um modelo perfeito para abordar nossa hipótese sobre o câncer e infertilidade. Este protocolo mostra como isolar células germinativas primordiais das gônadas em desenvolvimento 10,5-11,5 dias após a embriões de camundongos coitum.

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Neste vídeo, demonstramos o isolamento de blastocistos mouse ea derivação de células-tronco de blastocistos trofoblasto. Descrevemos também condições para a manutenção da propriedade de célula-tronco, bem como a indução de diferenciação em cultura.

Derivação de células-tronco do rato trofoblasto de blastocistos

Gerando pluripotentes induzidas de células-tronco (IPSC) produz linhas de linhas de diferentes potencial de desenvolvimento, mesmo quando eles passam por testes padrão pluripotência. Aqui nós descrevemos um protocolo para produzir ratos derivadas inteiramente de iPSCs, que define as linhas iPSC como possuindo pluripotência...

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Um método simples para obter e manter a haste espermatogónias e linhas de células progenitoras a partir de ratos adultos, é aqui apresentada. O método utiliza células de alimentação provenientes do compartimento de células somáticas do testículo do rato adulto. Esta técnica é aplicável a linhagens de camundongos comuns, incluindo transgênico, knock-out, e bater-nos camundongos.

Enriquecimento de série-tronco de esperma e células progenitoras (SSC) em Cultura para Derivação de longo prazo Adultos Linhas rato SSC

Nos últimos anos, a formação de células germinativas, utilizando métodos de cultura in vitro tem sido demonstrada utilizando vários tipos diferentes de células estaminais somáticas. Este artigo irá apresentar visualmente a diferenciação de células-tronco derivadas de células de rato recém-nascidos oócito-como iniciais.

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As células-tronco embrionárias de camundongos podem ser diferenciadas em células T in vitro usando o sistema de co-cultura OP9-DL1. O sucesso neste procedimento requer atenção cuidadosa à manutenção do reagente/célula e às principais etapas sensíveis à técnica. Aqui, discutimos esses parâmetros críticos e fornecemos um protocolo detalhado para incentivar a adoção dessa tecnologia.

Derivação de células T In Vitro De Mouse Células-Tronco Embrionárias

Este protocolo apresenta um método para realizar, de uma única célula quantitativa análise in situ da expressão de proteínas para o estudo especificação das linhagens em embriões de rato pré-implantação. Os procedimentos necessários para a coleta de blastocistos, toda montagem de detecção de imunofluorescência de proteínas, a imagem latente de amostras em um microscópio confocal, e segmentação nuclear e análise de imagem são descritos.

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

Este artigo tem como objetivo demonstrar o uso de células-tronco embrionárias haploides partehenogenéticas como um substituto para o esperma para a construção de embriões semi-clonados.

Aplicação de Células-Tronco Embrionárias Haploid Partehenogenéticas do Rato como um substituto do esperma

Aprenda a derivar linhas de células-tronco embrionárias de blastocistos de rato com alta eficiência usando fibroblastos de pele humana como células alimentadoras. Este protocolo simplificado facilita pesquisas em medicina regenerativa.

Derivação das linhas de células-tronco de embriões pré-implantação do rato

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