Na Vivo Imagiologia multimodal e análise do modelo de neovascularização coroide de induzida por Laser de Mouse

Aqui, apresentamos a utilidade da imagem longitudinal na vivo na sequência de alterações morfológicas da neovascularização de coroide do laser-induzida em camundongos.

Os processos neovasculares são uma característica de várias patologias oculares prevalentes. Mais proeminentemente, degeneração macular exsudativa relacionada à idade ou DMRI úmida para retinopatia diabética proliferativa curta e retinopatia da prematuridade. Juntos, esses distúrbios são responsáveis pela maioria dos casos de cegueira legal em todo o mundo e estão associados a complicações oculares adicionais, como hemorragia vítrea e glaucoma neovascular.

No entanto, apesar de sua prevalência, as opções terapêuticas para distúrbios neovasculares oculares são limitadas. O padrão atual de tratamento para neovascularização associada à DMRI e retinopatia diabética proliferativa é a injeção intravítrea de anticorpos humanizados direcionados contra um mediador crítico da angiogênese e neovascularização, o fator de crescimento endotelial vascular ou VEGF. No entanto, apesar da eficácia em interromper a progressão da doença e melhorar a visão funcional, as injeções intravítreas são caras e estão longe de ser isentas de riscos.

As complicações podem incluir infecções, endoftalmite, descolamento de retina e hemorragia ocular. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolvimento de novas opções de tratamento que sejam eficazes, seguras e menos dispendiosas. A fim de avançar no desenvolvimento de medicamentos para distúrbios neovasculares, os modelos de pequenos animais são de importância crítica.

Esses modelos precisam ser reprodutíveis, ter leituras e desfechos estabelecidos e validados e, idealmente, usar um composto de referência clinicamente relevante para servir como controle positivo. Neste protocolo, apresentaremos a neovascularização coroidal de camundongo, ou modelo CNV, que é um dos modelos mais comumente empregados tanto para o estudo dos mecanismos fisiopatológicos que contribuem para a CNV quanto para o desenvolvimento de novos agentes antineovasculares. No modelo CNV, a membrana de Bruch é rompida usando um laser de argônio.

Iniciando assim processos neovasculares originados da coróide. O emprego de imagens longitudinais in vivo por tomografia de coerência óptica de domínio espectral, ou SD-OCT para abreviar, e angiografia fluoresceínica, fornece um meio de acompanhar a proliferação e regressão da CNV. E, assim, avaliar a eficácia e o curso do tempo de novas intervenções farmacêuticas.

Além disso, avanços recentes no processamento de imagens permitem a segmentação automatizada para a medição da espessura da retina, fornecendo uma metodologia livre de viés do investigador para avaliar a presença de edema. Aqui, discutiremos a utilidade do novo software InVivoVue Diver da Leica Microsystems para a segmentação automatizada de camadas retinianas no modelo CNV de camundongo. Por fim, discutiremos como a análise histológica de montagens inteiras de retina pode complementar a imagem longitudinal in vivo neste modelo.

Uma única gota de tropicamida é aplicada em cada olho para dilatação pupilar. Posteriormente, o animal é colocado suavemente no estágio de alinhamento do roedor. O mouse é ajustado para expor o olho e preso usando o suporte do nariz e um pedaço de fita adesiva colocado suavemente sobre as costas.

Em seguida, uma gota de lubrificante é aplicada no olho para hidratar e qualquer excesso de líquido é cuidadosamente removido usando cotonetes de papel de filtro. Por fim, a platina é alinhada na frente do dispositivo OCT para imagens de OCT de linha de base. A tomografia de coerência óptica de domínio espectral in vivo é realizada no início do estudo, antes da aplicação do laser, a fim de verificar a ausência de quaisquer anormalidades retinianas.

Remova cuidadosamente o mouse do suporte. Coloque uma gota de Viscotears Gel em uma lamínula para aplanar a córnea. Oriente o mouse com a cabeça do nervo óptico no centro e concentre o feixe de laser no epitélio pigmentar da retina.

Faça três disparos de laser evitando os vasos sanguíneos da retina nas posições de quatro, oito e 12 horas ao redor do nervo óptico. Inspecione a firmeza do olho após todos os disparos de laser para a ausência de qualquer sangramento retiniano. Como antes, alinhe o mouse no suporte e realize angiografia com fluoresceína e imagens de OCT para confirmar danos à membrana de Bruch.

Para a angiografia com fluoresceína, primeiro focar nas áreas de queima a laser usando o modo de refletância infravermelha, que permite visualizar os locais em que o laser foi administrado. Injete cuidadosamente 0,1 mililitros de sal de sódio com fluoresceína a 5%, para aproximadamente 20 gramas de peso corporal do camundongo sem alterar a posição dos olhos do mouse. Comece a tirar imagens de angiografia com fluoresceína ao nível da coróide e ao nível da retina, aproximadamente a cada 30 segundos.

Alinhe o olho para imagens de OCT como antes e comece a fazer imagens. A média do sinal SD-OCT ajuda a visualizar melhor a morfologia detalhada da retina, conforme mostrado nesta sequência. Uma vez que a imagem SD-OCT tenha sido realizada, remova cuidadosamente o mouse do suporte.

Aplique lubrificante em ambos os olhos. Neste ponto, você pode optar por reverter a anestesia por injeção subcutânea do antagonista alfa-2 para medetomidina, atipamezol, ou aguardar a recuperação do animal da anestesia. Repita a imagem in vivo SD-OCT e FA em animais anestesiados nos dias de acompanhamento cinco, 10 e 14.

Use o recurso de segmentação automatizada do software InVivoVue Diver para medições da espessura da retina. Para a retina saudável, a espessura total da retina é considerada como a espessura de todas as camadas, desde a camada de fibras nervosas até o EPR. Na retina saudável, a segmentação automatizada pode detectar com precisão camadas retinianas individuais, como pode ser visto neste exemplo.

Vale ressaltar que, em locais onde a CNV está presente, a medição manual da espessura da retina deve ser realizada para cada local da lesão da CNV separadamente. Da camada de fibras nervosas para uma linha imaginária que passa pela camada de EPR. Esta sequência mostra o fluxo de trabalho para medições manuais de espessura em locais onde as lesões de CNV estão presentes.

A camada de fibras nervosas está localizada na parte superior, a coróide na parte inferior da imagem. Usando o mouse ou touchpad, as bordas da camada de fibras nervosas e da coróide são determinadas manualmente, e o software calcula automaticamente a espessura total da retina com base nessas coordenadas. Esta figura mostra imagens seriais tiradas a cada 20 segundos no nível da coroide.

A imagem um foi adquirida no modo de refletância infravermelha. Já os demais, após injeção intraperitoneal de fluoresceína. As setas brancas na imagem um apontam para locais com laser, que mostram vazamento de fluoresceína em pontos posteriores, destacados pelas setas brancas na imagem 18.

Esta imagem mostra imagens seriadas de AF adquiridas no nível da retina. A seta branca na imagem 18 aponta para um local com laser, que mostra o vazamento de fluoresceína aparecendo mais rápido do que os outros dois, delineados em círculos na imagem 18. Esta figura resumida mostra um curso de tempo de imagens SD-OCT.

No início do estudo, imediatamente após o laser, e os pontos de tempo de acompanhamento nos dias cinco, 10 e 14. Em resumo, o protocolo para a imagem longitudinal in vivo de lesões de CNV usando imagens SD-OCT e FA permite a classificação rápida, multimodal e confiável da patologia da CNV e da presença de edema retiniano. Obrigado pelo seu interesse.