Na Vivo Imagiologia multimodal e análise do modelo de neovascularização coroide de induzida por Laser de Mouse

Os processos neovasculares são uma característica marcante de diversas patologias oculares prevalentes. Mais notavelmente, a degeneração macular relacionada à idade exsudativa, ou DMAE para abreviar, a retinopatia diabética proliferativa e a retinopatia da prematuridade. Juntas, essas doenças são responsáveis pela maioria dos casos de cegueira legal em todo o mundo e estão associadas a complicações oculares adicionais, como hemorragia vítrea e glaucoma neovascular.

No entanto, apesar de sua prevalência, as opções terapêuticas para distúrbios oculares neovasculares são limitadas. O padrão atual de tratamento para a neovascularização associada à DMAE e à retinopatia diabética proliferativa é a injeção intravítrea de anticorpos humanizados direcionados contra um mediador crítico da angiogênese e da neovascularização, o fator de crescimento endotelial vascular ou VEGF. No entanto, apesar da eficácia em interromper a progressão da doença e melhorar a visão funcional, as injeções intravítreas são onerosas e estão longe de serem isentas de riscos.

As complicações podem incluir infecções, endoftalmite, descolamento da retina e hemorragia ocular. Portanto, existe uma necessidade urgente de desenvolver novas opções de tratamento que sejam eficazes, seguras e menos onerosas. Para avançar no desenvolvimento de medicamentos para distúrbios neovasculares, modelos em pequenos animais são de importância crítica.

Esses modelos precisam ser reprodutíveis, possuir leituras e pontos finais estabelecidos e validados, e, idealmente, utilizar um composto de referência clinicamente relevante como controle positivo. Neste protocolo, apresentaremos o modelo de neovascularização coroidal em camundongo, ou modelo de CNV, que é um dos modelos mais comumente utilizados tanto para o estudo dos mecanismos fisiopatológicos que contribuem para a CNV quanto para o desenvolvimento de novos agentes anti-neovasculares. No modelo de CNV, a membrana de Bruch é rompida utilizando um laser de argônio.

Assim iniciando processos neovasculares originados a partir do coroide. A utilização de imagem longitudinal in vivo por tomografia de coerência óptica no domínio espectral, ou SD-OCT para abreviar, e angiografia com fluoresceína, fornece um meio para acompanhar a proliferação e regressão da NVCo. E, dessa forma, avaliar a eficácia e a evolução temporal de novas intervenções farmacêuticas.

Avanços recentes no processamento de imagens permitem ainda a segmentação automatizada para a medição da espessura retiniana, fornecendo uma metodologia isenta de viés do pesquisador para avaliar a presença de edema. A seguir, discutiremos a utilidade do novo software InVivoVue Diver da Leica Microsystems para a segmentação automatizada das camadas da retina no modelo de NVCo em camundongo. Por fim, discutiremos como a análise histológica de preparações inteiras da retina pode complementar o exame longitudinal in vivo neste modelo.

Uma única gota de tropicamida é aplicada em cada olho para dilatação pupilar. Posteriormente, o animal é posicionado suavemente na plataforma de alinhamento para roedores. O camundongo é ajustado para expor o olho e fixado utilizando o suporte para o nariz e um pedaço de fita laboratorial colocado suavemente sobre a parte traseira.

Em seguida, uma gota de lubrificante é aplicada sobre o olho para hidratação, e qualquer líquido em excesso é cuidadosamente removido usando swabs de papel filtro. Por fim, o estágio é alinhado em frente ao aparelho de OCT para a aquisição da imagem de referência. A imagem de tomografia de coerência óptica no domínio espectral in vivo é realizada no momento basal, antes da aplicação do laser, com o objetivo de verificar a ausência de quaisquer anormalidades retinianas.

Remova suavemente o camundongo do suporte. Coloque uma gota de Gel Viscotears em uma lamínula para aplanar a córnea. Oriente o camundongo com o disco óptico no centro e foque o feixe de laser no epitélio pigmentado da retina.

Realize três disparos a laser evitando os vasos sanguíneos da retina nas posições de quatro, oito e doze horas ao redor do nervo óptico. Verifique a firmeza do olho após todos os disparos a laser para confirmar a ausência de qualquer sangramento retiniano. Como anteriormente, alinhe o camundongo no suporte e realize angiografia com fluoresceína e imagem por tomografia de coerência óptica (OCT) para confirmar a lesão da membrana de Bruch.

Para a angiografia com fluoresceína, primeiro foque nas áreas da queimadura a laser utilizando o modo de refletância infravermelha, o qual permite visualizar os locais onde o laser foi aplicado. Injete cuidadosamente 0,1 mililitros de sal de fluoresceína a 5%, para aproximadamente 20 gramas de peso corporal do camundongo, sem alterar a posição do olho do animal. Inicie a aquisição de imagens de angiografia com fluoresceína ao nível da coroide e ao nível da retina, aproximadamente a cada 30 segundos.

Alinhe o olho para a imagem de OCT como antes e inicie a aquisição. A média do sinal de OCT-SD ajuda a visualizar melhor a morfologia retiniana detalhada, conforme mostrado nesta sequência. Após a realização da imagem de OCT-SD, remova cuidadosamente o camundongo do suporte.

Aplicar lubrificante em ambos os olhos. Neste momento, você pode optar por reverter a anestesia por meio de injeção subcutânea do antagonista alfa-2 para medetomidina, atipamezol, ou aguardar a recuperação do animal da anestesia. Repetir a aquisição de imagens in vivo por OCT-SD e FA em animais anestesiados nos dias de acompanhamento 5, 10 e 14.

Utilize o recurso de segmentação automatizada do software InVivoVue Diver para medições da espessura retiniana. Para a retina saudável, a espessura retiniana total é considerada como a espessura de todas as camadas, desde a camada de fibras nervosas até o EPR. Na retina saudável, a segmentação automatizada pode detectar com precisão as camadas retinianas individuais, como pode ser observado neste exemplo.

É importante mencionar que, nos locais onde há CNV, a medição manual da espessura retiniana deve ser realizada separadamente para cada sítio de lesão por CNV, desde a camada de fibras nervosas até uma linha imaginária que passe pela camada do epitélio pigmentado da retina (RPE). Esta sequência mostra o fluxo de trabalho para as medições manuais de espessura nos sítios onde estão presentes lesões por CNV.

A camada de fibras nervosas está localizada na parte superior, e a coroide, na parte inferior da imagem. Usando o mouse ou o touchpad, as bordas da camada de fibras nervosas e da coroide são determinadas manualmente, e o software calcula automaticamente a espessura total da retina com base nessas coordenadas. Esta figura mostra imagens seriadas obtidas a cada 20 segundos no nível da coroide.

A imagem um foi adquirida no modo de reflexão no infravermelho. Já as demais, após injeção intraperitoneal de fluoresceína. As setas brancas na imagem um indicam os locais irradiados, que mostram vazamento de fluoresceína em pontos temporais posteriores, destacado pelas setas brancas na imagem 18.

Esta imagem mostra a angiografia fluoresceínica seriada adquirida ao nível da retina. A seta branca na imagem 18 aponta para um local tratado com laser, que apresenta vazamento de fluoresceína mais rápido do que os outros dois, destacados por círculos na imagem 18. Esta figura resumo mostra a evolução temporal de imagens de OCT-DT.

No momento basal, imediatamente após a aplicação do laser e nos pontos de acompanhamento nos dias cinco, 10 e 14. Em resumo, o protocolo para o exame longitudinal in vivo de lesões de neovascularização coroidal utilizando imagens de OCT-SD e angiografia com fluoresceína permite a classificação rápida, multmodal e confiável da patologia da neovascularização coroidal e da presença de edema retiniano. Obrigado pelo seu interesse.