Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Este protocolo descreve a dissecção e imunocoloração de adultos Drosophila melanogaster tecidos do cérebro. Especificamente, este protocolo destaca o uso da Drosophila cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios como subconjuntos neuronal de exemplo que podem ser usados com precisão para descobrir princípios gerais subjacentes a muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.

O objetivo geral deste protocolo de dissecação cerebral de Drosophila é obter cérebros intactos de moscas adultas que podem ser usados em uma ampla gama de aplicações, como imunofluorescência, localização de proteínas marcadas com GFP e experimentos de cultura ex-vivo. Este método pode nos ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia do desenvolvimento e da neurociência, como os papéis de proteínas específicas e vias de sinalização e o estabelecimento de padrões de conectividade neuronal durante o desenvolvimento do cérebro. A principal vantagem dessa técnica é que, uma vez dominada, ela fornece um método rápido e eficaz para identificar imunologicamente defeitos morfológicos em regiões específicas do cérebro adulto.

Este procedimento pode ser difícil de aprender, porque remover o exoesqueleto da cabeça da mosca pode exigir muito cuidado e prática. Seus movimentos devem ser lentos e deliberados, e os braços do dissecador devem estar bem apoiados para se manterem firmes. É uma boa ideia praticar em moscas de olhos vermelhos e depois em moscas de olhos brancos antes de realmente dissecar genótipos de interesse para experimentos reais.

Para preparar a dissecação, coloque as moscas anestesiadas de interesse em uma almofada de metal frio ou em uma placa de Petri sobre o gelo. Como alternativa, use uma almofada de mosca que emita dióxido de carbono. Em seguida, coloque uma pequena quantidade de PTN no centro da placa de dissecação para criar uma bolha de PTN.

Em seguida, sob um microscópio estéreo, preencha o campo de visão com a bolha PTN sob iluminação uniforme. Agora, manipule as moscas para que fiquem de barriga para cima e transfira uma pelo abdômen para o PTN. Mergulhe completamente o animal no PTN, e realize toda a dissecção submersa no PTN.

Com um segundo par de pinças, segure a tromba e puxe a cabeça para fora do corpo. Ocasionalmente, a tromba será removida, mas a cabeça permanecerá presa ao corpo. Se isso ocorrer, agarre a borda medial de uma retina e aplique força lateral para remover a cabeça.

Descarte o abdômen e o tórax. É fundamental manter a cabeça no PTN durante esta etapa. As conexões do cérebro central com o VNC claramente não podem ser analisadas usando este método.

Em seguida, segure a borda medial da retina esquerda na borda do orifício central na cutícula e puxe lentamente as pinças diretamente separadas uma da outra para evitar o rompimento do lobo óptico, que é a estrutura opaca coberta por uma traqueia branca e fibrosa. À medida que a retina se dissocia, haverá uma ligeira diminuição da tensão. Para evitar que o cérebro rasgue, é extremamente importante agarrar a borda medial de cada olho e separar muito lentamente a pinça.

Mover-se muito rapidamente pode resultar em morfologia cerebral alterada ou danos ao tecido cerebral. Como mostrado aqui, segure a cutícula com cada par de pinças e puxe-as muito lentamente em direções opostas. Se feito corretamente, a cutícula deve se separar do tecido cerebral, deixando o cérebro intacto.

Pinças muito afiadas são necessárias para esta etapa. Em seguida, remova cuidadosamente a cutícula ao redor, peça por peça. Ao remover a cutícula teimosamente presa, pode ajudar a proteger o cérebro, segurando o VNC restante para evitar esmagar o cérebro.

Finalmente, use uma pipeta P200 para transferir os cérebros dissecados para um poço de uma placa cheia de PTN para fixação e imunocoloração. Sob o microscópio, use uma pipeta P200 para transferir 10 a 15 cérebros dissecados do mesmo genótipo para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro cheio de 4% de paraformaldeído diluído em PTN. Em seguida, incube os cérebros por 20 minutos com balanço lento à temperatura ambiente.

Após a fixação, permita que os cérebros se acomodem no fundo do tubo e, em seguida, remova o fixador. Em seguida, faça duas lavagens rápidas com 500 microlitros de PTN por lavagem. Troque o PTN assim que os cérebros se acomodarem no tubo.

Em seguida, execute três lavagens longas com PTN usando agitação suave à temperatura ambiente. Após essas lavagens, os cérebros podem ser armazenados durante a noite a quatro graus Celsius em PTN. Depois de remover a última lavagem de PTN, incube os cérebros em 0,5 mililitros de solução de bloqueio por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente e com agitação suave.

Depois de remover a solução de bloqueio, adicione os anticorpos primários diluídos na solução de bloqueio e incube os cérebros a quatro graus Celsius por dois dias com agitação suave. Remova o anticorpo primário usando o regimento de lavagem PTN de cinco lavagens. E então, aplique os anticorpos secundários.

Permita que esses anticorpos incubem com os tecidos por três horas em temperatura ambiente, protegidos da luz com balanço. Depois de incubar os cérebros na solução de anticorpos secundários, aplique o regimento de lavagem PTN. Cubra as amostras com papel alumínio após cada lavagem e termine removendo o máximo de tampão possível.

Em seguida, adicione 75 microlitros de meio de montagem fluorescente anti-desbotamento e flua os cérebros e o meio para dentro e para fora da ponta da pipeta apenas uma vez. O tubo pode ser então embrulhado em papel alumínio e armazenado a quatro graus Celsius por vários dias, mas, idealmente, prossiga diretamente com a montagem. Para montar os cérebros, construa um escorregador de ponte.

Posicione duas lamínulas de cobertura de base com cerca de 1 centímetro de distância em uma lâmina carregada positivamente. Certifique-se de que o lado carregado positivamente esteja voltado para cima. Em seguida, cole as lamínulas na lâmina com esmalte e deixe o esmalte secar completamente antes de prosseguir.

Em seguida, coloque a lâmina sob um microscópio estéreo e pipete os cérebros e o meio no espaço entre as lamínulas. Certifique-se de ajustar a iluminação para melhorar a visualização dos cérebros. Em seguida, aspire a mídia de montagem extra da lâmina, tomando cuidado para evitar os cérebros.

Em seguida, remova o excesso de mídia de montagem restante. Isso permitirá que os cérebros sejam posicionados com mais precisão. Agora, usando fórceps, oriente os cérebros em um padrão de grade, com seus lobos antenais voltados para cima.

Em seguida, coloque uma lamínula sobre os miolos e use esmalte para selar as bordas da lamínula superior que estão presas às lamínulas da base. Agora, carregue a cavidade central com uma nova mídia de montagem gota a gota, permitindo que a mídia seja puxada sob a lamínula por ação capilar. Quando a cavidade estiver preenchida, sele-a completamente com esmalte transparente.

O método descrito pode ser usado para visualizar quase qualquer estrutura dentro do cérebro adulto, incluindo os corpos dos cogumelos. Esta região do cérebro é necessária para o aprendizado e a memória. Os corpos dos cogumelos podem ser facilmente visualizados usando anticorpos que reconhecem a proteína fasciculina 2.

Esta proteína é altamente expressa nos lobos alfa e beta, bem como no corpo elipsóide localizado centralmente. Esta técnica permitiu a identificação de múltiplos processos celulares necessários para a orientação adequada do axônio dos neurônios do corpo do cogumelo. A interrupção desses processos causa uma gama diversificada de fenótipos mutantes, como projeção inadequada de axônios na região da linha média do cérebro e falta de lobos alfa

Esses fenótipos mutantes são frequentemente penetrantes incompletos e, portanto, requerem o exame de vários cérebros. A fim de examinar o papel autônomo de uma proteína na descoberta do caminho do axônio, a técnica de Markham também pode ser usada para visualizar as decisões de orientação do axônio de neurônios mutantes ou selvagens positivos para GFP individuais em um fundo de tipo selvagem não fluorescente. O método descrito aqui permite a visualização confiável e reprodutível de praticamente uma região do cérebro adulto de Drosophila.

Aqui, nos concentramos nos neurônios do corpo do cogumelo. Na versão em texto deste protocolo, também demonstramos a visualização dos lobos ópticos. Outros estudos usaram técnicas semelhantes para visualizar a pars intercerebralis, neurônios do relógio e neurônios de projeção do lobo antenal, entre muitos outros.

Uma vez dominado, cada cérebro pode ser dissecado em 3 a 5 minutos, se for executado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de estabilizar os braços perto do microscópio. Também é importante mover-se lentamente e remover pequenos pedaços de cutícula, um de cada vez.

Mover-se muito rapidamente pode causar danos indesejados ao tecido cerebral subjacente. Além de usar cérebros dissecados para experimentos de microscopia baseados em imunofluorescência, o tecido cerebral também pode ser usado para experimentos adicionais.