Name: Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprenda a dissecar e realizar imunofluorescência em cérebros adultos de Drosophila melanogaster para visualizar neurônios do corpo cogumelo e fotorreceptores. Este método permite identificar defeitos morfológicos cerebrais.

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Gostaríamos de agradecer Changhui Pak e Jeferson Vrailas Mortimer inicialmente ensinando SMK a técnica de dissecação do cérebro. Agradecemos também a membros do grupo de Ken Moberg laboratório, especialmente Chris rodadas, para ler criticamente o manuscrito. Anticorpos reconhecendo Fas2 (1 4) e chaoptin (24B10) foram obtidos a partir do banco de hibridoma de estudos do desenvolvimento. Anticorpo 24B10 foi depositado para o DSHB por Seymour Benzer e Nansi Colley24,60,,61, anticorpo 1 4 foi depositado para o DSHB por Corey Goodman 22,23,56. Estoques de moscas foram obtidos a partir do centro de estoque de Bloomington. Gostaríamos também de agradecer a Ohio agrícola centro de pesquisa e desenvolvimento centro (OARDC) MCIC Imaging para uso do microscópio confocal a imagem do cérebro na figura 4A e B. SMK é suportado por um fundo de FORMULADORES (1 R15 HD084241-01A1).

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

O método de dissecação e visualização descrito acima pode ser usado em uma ampla variedade de imunocoloração e vive aplicativos de imagem. Nós esboçamos um protocolo geral imunocoloração e evidenciaram uma maneira em que MARCM pode ser usado para visualizar axonal morfologia de neurônios individuais corpo cogumelo. Além disso, estes procedimentos gerais também podem ser usados para outras regiões do cérebro em fixo de imagem ou adulto recém dissecado cérebros48,65. Imagem ao vivo pode fornecer uma abordagem mais eficiente quando analisar padrões de expressão de armadilhas potenciador, genes repórter ou imitar linhas66, por exemplo. Para evitar a captura artefatos de morte celular durante a imagem latente ao vivo de GFP em tecido não fixado, cérebro deve ser dissecado em 1 x fosfato tamponado salino (PBS) ou HL3 mídia48, montado em lâminas de ponte em 1X PBS (ou HL3) e fotografado em menos de 15-20 min. cuidados também deve ser tomado para remover tanto a traqueia quanto possível do cérebro dissecado antes da imagem latente, uma vez que isso pode interferir na visualização da fluorescência de GFP.
Enquanto a coloração condições para avaliar a morfologia de neurônios corpo e fotoreceptor cogumelos são relativamente bem estabelecidos24,61,67, a localização de uma proteína específica de interesse destas células tipos podem exigir extensa de solução de problemas e otimização. Em particular, várias etapas críticas, incluindo diluição de anticorpo, bloqueio reserva componente concentração e fixação, devem ser otimizadas para gerar os resultados mais reprodutíveis e confiáveis. Em primeiro lugar, deve ser determinada a concentração ideal do anticorpo primário. Embora anticorpos comercialmente disponíveis têm frequentemente uma diluição sugerida (e muitas vezes inicialmente começamos usando essa concentração), esses valores raramente são determinados empiricamente sobre os tecidos da drosófila . Portanto, testando uma série de diluições de anticorpo primário que escala acima e abaixo a sugestão inicial do fabricante muitas vezes resulta em coloração mais específico. Enquanto a diluição do anticorpo primário pode ter um efeito significativo na coloração de precisão e deve ser precisamente determinada, o cérebro de tempo é incubado no anticorpo primário contendo soluções podem variar consideravelmente com pouco efeito sobre o resultado geral. Por exemplo, observamos resultados semelhantes quando incubando dissecou cérebros com o anticorpo primário do anticorpo Fas2 para dois, três, ou quatro dias a 4 ° C. Embora recomendamos pelo menos duas noites, temos também incubados cérebros em solução de anticorpo primário por uma noite e obteve coloração reprodutíveis. Importante, limitando a quantidade de tempo que cérebros são incubados no anticorpo secundário para 3h em temperatura ambiente (ou uma noite a 4 ° C) ajuda limite inespecificas de anticorpos secundários ao tecido cerebral.
Em segundo lugar, pode ser necessário usar reagentes adicionais de "bloqueio" para eliminar o sinal de fundo indesejado. Opções incluem o aumento da concentração de NGS para ~ 10%, a adição de 1-10% albumina de soro bovino (BSA) para o bloqueio e primário/secundário soluções do anticorpo ou pre-adsorção de anticorpos primários durante a noite a 4 ° C, com embriões da drosófila (ver referência68, seção 2.9, passo 3).
Enquanto escrevemos o protocolo acima usando PTN como o buffer sugerido para a fixação de todas, a lavagem e as etapas de incubação do anticorpo, fixação de tecidos em outros buffers (como PLP e PEM, listados na Tabela de materiais) pode resultar em profundas diferenças em a força do sinal. Por exemplo, estudos anteriores demonstraram que Cyclin E é indetectável em discos imaginária larvas, quando os tecidos são fixos no tradicional paraformaldeído 4%, diluído em PBS, mas é claramente visível quando os tecidos são fixos no buffer PLP (Ken Moberg, pessoal comunicação e referência69). Além das alterações no buffer de componentes, alterando o tempo e a temperatura, para fixação de tecido pode afetar também significativamente imunofluorescência mancha e pode ser determinados empiricamente, se necessário. Geralmente, tempo de fixação deve ser tempo suficiente para permitir a reticulação suficiente de componentes celulares, e a manutenção a longo prazo da morfologia geral celular estando limitado o suficiente para impedir over-reticulação e "enterrar" de epitopos de proteína. Portanto, quando inicialmente otimizando coloração condições para um anticorpo primário recém-adquiridas, geralmente limitar o tempo de fixação de aproximadamente 20 min e muitas vezes irá corrigir os tecidos em temperaturas mais frias.
Vários controles devem ser incluídos em qualquer experimento de imunofluorescência para investigar a especificidade dos anticorpos primários e secundários, bem como o efeito de transgenes/genético sobre o fenótipo observado. Para verificar se o anticorpo primário sendo usado especificamente reconhece a proteína de interesse, tecido de moscas falta desta proteína ou tecido superexpressão da proteína deve ser incluído como controles. A adição de proteína antígeno purificado em excesso também pode ser incluída para determinar se o anticorpo primário reconhece outros resumos no cérebro voar. Finalmente, qualquer sinal fluorescente presente quando os anticorpos primários são omitidos representa o nível de ligação não-específica pelos anticorpos secundários selecionados.
Vários controles importantes também devem ser incluídos para avaliar a contribuição do fundo genético ou a presença de transgenes para coloração de intensidade ou morfologia neuronal. Por exemplo, as moscas usadas no experimento MARCM na Figura 5 contêm múltiplos transgenes (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, banheira &#62; GAL80 e OK107-GAL4), cada um dos quais deve ser analisado separadamente para efeitos na morfologia do corpo cogumelo. Em uma morfologia muito mínimo, cogumelo corpo de moscas contendo OK107-GAL4 e UAS-CD8-GFP deve ser analisada. Também pode ser necessário avaliar o efeito do choque térmico e produção de recombinase Flp no desenvolvimento do cogumelo corpo analisando voa contendo hsFLP e FRT82B. Embora MARCM pode fornecer informações sobre significativo se uma proteína dada forma autônoma controla a orientação axonal, o número de controles necessários para fazer com precisão esta conclusão pode ser uma limitação menor desta técnica. Em experiências menos complicadas, controles similares também são aplicáveis. Por exemplo, tome um experimento onde o sistema de GAL4/UAS está sendo usado em combinação com um transgene RNAi para "knockdown" expressão de uma proteína de interesse em todos os neurônios. Neste experimento, pelo menos dois transgenes estará presentes: um driver de GAL4 pan-neuronal, como DrosÃ-GAL4 e o transgene UAS-RNAi . A morfologia de neurônios do corpo cogumelo em moscas, contendo cada uma destas transgenes sozinhos deve ser investigada para além da condição experimental onde moscas abrigam ambos os transgenes na mosca da mesma.
Finalmente, para determinar se a proteína de interesse é expressa em neurônios do corpo cogumelo é geralmente necessário cérebros co mancha com anticorpos para Fas2. Alternativamente, proteínas fluorescentes, tais como a GFP, RFP ou a membrana vinculado CD8-GFP também podem ser expressas usando o sistema de GAL4/UAS e usado em combinação com anticorpos reconhecendo a proteína de interesse. Desde que Fas2 só reconhece os fasciculado axônios que formam os lóbulos de cogumelo corpo α e β, o uso de GAL4-driven, membrana-limite CD8-GFP tem sido particularmente útil para a marcação de cogumelo corpo neurônios.
Defeitos na orientação axonal muitas vezes não são 100% penetrante e até mesmo o cérebro com o mesmo genótipo pode mostrar alguma variabilidade. Portanto, quando analisando recém gerado alelos mutantes para defeitos no corpo cogumelo ou pathfinding fotoreceptor, deve ser utilizada uma combinação de abordagens e diferentes alelos. A maioria dos estudos na literatura usar várias abordagens diferentes para investigar se uma proteína desempenha um papel célula autónomos em controlar a orientação axonal: eu) análise de pathfinding defeitos em homozigotos moscas nulos (de preferência usando diferente nualelos de ll), ii) análise de pathfinding defeitos em moscas falta da proteína de interesse somente nos neurônios (geralmente via RNAi), iii) análise MARCM de pathfinding defeitos e iv) resgatar experiências onde o gene é re-expressado nos neurônios homozigotos NULL moscas. Idealmente, várias dezenas de cérebros por genótipo devem ser analisados para defeitos na morfologia neuronal.
Embora o protocolo descrito aqui centra-se principalmente na imunofluorescência localização das proteínas dentro do tecido fixo, várias aplicações futuras desta técnica estão sendo desenvolvidas para o tecido do cérebro ao vivo de imagem. Uma vez que os cérebros são dissecados (geralmente em meios de cultura de células), então podem ser cultivadas durante vários dias a 25 ° C. Esses ex vivo métodos de cultivo estão sendo desenvolvidos a fim de investigar uma ampla variedade de processos biológicos, tais como a atividade de proteína que promove a regeneração do axônio após lesão70,71, intracelular sinalização dinâmica72e desenvolvimento neuronal73.

Embora o sistema nervoso de Drosophila é menor do que os seres humanos e roedores, sua complexidade fornece um modelo poderoso, acessível para entender melhor suas contrapartes de vertebrados. Em muitos casos, os genomas de vertebrados e moscas codificam proteínas muito similares que ditam os mecanismos do desenvolvimento do sistema nervoso. Na verdade, muitos dos genes necessários para desenvolvimento neuronal em vertebrados orthologs em moscas, incluindo aqueles envolveram nas vias de sinalização que controle a padronização, neurogênese e orientação axonal1,2,3 ,4,5. Por exemplo, netrin é um ligante necessário para orientação axonal em mamíferos e d. melanogaster6,7,8. Embora netrin foi originalmente isolado de tecido de cérebro embrionário garota6, estudos posteriores revelaram que netrin desempenha um papel conservado durante o desenvolvimento embrionário sistema nervoso central (CNS) em Drosophila8. Outros estudos têm usado telas genéticas no embrionário Drosophila CNS para identificar conservadas ligantes e receptores necessários para pathfinding em ambos Drosophila e vertebrados9.
Enquanto a mosca embrionária CNS tem sido amplamente utilizada no passado para identificar ligantes, receptores e proteínas de sinalização intracelulares obrigatório para orientação axonal8,9, trabalho recente investigou as maneiras em que muitos de Estas proteínas também controlam as decisões pathfinding durante os estágios posteriores de desenvolvimento. Especificamente, investigação do corpo cogumelo (MB) e desenvolvimento de neurônio fotorreceptoras da retina (Figura 1) forneceu insights sobre os mecanismos que controle pathfinding, formação de sinapse, poda de axônio e vários outros aspectos da neuronal desenvolvimento de10,11,12,13,14,15,16,17. Neurônios fotorreceptoras conectem a retina voar para regiões do cérebro adulto chamado a lâmina e medula e são crítico para veicular a informação visual ao cérebro (revisto por18,,19), enquanto os neurônios de cogumelo corpo são Centralmente localizado no cérebro voar e são necessários para aprendizagem e memória de20,21. Tanto os neurônios fotoreceptor e os neurônios intrínsecos dos corpos cogumelos, chamados células de Kenyon, utilizam mecanismos evolutivamente conservada contato-dependente e diffusible axonal orientação para encontrar os alvos pós-sinápticos. Além de ser visível em moscas adultas, fotorreceptoras e neurônios MB podem também ser diretamente visualizados em larvas e pupas com anticorpos ou repórter genes22,23,24,25. A capacidade de facilmente visualizar estes dois conjuntos de neurônios em pontos diferentes do desenvolvimento tempo promoveu sua utilização como excelentes modelos para muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.
Além de ser usado como um modelo para entender os mecanismos do desenvolvimento normal do sistema nervoso, estudos recentes têm demonstrado que moscas também podem servir como modelos precisos de uma grande variedade de doenças humanas, incluindo a síndrome de X frágil (FXS)26 , Deficiência intelectual (ID)27,28,29,30,31e outros32. Por exemplo, para estudar a função molecular de ZC3H14, um gene recentemente ligado à deficiência intelectual humana, criamos um modelo mosca de ID usando um alelo nulo da mosca ZC3H14 ortholog, chamado Nab230. Moscas, falta Nab2 têm deficiências graves de memória e estendidas caudas poli (a), sintetizando o que é observado em pacientes humanos ou paciente derivada de célula linhas33,34. Importante, moscas falta Nab2 também exibem defeitos de morfologia cerebral grave em seus corpos cogumelo adulto34, semelhante ao que é observado em moscas, falta o gene da síndrome FXS, FMR135. Assim, moscas podem servir como um organismo modelo importante para estudar tanto o desenvolvimento normal do cérebro e doenças que interrompem-lo.
Finalmente, a acessibilidade dos métodos de alto throughput para monitorar o comportamento, combinado com a vasta gama de ferramentas disponíveis e genéticas, fazer drosófila um organismo modelo de escolha para identificar as regiões do cérebro que controlam comportamentos complexos, tais como aprendizagem e memória, sono, namoro, sede e outros36,37,38,39. Uma ferramenta particularmente útil é o centro da "toolbox" mosca do geneticista é o sistema de GAL4/UAS (Figura 2). Este sistema de40,41 usa expressão específica de tecido do Gal4 ativador transcricional para aumentar a expressão de genes ou transgenes a jusante de um Upstream ativando sequência (UAS). Modificações deste sistema tem permitido aos pesquisadores, por exemplo, controlar com precisão a excitabilidade dos neurônios específicos42,43, overexpress ou batida para baixo genes específicos de interesse44, 45, analisar a dinâmica em tempo real de cálcio na vivo46e expressar genes repórter para marcar linhagens neuronal41. A combinação do sistema GAL4/UAS com recombinação mitótica também permitida a criação da análise de mosaico com um marcador de célula Repressible (MARCM) sistema12,47. MARCM tem sido amplamente utilizado no rastreamento único neurônio para identificar os componentes de sinalização celulares necessários para orientação axonal12,47. Embora estas e outras técnicas apresentaram uma série de informações valiosas sobre os mecanismos celulares necessários para o funcionamento do sistema nervoso, a maioria exige que o cérebro de Drosophila primeiro ser dissecado; remoção cuidadosa do cérebro é necessária para manter o cérebro correto padrões morfologia e conexão entre regiões do cérebro. O seguinte protocolo usa cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios comopopulações neuronal de exemplo como ela orienta a dissecação e cérebros de Drosophila imunofluorescência de coloração de adulto.

<table><tbody><tr><td>Pinças/pinças de microdissecção</td><td>Ted Pella</td><td>505-NM</td><td></td></tr><tr><td>Pratos Sylgard</td><td>Living Systems Instrumentação</td><td>DD-50-S-BLK</td><td>Disponível a partir de amazon.com</td></tr><tr><td>Fas2</td><td>Estudos de Desenvolvimento de Anticorpos Banco de Hibridoma</td><td>1D4</td><td></td></tr><tr><td>Estudos de Desenvolvimento de Anticorpo Chaoptin</td><td>Banco de Hibridoma</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP Anticorpo</td><td>Aves Laboratório</td><td>GFP-1010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 cabra anti-rato anticorpo secundário</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 cabra anti-frango anticorpo secundário</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 cabra anti-rato anticorpo secundário</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldeído Serviços de</td><td>microscópio eletrônico</td><td>RT15713</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas VectaShield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>ThermoFisher</td><td>99-910-01</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>ThermoFisher</td><td>12-553-454</td><td></td></tr><tr><td>Na Tampão de fosfato monobásico</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Na tampão de fosfato dibásico</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>polimento para unhas</td><td>Electron Microscope Services (EMS)</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>estereomicroscópio</td><td>Leica S6D com fonte</td><td></td><td></td>de luz LED KL300</tr><tr><td>Prato de 9 poços (placa de ponto)</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>nutator/rocker</td><td>Fisher</td><td>22-363-152 ou 88-861-041</td><td></td></tr><tr><td>prato de 35mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Fisher</td><td>50-366-794</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Potenciais tampões de fixação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTN Buffer</td><td></td><td></td><td>0,1M NaPhosphate, pH 7,2, 0,1% Triton-X-100, Normalmente compõe 0,5 L de tampão NaPhosphate 0,1M e aliquote 50ml de cada vez, conforme necessário</td></tr><tr>,<td>tampão</td><td></td><td></td> PLP <td>2% paraformaldeído, 0,01M NaI04, 0,075M Lisina, 0,037M NaPO4, pH 7,2, Dissolver 0,36 g de lisina em 10 ml H2O + 7,5 ml 0,1 M NaH2PO4 pH 7,2 + 2,5 ml 0,1 M Na2HPO4 no gelo. Imediatamente antes de usar, misture 15 ml desta solução de lisina tamponada com 50 mg NaIO4 (periodato de sódio) + 2ml de paraformaldeído de alto grau (EMS) a 20% + 3ml de tampão</td></tr><tr><td></td><td></td><td>H2O PEM</td><td>0,1M PIPES pH 7,0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, Este tampão pode ser convenientemente feito como um estoque 2x e diluído com 8% de paraformaldeído (PFA) para dar uma concentração final de 4% de PFA</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Fly Stocks disponíveis na Bloomington</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elav (c155)-GAL4</td><td></td><td>BL458</td><td>Driver GAL4 pan-neuronal</td></tr><tr><td>w*;;; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 854</td><td>GAL4 driver para todos os neurônios do corpo do cogumelo (OK107-GAL4 inserção está no 4º cromossomo)</td></tr> <tr><td>y (1), w (67c23); c739-GAL4</td><td></td><td>BL 7362</td><td>GAL4 driver para lobos alfa e beta (no 2º cromossomo)</td></tr> <tr><td>y (1), w (67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64305</td><td>GAL4 driver para lobos alfa e beta, também contém UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w *; 201Y-GAL4</td><td></td><td>BL 4440</td><td>Driver GAL4 para principalmente os lobos gama do corpo do cogumelo (no 2º cromossomo)</td></tr> <tr><td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64296</td><td>Driver GAL4 para lobos gama do corpo do cogumelo, também contém UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, estoque Tub>Gal80/CyO</td><td></td><td>BL 5145</td><td>MARCM, contém local FRT e GAL80 no 2º cromossomo</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, estoque UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL5146</td><td>MARCM, contém hsFLP, GAL4 pan-neuronal e CD8-GFP no cromossomo</td></tr><tr><td>X y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;; FRT82B, Banheira>GAL80/TM3, Sb(1); OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44408</td><td>Estoque MARCM para inverter o 3º cromossomo</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; FRT40A, Banheira>GAL80; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL44406</td><td>estoque MARCM para inverter o 2º cromossomo</td></tr><tr><td>w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44407</td><td>Estoque MARCM para inverter o cromossomo X</td></tr><tr><td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td><td></td><td>BL 5137</td><td>GFP marca a superfície celular (CD8 é uma proteína transmembrana)</td></tr><tr><td>y(1), w*; FRTG13, estoque UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 5139</td><td>MARCM, contém local FRT e CD8-GFP no 2º cromossomo</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td><td></td><td>BL 28832</td><td>MARCM, contém hsFLP e CD8-GFP no cromossomo X</td></tr><tr><td>w*; FRTG13, estoque Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5140</td><td>MARCM, contém local FRT e GAL80 no 2º cromossomo</td></tr><tr><td>y(1), w*;; FRT82B, estoque Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5135</td><td>MARCM, contém local FRT e GAL80 no 3º cromossomo</td></tr></tbody></table>

dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos drosophila melanogaster

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Desenvolvimento de sistema nervoso envolve uma série sequencial de eventos que são coordenados por diversas vias de sinalização e redes reguladoras. Muitas das proteínas envolvidas nestes caminhos são conservadas evolutivamente entre mamíferos e outras eucariotas, como a mosca de fruta Drosophila melanogaster, sugerindo que princípios organizadores semelhantes existem durante o desenvolvimento destes organismos. Importante, Drosophila tem sido amplamente utilizado para identificar mecanismos celulares e moleculares que regulam processos que são necessários em mamíferos, incluindo a neurogênese, diferenciação, orientação axonal e sinaptogênese. Moscas também têm sido utilizadas com sucesso para modelar uma variedade de doenças do desenvolvimento neurológico humano. Aqui descrevemos um protocolo para o passo a passo microdissection, fixação e imunofluorescência localização das proteínas dentro do cérebro adulto de Drosophila . Este protocolo centra-se em duas populações neuronal de exemplo, os neurônios do corpo cogumelo e fotorreceptores da retina e inclui etapas opcionais para rastrear os neurônios individuais corpo cogumelo usando análise de mosaico com uma técnica de marcador de célula Repressible (MARCM). Dados de exemplo do tipo selvagem e mutantes cérebros são mostrados juntamente com uma breve descrição dos critérios de Pontuação para orientação axonal defeitos. Enquanto este protocolo destaca dois anticorpos bem estabelecidos para investigar a morfologia do corpo cogumelo e neurônios fotoreceptor, outras regiões do cérebro de Drosophila e a localização de proteínas dentro de outras regiões do cérebro também podem ser investigada utilizando este protocolo.

Este protocolo descreve a dissecção e imunocoloração de adultos Drosophila melanogaster tecidos do cérebro. Especificamente, este protocolo destaca o uso da Drosophila cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios como subconjuntos neuronal de exemplo que podem ser usados com precisão para descobrir princípios gerais subjacentes a muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

O objetivo geral deste protocolo de dissecção de cérebro de Drosophila é obter cérebros intactos de moscas adultas que possam ser utilizados em uma ampla gama de aplicações, como imunofluorescência, localização de proteínas marcadas com GFP e experimentos de cultivo ex-vivo. Este método pode nos ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia do desenvolvimento e neurociência, como os papéis de proteínas e vias de sinalização específicas, além de estabelecer padrões de conectividade neuronal durante o desenvolvimento do cérebro. A principal vantagem desta técnica é que, uma vez dominada, ela fornece um método rápido e eficaz para identificar imunologicamente defeitos morfológicos em regiões específicas do cérebro adulto.Este procedimento pode ser difícil de aprender, porque remover o exoesqueleto da cabeça da mosca pode exigir muito cuidado e prática. Seus movimentos devem ser lentos e precisos, e os braços do dissector devem ser bem apoiados para manter a estabilidade. É recomendável praticar primeiro com moscas de olhos vermelhos e depois com moscas de olhos brancos antes de dissecar, de fato, os genótipos de interesse para experimentos reais.Para preparar a dissecação, coloque as moscas de interesse anestesiadas sobre uma placa metálica fria ou em uma placa de Petri sobre gelo. Alternativamente, utilize uma placa para moscas que emite dióxido de carbono. Em seguida, coloque uma pequena quantidade de PTN no centro da placa de dissecação para criar uma bolha de PTN.Em seguida, sob um microscópio estereoscópico, preencha o campo de visão com a bolha de PTN sob iluminação uniforme. Agora, manipule as moscas para que fiquem de barriga para cima e transfira uma delas pelo abdômen para dentro do PTN. Mergulhe completamente o animal no PTN e realize toda a dissecação submersa no PTN.Com um segundo par de pin&ccedil;as, segure o prob&oacute;scide e puxe a cabe&ccedil;a para separ&aacute;-la do corpo. &Agrave;s vezes, o prob&oacute;scide ser&aacute; removido, mas a cabe&ccedil;a permanecer&aacute; presa ao corpo. Se isso ocorrer, segure a borda medial de uma das retinas e aplique for&ccedil;a lateral para remover a cabe&ccedil;a.Descarte o abdômen e o tórax. É fundamental manter a cabeça na PTN durante esta etapa. As conexões do cérebro central para a CVM claramente não podem ser analisadas usando este método.Em seguida, segure a borda medial da retina esquerda na borda do orifício central na cutícula e puxe lentamente as pinças diretamente uma da outra para evitar o rompimento do lobo óptico, que é a estrutura opaca coberta por traqueias brancas e fibrosas. Conforme a retina se dissocia, haverá uma ligeira diminuição na tensão. Para evitar que o cérebro se rompa, é criticamente importante segurar a borda medial de cada olho e puxar muito lentamente as pinças em direções opostas.Mover-se muito rapidamente pode resultar em alterações na morfologia cerebral ou em danos ao tecido cerebral. Como mostrado aqui, segure a cutícula com cada par de pinças e puxe-as lentamente em direções opostas. Se realizado corretamente, a cutícula deve se separar do tecido cerebral, deixando o cérebro intacto.São necessárias pinças muito afiadas para esta etapa. Em seguida, remova cuidadosamente a cutícula ao redor, pedaço por pedaço. Ao remover a cutícula firmemente aderida, pode ser útil fixar o cérebro segurando o CVD remanescente para evitar esmagar o cérebro.Por fim, utilize uma pipeta P200 para transferir os cérebros dissecados para um poço de uma placa contendo PTN para fixação e imunomarcação. Sob o microscópio, use uma pipeta P200 para transferir 10 a 15 cérebros dissecados do mesmo genótipo para um tubo microcentrífugo de 0,5 mililitro contendo paraformaldeído a 4% diluído em PTN. Em seguida, incube os cérebros por 20 minutos com agitação lenta à temperatura ambiente.Após a fixação, deixe os cérebros sedimentarem no fundo do tubo e, em seguida, remova o fixador. Em seguida, realize duas lavagens rápidas com 500 microlitros de PTN por lavagem. Troque o PTN assim que os cérebros sedimentarem no tubo.Em seguida, realize três lavagens prolongadas com PTN utilizando agitação suave à temperatura ambiente. Após essas lavagens, os cérebros podem ser armazenados durante a noite a quatro graus Celsius em PTN. Após a remoção da última lavagem com PTN, incube os cérebros em 0,5 mililitros de solução bloqueadora por pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente e com agitação suave.Após remover a solução bloqueadora, adicione os anticorpos primários diluídos na solução bloqueadora e incube os cérebros a quatro graus Celsius por dois dias com agitação suave. Remova o anticorpo primário utilizando o protocolo de lavagem PTN com cinco lavagens. Em seguida, aplique os anticorpos secundários.Deixe esses anticorpos incubar com os tecidos por três horas à temperatura ambiente, protegidos da luz e com agitação. Após a incubação dos encéfalos na solução de anticorpo secundário, aplique o regime de lavagem com PTN. Cubra as amostras com papel alumínio após cada lavagem e finalize removendo o máximo de tampão possível.Em seguida, adicione 75 microlitros de meio de montagem fluorescente com agente anti-desbotamento e aspire e expulse os cérebros e o meio dentro e fora da ponta da pipeta apenas uma vez. O tubo pode então ser envolvido em papel alumínio e armazenado a quatro graus Celsius por vários dias, mas, idealmente, prossiga imediatamente com a montagem. Para montar os cérebros, construa uma lâmina-ponte.Posicione dois lamínulas de base aproximadamente a um centímetro de distância um do outro sobre uma lâmina carregada positivamente. Certifique-se de que o lado carregado positivamente esteja voltado para cima. Em seguida, adicione as lamínulas à lâmina com esmalte de unha e deixe o esmalte secar completamente antes de prosseguir.Em seguida, coloque a lâmina sob um microscópio estereoscópico e pipete os cérebros e o meio para o espaço entre as lamínulas. Certifique-se de ajustar a iluminação para melhorar a visualização dos cérebros. Em seguida, aspire o meio de montagem em excesso da lâmina, tomando cuidado para não atingir os cérebros.Em seguida, remova por capilaridade o meio de montagem residual em excesso. Isso permitirá posicionar os cérebros com maior precisão. Agora, utilizando pinças, oriente os cérebros em um padrão de grade, com seus lobos antenais voltados para cima.Em seguida, coloque uma lamínula sobre os cérebros e use esmalte incolor para unhas para selar as bordas da lamínula superior que estão presas às lamínulas de base. Agora, carregue a cavidade central com meio de montagem fresco, gota a gota, permitindo que o meio seja puxado para sob a lamínula por ação capilar. Quando a cavidade estiver cheia, feche-a completamente usando esmalte incolor para unhas.O método descrito pode ser usado para visualizar quase qualquer estrutura dentro do cérebro adulto, incluindo os corpos pedunculados. Esta região do cérebro é necessária para aprendizado e memória. Os corpos pedunculados podem ser facilmente visualizados usando anticorpos que reconhecem a proteína fasciculina 2.Essa proteína é altamente expressa nos lóbulos alfa e beta, bem como no corpo elipsóide localizado centralmente. Esta técnica permitiu a identificação de múltiplos processos celulares necessários para o correto direcionamento de axônios dos neurônios do corpo pedunculado. A interrupção desses processos causa uma diversidade de fenótipos mutantes, como projeção inadequada de axônios através da região da linha média do cérebro e ausência dos lóbulos alfa.Esses fenótipos mutantes são frequentemente penetrantes de forma incompleta e, portanto, exigem a análise de múltiplos cérebros. Para examinar o papel autônomo de uma proteína na trajetória de axônios, a técnica de Markham também pode ser utilizada para visualizar as decisões de orientação axonal de neurônios individuais mutantes ou selvagens positivos para GFP em um fundo selvagem não fluorescente. O método descrito aqui permite a visualização confiável e reprodutível de praticamente qualquer região do cérebro adulto de Drosophila.Aqui, focamos nos neurônios do corpo de cogumelo. Na versão textual deste protocolo, também demonstramos a visualização dos lóbulos ópticos. Outros estudos utilizaram técnicas semelhantes para visualizar a pars intercerebralis, neurônios-relógio e neurônios projetores do lobo antenal, entre muitos outros.Uma vez dominada, cada cérebro pode ser dissecado em 3 a 5 minutos, se realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de estabilizar os braços próximos ao microscópio. Também é fundamental movimentar-se lentamente e remover pequenos pedaços de cutícula um de cada vez.Mover-se muito rapidamente pode causar danos indesejados ao tecido cerebral subjacente. Além de utilizar cérebros dissecados para experimentos de microscopia baseados em imunofluorescência, o tecido cerebral também pode ser usado para outros experimentos adicionais.

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste artigo vamos demonstrar como dissecar o sistema nervoso central do terceiro instar as larvas Drosophila.

Dissecção do CNS Larval em Drosophila melanogaster

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

Este vídeo descreve um método de montagem de cérebros intactos de moscas adultas sob uma lâmina de ponte e mostra o protocolo realizado em cérebros imunomarcados para microscopia fluorescente.

Montagem de cérebros de Drosophila adulta: um método para preparar lâminas para imagens confocais

Este vídeo descreve como dissecar e isolar o cérebro adulto de Drosophila – um procedimento necessário para visualizar o órgão, que é obscurecido pela cutícula, olho e tecido traqueal. O protocolo de exemplo mostra uma demonstração detalhada produzindo preparações de alta qualidade que podem ser usadas para imunocoloração e métodos de imagem em neurobiologia de Drosophila.

drosófila Dissecção do cérebro adulto: um método em neurobiologia de moscas

Este vídeo demonstra um protocolo de imunocoloração detalhado para visualizar defeitos fenotípicos nos corpos de cogumelos de cérebros mutantes de Drosophila. O protocolo envolve o uso de anticorpos contra Fas2, uma proteína envolvida na orientação axonal que facilita o desenvolvimento morfológico e funcional adequado do corpo do cogumelo.

Visualizando neurônios do corpo de cogumelo em cérebros de Drosophila via imunocoloração

As estruturas adultas de Drosophila são derivadas de estruturas semelhantes a sacos chamadas discos imaginais. A análise desses discos fornece informações sobre muitos processos de desenvolvimento, incluindo determinação de tecidos, estabelecimento de limites de compartimentos, proliferação celular, especificação do destino celular e polaridade celular planar. Este protocolo é usado para preparar discos imaginais para microscopia de luz / fluorescente.

Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de Drosophila melanogaster

O adulto de Drosophila cérebro é um sistema valioso para estudar circuitos neuronais, funções cerebrais superiores, e doenças complexas. Um método eficiente para dissecar tecido do cérebro inteiro do cabeça pequena mosca facilitará estudos baseados em cerebrais. Aqui nós descrevemos um de uma etapa simples protocolo, dissecação de cérebros adultos com morfologia bem preservada.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

Aqui, fornecemos protocolos para realizar três ensaios simples de degeneração de axôntoinduzidos induzidos por lesões (morte de axônto) em Drosophila melanogaster para avaliar a preservação morfológica e funcional de axôntos cortados e suas sinapses.

Avaliação morfológica e funcional de Axons e suas sinapses durante a morte de Axon em Drosophila melanogaster

Este protocolo descreve três etapas para preparar os lobos ópticos de larvas e adultos de Drosophila para imagem: 1) dissecções cerebrais, 2) imuno-histoquímica e 3) montagem. A ênfase é colocada na etapa 3, pois são necessárias orientações de montagem distintas para visualizar estruturas específicas do lóbulo óptico.

Dissecção, imuno-histoquímica e montagem de cérebros de larvas e adultos de Drosophila para visualização do lobo óptico

Este estudo apresenta um protocolo simplificado para processamento de tecidos envolvendo decapitação, fixação, criosecção, coloração de fluorescência, imunocoloração e imagem, que pode ser estendido para imagens confocais e multifotônicas. O método mantém uma eficácia comparável a dissecções complexas, ignorando a necessidade de habilidades motoras avançadas. A análise quantitativa de imagens fornece amplo potencial investigativo.

Crioseccionamento direto de cabeças de Drosophila para coloração e imunocoloração aprimoradas de fluorescência cerebral

Aprenda a dissecar e realizar imunofluorescência em cérebros adultos de Drosophila melanogaster para visualizar neurônios do corpo cogumelo e fotorreceptores. Este método permite identificar defeitos morfológicos cerebrais.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

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