Name: Drogas baseada em citometria de fluxo sistema de triagem para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação celular de células-tronco Glioblastoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a triagem de pequenas moléculas por citometria de fluxo para promover diferenciação astroglial em células-tronco de glioblastoma. Este método de alta vazão utiliza um repórter GFP-GFAP para identificar agentes terapêuticos potenciais contra o câncer.

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Este trabalho foi parcialmente apoiado pela NIH R01CA187780.

Nota: Sistemas de repórter de lentivirus neuronal e Ralevic foram comprados como preparações de Lentivirus pré-embalados, concentradas. Conhecimento básico da técnica de citometria de fluxo é necessário. Também, para um uso completo do presente protocolo o usuário terá acesso a um citômetro de fluxo com capacidade de produção elevada (aceita placas de 96 poços como fonte de exemplo).
1. Lentivirus repórter Transcriptional sistema
Nota: Em todas as análises de fluxo cytometric, use células parentais, não-transfectadas, ou vetor-transfectadas (não fluorescente) para o estabelecimento da fluorescência de base. Além disso, observe que em todas as etapas onde a trituração mecânica é chamada para, seja gentil. Trituração dura pode matar um número significativo dos GSCs frágil e influenciar os resultados de citometria de fluxo.
<ol><li>Placa 1 x 106 células em 2 mL do meio de crescimento de células-tronco neurais completa em uma placa de 6-multiwell.</li>
	<li>Transduce células adicionando repórter lentivirus em uma multiplicidade de infecção (moi) igual a 5.</li>
	<li>Adicione 2 µ l de polybrene para uma concentração final de 8 µ g/mL.</li>
	<li>Incube as celulas em 37 ° C e 5% de CO2 durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, substitua o meio de crescimento para remover vírus desacoplado. Coloque a placa de volta na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 e incubar por 24 h.</li>
	<li>Colheita de 0,5 mL do volume total; Gire para baixo as células a 360 x g durante 5 min à temperatura ambiente em um tubo cônico de 15 mL e remover o sobrenadante por aspiração. Adicionar 0,5 mL do meio de crescimento de novas células-tronco neurais para as células restantes e devolve a chapa para a incubadora para expansão contínua.</li>
	<li>Acrescente 200 µ l de reagente de dissociação e incube por 5 min a 37 ° C.</li>
	<li>Dissocia as células pipetando delicadamente acima e para baixo. Nota: Trituração dura pode resultar em morte significativa de GSCs, dissociação completa é geralmente alcançada após 20 - 30 vezes.</li>
	<li>Para minimizar a fixação da célula ou agregação, adicione 800 µ l de Hank está equilibrado sal solução (HBSS) para um volume final de 1 mL.</li>
	<li>Transferi 200 µ l de cada suspensão de células para um poço de uma placa de 96-multiwell.</li>
	<li>Para este procedimento, use um citômetro de fluxo de bancada com capacidade de placa de 96 poços, equipada com um laser azul para excitação e com a capacidade de detectar a proteína verde fluorescente. Realizar análise de fluxo cytometric pelo menos 10.000 células viáveis para cada aquisição.</li>
	<li>Determine a porcentagem de células GFP-positivo por citometria de fluxo.</li>
</ol>2. subclone seleção, expansão e validação
<ol><li>Células de placa em 100 µ l de células-tronco neurais médio em uma densidade de 0,7 células por poço de uma placa de 96-multiwell.</li>
	<li>Cultura de clones durante 11 dias a 37 ° C e 5% de CO2. Esta etapa é altamente dependente do tipo de célula e provavelmente exigirá um ajuste com base na linha de celulares usada. Como regra geral, uma esfera de diâmetro ≥ 100 µm é uma boa indicação da presença de clonogenic GSCs no neurospheres.</li>
	<li>Usando um microscópio fluorescente, equipado com um filtro FITC, marca os poços que contêm uma única neurosphere onde ~ 1-5% das células é GFP-positivo. Nota: Determinar o percentual exato de células GFP-positivo não é demasiado crítico neste ponto. Cada um dos subclones mais tarde será avaliado por citometria de fluxo. Esta etapa é realizada para reduzir o total número de clones a serem analisados com ênfase na neurospheres que se originam por indiferenciado, GFAP-negativo, GSC.</li>
	<li>Expanda o repórter selecionado clones até que haja um número suficiente de células para análise por citometria de fluxo. Um poço sub confluente da placa contendo ≤ 1.5x105 células/mL 6-multiwell deve fornecer um número suficiente de células. Nota: Um procedimento detalhado para o isolamento e a expansão de GSCs é disponível 17.</li>
</ol>3. a determinação da expressão GFAP:GFP por citometria de fluxo
<ol><li>Recolher uma alíquota de células (0,5 mL) de cada clone de repórter e controles não-transfectadas para determinar o percentual exato de células GFP-positivo. Considerando os clones de repórter que contêm as células GFP-positivo de ~ 1-5%.</li>
	<li>Girar as células a 360 x g durante 5 min à temperatura ambiente e retire o sobrenadante por aspiração.</li>
	<li>Cada pellet, adicionar 200 µ l de reagente de dissociação de célula e incubar os tubos num banho de água situado a 37 ° C.</li>
	<li>Triture as células delicadamente para obter uma suspensão de célula única (geralmente entre 20 a 30 vezes).</li>
	<li>Para minimizar a fixação da célula ou agregação, adicione 800 µ l HBSS até um volume final de 1 mL.</li>
	<li>Transferi 200 µ l por alvéolo de uma placa de 96-multiwell de cada suspensão de células.</li>
	<li>Para este procedimento, use um citômetro de fluxo de bancada com capacidade de placa de 96 poços. Realizar análise de fluxo cytometric pelo menos 10.000 células viáveis para cada aquisição.</li>
</ol>4. ELDA auto-renovação ensaio para avaliar a capacidade de Clonogenic
Nota: Para controles, tanto dos pais, não transfectadas, bem como expressando GFP células transfectadas de lentivirus, deve ser usado para determinar o potencial de clonogenic relativa das linhas repórter GSC diferenciação para as culturas de GSC originais do qual foram derivada.
<ol><li>Dissocia a diferenciação-repórter subclones em suspensões de célula única conforme descrito acima.</li>
	<li>Células de placa em placas de 96-multiwell em 100 µ l de meio de crescimento de células-tronco neurais completa em densidades de célula variando entre 5 e 500 células por poço.</li>
	<li>Incube as células 9 a 11 dias a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Ponto positivos poços por visualização direta dos neurospheres sob um microscópio de luz. Um bem deve ser considerado "positivo" se ele contém pelo menos um único grande neurosphere.</li>
	<li>Conecte os dados: total poços analisados e o número de poços positivos usando a interface online de ELDA disponível em http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html.</li>
</ol>5. drogas biblioteca diluição preparação
<ol><li>Remover placas de biblioteca de armazenamento a-80 ° C, cubra com papel alumínio (proteger compostos sensíveis à luz). Descongelar por aproximadamente 30 min a uma hora em temperatura ambiente.</li>
	<li>Use uma pipeta multicanal 12 canais para diluir os compostos de biblioteca para 0,2 mM no meio de células-tronco neurais completa. DMSO diluído a 10% em média de crescimento Nota: A concentração final de DMSO deve ser 0,1% quando adicionada às células. Uma maior concentração de DMSO na cultura pode resultar em toxicidade. Por este motivo, é aconselhável testar a sensibilidade de DMSO em linhagem celular usada, antes do tratamento.</li>
	<li>Usar o DMSO como controle de veículo para tratar células encontradas nas colunas esquerdas e direita de cada placa (colunas 1 e 12; Poços da a H).</li>
	<li>Cobrir as placas de biblioteca diluídos com folha de alumínio e retornar as chapas originais da biblioteca para o freezer-80 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
</ol>6. drug Screen
Nota: Células tratada com DMSO devem ser usadas para definir a fluorescência de base e ajustar gating.
<ol><li>Placa de 5 x 103 células em uma placa de 96-multiwell em 99 µ l de meio de cultura de células-tronco neurais completa.</li>
	<li>Usando uma pipeta multicanal 12 canais, trate as células com compostos de biblioteca diluído a uma concentração final de 2 µM (1 µ l de droga de 0,2 mM em 99 µ l de suspensão de células) ou com DMSO (controle). Incube as placas por 72 h a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Usando uma pipeta multicanal 12 canais adicionar 150 µ l de reagente de dissociação de celular a cada poço e incube por 20 min a 37 ° C.</li>
	<li>Dissocia as células por moer suavemente com uma pipeta multicanal 12 canais até alcançar a suspensão de célula única (geralmente entre 20 a 30 vezes). A quantidade de tempo necessária para dissociar neurospheres completamente irá variar entre linhas GSC. Enquanto o eritrócito recomendada de dissociação (ver materiais) é seguro e incubação por até 45 minutos não teve efeito sobre viabilidade em várias linhas de GSC testadas, verifique-se para cada linha de GSC para ser utilizado na triagem. Nota: O volume final em cada bem deve ser aproximadamente 250 µ l (100 µ l de suspensão de células + 150 µ l de reagente de dissociação celular).</li>
	<li>Determine a porcentagem de células expressando o repórter GFAP:GFP por citometria de fluxo. Padrão de uso da estratégia de retenção. Primeiro, trama para a frente e lateral espalha-se para ter uma noção geral do tamanho da célula e a viabilidade. Em seguida, coloque um portão na população viável de célula única. Isso é a população para a qual será determinada fluorescência verde (eGFP). Qualquer composto que resulta em um aumento da percentagem de GFP-positivo células por mais de três desvios-padrão sobre controle (DMSO-tratada) é considerada como um positivo "hit". Este limiar deve ser ajustado de acordo com a aplicação específica e o rigor desejado. Nota: Para o alto throughput tela recomenda-se usando um único subclone de repórter de GSC. Após a identificação de ocorrência, cada batida deve ser validada contra subclones de repórter adicionais da mesma linha GSC. Para aumentar a confiança para verdadeiros hits é também recomendar testes compostos contra repórter subclones isolaram de diferentes GSC neurospheres linhas.</li>
</ol>

<ol><li>Maher, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+glioma%3A+genetics+and+biology+of+a+grave+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter.</a> Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).</li>
<li>Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+maintenance+in+glioblastoma%3A+a+social+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network.</a> Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).</li>
<li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li>
<li>Sul, J., Fine, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+gliomas%3A+new+translational+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mt+Sinai+J+Med%22%5BJournal%5D)">Malignant gliomas: new translational therapies.</a> Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).</li>
<li>Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+promotes+medulloblastoma+survival+via+Bc%2FII%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II.</a> Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).</li>
<li>Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+inhibition+of+glioblastoma+xenograft+initiation+and+clonogenic+growth+following+in+vivo+Notch+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade.</a> Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).</li>
<li>Schreck, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+target+Hes1+directly+modulates+Gli1+expression+and+Hedgehog+signaling%3A+a+potential+mechanism+of+therapeutic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance.</a> Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).</li>
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<li>Piccirillo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins+inhibit+the+tumorigenic+potential+of+human+brain+tumour-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells.</a> Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).</li>
<li>Bar, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclopamine-mediated+hedgehog+pathway+inhibition+depletes+stem-like+cancer+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma.</a> Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).</li>
<li>Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+increases+the+expression+of+stem-cell+markers+and+promotes+clonogenicity+in+glioblastoma+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres.</a> Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).</li>
<li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2FCD15+defines+distinct+cell+subpopulations+with+differential+in+vitro+clonogenic+activity+and+stem+cell-related+gene+expression+profile+in+in+vitro+propagated+glioblastoma+multiforme-derived+cell+line+with+a+PNET-like+component%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component.</a> Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).</li>
<li>Lim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+monocarboxylate+transporter-4+depletes+stem-like+glioblastoma+cells+and+inhibits+HIF+transcriptional+response+in+a+lactate-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner.</a> Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).</li>
<li>Kahlert, U. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZEB1+Promotes+Invasion+in+Human+Fetal+Neural+Stem+Cells+and+Hypoxic+Glioma+Neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres.</a> Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).</li>
<li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELDA%3A+extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).</li>
<li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell-derived+clonal+analysis+of+human+glioblastoma+links+functional+and+genomic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).</li>
<li>Galli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).</li>
<li>Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atracurium+Besylate+and+other+neuromuscular+blocking+agents+promote+astroglial+differentiation+and+deplete+glioblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells.</a> Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Enquanto a maioria dos estudos anteriores de GSCs centradas-se principalmente os marcadores que os definem, neste estudo decidimos tomar a abordagem inversa. Focamos principalmente em progênies diferenciadas gerados pelo GSCs (por exemplo, células expressando marcadores neuronais e Ralevic). Aqui vamos demonstrar a utilização de uma sistema, que é baseado na expressão humana do promotor-dependente GFAP de GFP de despistagem de drogas baseada em célula alto throughput. Todos os experimentos foram realizados utilizando lin...

Estudos recentes têm mostrado que os tumores contêm uma pequena população de células, denominadas células-tronco câncer (CSCs) ou células de tumor-iniciando, que são responsáveis pela progressão do tumor, metástase e resistência à quimioterapia e radio-terapias 1, 2. a presença de câncer células-tronco e suas progênies mais diferenciados dentro de tumores é considerada fator importante promover a heterogeneidade intratumoral e, portanto, representa um grande obstáculo no tratamento de câncer3. Hierarquia de células de tumor, fornecida pela teoria de células-tronco do câncer, inspirou o desenvolvimento de novas estratégias para tratar cancros 4. Uma abordagem para o direcionamento de câncer células-tronco é identificar e inibir vias de sinalização que são conhecidas por serem necessárias durante o desenvolvimento embrionário do órgão afetado. Na verdade, nós e os outros anteriormente publicaram vários artigos descrevendo a exigência em curso para as células-tronco-relevantes sinalização vias neurais Sonic Hedgehog e entalhe em glioblastoma5,6,7. Este trabalho tem ajudado no solidificando a justificativa para vários ensaios clínicos de GBM. Uma segunda abordagem para o direcionamento de câncer células-tronco é promover a sua diferenciação. Esta abordagem tem recebido muito apoio devido os resultados favoráveis de estudos pré-clínicos e clínicos no tratamento da leucemia promielocítica aguda com ácidos retinoico (ATRA, um análogo da vitamina A). Aqui ATRA foi encontrado para remover o bloco de maturação e promover câncer de diferenciação celular8. Mais recentemente, Piccirillo e colegas elegantemente mostraram que BMP-4 promove a diferenciação de GSC em astrócitos com anti-GBM significativos efeitos in vitro e in vivo9.
A justificativa para o estudo atual é baseada em uma abordagem de "engenharia invertida" para segmentação GSCs. Dada a vasta heterogeneidade presente em GBM e com pobre diferenciação, sendo uma das marcas registradas do câncer, pedimos que se nós poderia promover um fenótipo mais favorável - diferenciação em um estado de astrocyte. Aqui, não temos conhecimento prévio dos caminhos sinalização que manter GSCs em uma amostra de determinado tumor mas prefiro visam alcançar um fenótipo desejado (por exemplo, positividade GFAP).
Este relatório descreve os procedimentos utilizados para estabelecer o GSC diferenciação repórter-linhas da transdução de culturas GSC-enriquecido a Seleção clonal de GSC. Estabeleceram-se as linhas de neurosphere de glioblastoma usadas no laboratório do Professor Angelo Vescovi de pacientes com diagnóstico de glioblastoma primário no Hospital San Raffaele - Milano, Itália. Estas linhas têm sido muito estudadas em várias publicações 6,10,11,12,13,14. É altamente recomendado que os indivíduos que estão interessados em implementar estas técnicas em seu laboratório determinam a relevância do repórter, a capacidade de auto-renovação de células-tronco de câncer nas células eles planejam estudar (isto é verdadeiro para qualquer repórter). Um protocolo detalhado para um dos ensaios clonogenic em vitro aceitados no campo é fornecido para realizar este15,16. Finalmente, um protocolo detalhado descrevendo a utilização das linhas de repórter de diferenciação em um teste de drogas baseada em citometria de fluxo é fornecido no final. Da nota, da mesma forma para o sistema de diferenciação de Ralevic descrito aqui, nós temos com sucesso estabelecido e validado linhas de repórter GSC integrando um repórter (diferenciação neuronal) de MAP2:GFP. Portanto, as metodologias descrevem neste livro pode ser aplicado para estudar a diferenciação celular em várias linhagens de células.
Algumas das figuras neste relatório podem ser encontradas em uma recente publicação: "Atracurium Besylate e outro agentes de bloqueio neuromuscular promover a diferenciação de Ralevic e empobrecem o glioblastoma as células-tronco18.

<table><tbody><tr><td>ESGRO Complete Accutase</td><td>EMD Millipore</td><td>SF006</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Solução de Sal Balanceada de Hank)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Repórter de Diferenciação GFAP Humana (pGreenZeo, Vírus)</td><td>SBI (System Biosciences)</td><td>SR10015VA-1</td><td></td></tr><tr><td>reagente descartável estéril de 50 ml reservatórios</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 poços</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Biolite T25 cm&sup2; Garrafa Térmica Ventilada</td><td>Fisher Scientific</td><td>130189</td><td></td></tr><tr><td>Biolite T75 cm&sup2; Garrafa Ventilada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 ml</td><td>Celltreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Pipeta multicanal Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Ovation, 12 canais, 0,5 - 20uL</td><td>Pipeta multicanal VistaLab Technologies</td><td>1060-0020</td><td></td></tr><tr><td>Ovation, 12 canais, 5-250uL</td><td>VistaLab Technologies</td><td>1060-0250</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta multicanal de 12 canais 25 &mu; l</td><td>Tecnologias VistaLab</td><td>4060-1002</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta multicanal de 12 canais 250 &mu; l</td> Citômetro de Fluxo de Bancada <td>VistaLab Technologies</td><td>4060-9025</td><td></td></tr><tr><td>Guava easyCyte 5HT</td><td>EMD Millipore</td><td>0500-4005</td><td></td></tr><tr><td>NIH Coleções Clínicas 1 e 2 bibliotecas de pequenas moléculas</td><td>Evotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td><forte>Para a preparação de meios de células-tronco neurais (500 mL)</forte></td><td></td><td></td><td><forte>Concentração final</forte></td></tr><tr><td>BSA</td><td>GoldBio.com</td><td>A-421-250</td><td>0,20%</td></tr><tr><td>DMEM/F12 10X</td><td>Corning</td><td>90-091-PB</td><td>1X</td></tr><tr><td>Sal de heparina sódica</td><td>Sigma</td><td>Aldrich H3149</td><td>0,0002%</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4036</td><td>5.4 mM</td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina- Selênio (ITS -G) (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>41400-045</td><td>1X</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td>14.5 mM</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL) 100X</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>1X</td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td>16 nM</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5780</td><td>4.8 &micro; M</td></tr><tr><td>Basic FGF (FGF2), Human</td><td>GoldBio</td><td>1140-02-50</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF,</td><td>Human GoldBio</td><td>1150-04-100</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Filtro de Frasco, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind</td><td>Corning</td><td>431160</td><td>Use para filtrar meios esterilizados</td></tr></tbody></table>

drogas baseada em citometria de fluxo sistema de triagem para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação celular de células-tronco glioblastoma

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral primário mais comum e mais letal em adultos, causando cerca de 14.000 mortes a cada ano só nos EUA. Sobrevida média após o diagnóstico é menor que 15 meses com quimioterapia máxima de temozolomide, radiação e ressecção cirúrgica. Os desafios inerentes ao desenvolvimento de tratamentos mais eficazes de GBM tornaram-se cada vez mais claros e incluem sua invasividade inflexível, sua resistência aos tratamentos padrão, sua complexidade genética e molecular adaptabilidade e subpopulações de GBM células com semelhanças fenotípicas de células-tronco normais, doravante conhecido como glioblastoma as células-tronco (GSCs). Porque GSCs são necessários para o crescimento do tumor e progressão, terapia baseada em diferenciação representa uma modalidade de tratamento viável para estas Neoplasias incuráveis.
O seguinte protocolo descreve uma coleção de procedimentos para estabelecer um alto throughput plataforma vista a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação de GSC Ralevic de triagem. No núcleo do sistema é uma proteína ácida fibrilar glial (GFAP) repórter-construção de diferenciação. O protocolo contém os seguintes procedimentos gerais: (1) estabelecer linhas de repórter GSC diferenciação; (2) testar/validar a relevância do repórter, a capacidade de autorenovação / clonogenic GSC; e triagem de drogas de alta capacidade-citometria de fluxo com base (3).
A plataforma de triagem fornece uma abordagem simples e barata para identificar pequenas moléculas que promovem a diferenciação de GSCs. Além disso, a utilização de bibliotecas de drogas FDA-approved possui o potencial para a identificação dos agentes que pode ser reaproveitado mais rapidamente. Também, terapias que promovem a diferenciação de células-tronco de câncer são esperadas para trabalhar em sinergia com a atual terapias "padrão de cuidados" que foram mostradas para atacar e eliminar as células do câncer diferenciado principalmente mais.

Três linhas independentes neurospheres paciente-derivados foram transfectadas com o repórter Ralevic de lentivirus codificação para uma proteína verde fluorescente (GFP) fundida em-frame com uma gaveta de resistência Zeocin e conduzidas pelo elemento humano para a promotora GFAP ( Figura 1). Próximo clones individuais foram isolados por chapeamento 0,7 células por poço em um prato bem 96 (Figura 2), este foi seguido por determina...

Um protocolo de triagem eficiente é apresentado para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação de Ralevic em células-tronco glioblastoma (GSCs). O ensaio baseia-se em um repórter de diferenciação de células-tronco no qual a expressão da GFP reforçada (eGFP) é conduzida pelo promotor GFAP humano.

Drogas baseada em citometria de fluxo sistema de triagem para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação celular de células-tronco Glioblastoma

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

O objetivo geral deste procedimento é triar bibliotecas de moléculas de pequeno porte em busca de agentes que promovam a diferenciação astroglial em células-tronco de glioblastoma. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo das células-tronco cancerígenas, como quais são as vias de sinalização necessárias para manter as células-tronco de glioblastoma no estado indiferenciado. A execução adequada desta técnica permite a identificação direta de moléculas de pequeno porte que promovem a diferenciação das células-tronco de glioblastoma.A implicação desta técnica estende-se à terapia para o glioblastoma de Ehlers-Danlos, pois reduzir a porcentagem de células-tronco de glioblastoma pode diminuir a probabilidade de recorrência. Este método também pode ser aplicado para definir a diferenciação em outras linhagens celulares utilizando outros construtos de repórter. Nosso relato é o primeiro a estabelecer uma abordagem de alto rendimento para triagem de agentes que forçam as células-tronco de glioma a se diferenciarem.Trabalhar com partículas de lentivírus em células cancerígenas derivadas de pacientes pode ser extremamente perigoso. Portanto, deve-se sempre seguir o procedimento padrão para o manuseio de patógenos transmitidos pelo sangue. Para começar, semeie um milhão de células-tronco de glioblastoma ou CSGs em dois mililitros de meio de crescimento completo para células-tronco neurais em uma placa de seis poços.Em seguida, transduza as células com o lentivírus marcador em uma multiplicidade de infecção igual a cinco. À mistura de células e vírus, adicione dois microlitros de polibreno de modo que a concentração final seja de oito microgramas por mililitro e incube as células a 37 graus Celsius e 5%CO2 durante a noite. Após a incubação, substitua o meio de crescimento para remover o vírus não ligado.Centrifugue as células a 360 vezes G durante cinco minutos. Em seguida, aspire cuidadosamente o meio e plaque as células novamente em uma placa de seis poços. Incube as células por mais 24 horas.Colete 0,5 mililitros do volume total de cultura. Pela as células por centrifugação a 360 ×g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Re-suspenda as células em 0,5 mililitros de meio de crescimento fresco para células-tronco neurais.Coloque a placa de volta no incubador para permitir a expansão por pelo menos 72 horas. Adicione 200 microlitros de reagente de dissociação e incube por cinco minutos em banho-maria ajustado a 37 graus Celsius. Dissocie as células pipetando suavemente para cima e para baixo.Às células dissociadas, adicione 800 microlitros de HBSS para garantir adesão ou agregação celular mínima. Em seguida, transfira 200 microlitros de cada suspensão celular para poços de uma placa de 96 poços. Determine a porcentagem de células que expressam a proteína verde fluorescente por citometria de fluxo.Registre pelo menos 10.000 células viáveis em cada aquisição. Em todas as análises citométricas de fluxo, utilize células parentais não transduzidas ou células transduzidas com vetor não fluorescente para estabelecer a fluorescência de base. Para selecionar e expandir subclones individuais, semeie as células numa densidade de 0,7 célula por poço em 100 microlitros de meio de células-tronco neurais numa placa de 96 poços.Mantenha esses clones em cultura por 11 dias. Fique atento a neuroesferas com diâmetro maior que 100 micrômetros. Nós previamente estabelecemos esse tamanho de corte para determinar retrospectivamente se a neuroesfera foi originada por uma célula-tronco de glioblastoma com capacidade de autorrenovação.Esse tamanho de corte pode precisar de otimização ao trabalhar com diferentes modelos de células de glioblastoma. Observe as células em um microscópio de fluorescência equipado com filtro FITC e marque as poças que contêm uma única neuroesfera na qual aproximadamente de 1% a 5% das células são positivas para GFP. Após a marcação, expanda clones individuais até que um número suficiente de células esteja disponível para análise por citometria de fluxo.Assumindo que os clones do repórter contenham de 1% a 5% de células GFP-positivas, colete 0,5 mililitros de cada clone juntamente com uma quantidade igual de células controle não transduzidas para determinar a porcentagem exata de células GFP-positivas. Após a centrifugação das células a 360 ×g durante cinco minutos à temperatura ambiente, aspire o sobrenadante. Adicione 200 microlitros de reagente de dissociação a cada pellet e incube os tubos em banho-maria ajustado a 37 graus Celsius.Após a incubação, triture as células cerca de 20 a 30 vezes para obter uma suspensão simples de células. Em seguida, adicione 800 microlitros de HBSS para garantir adesão ou agregação celular mínima. Agora, transfira 200 microlitros de cada suspensão celular para os poços de uma placa de 96 poços.Por fim, realize citometria de fluxo, registrando pelo menos 10.000 células viáveis em cada aquisição. Para avaliar a capacidade clonogênica, prepare suspensões simples de células de subclones repórteres de diferenciação pipetando as células cerca de 20 a 30 vezes. Em seguida, plaque essas células em 100 microlitros de meio completo de crescimento de células-tronco neurais, numa densidade de aproximadamente cinco a 500 células por poço em placas de 96 poços.Mantenha essas células em cultura por nove a 11 dias. Procure por neuroesferas ao microscópio óptico. Um poço contendo pelo menos uma única neuroesfera grande é considerado positivo.Considerando as células parentais não transduzidas e as células transduzidas com lentivírus GFP-positivo como controles, insira no interface online do ELDA o número total de poços analisados e o número de células positivas. Para iniciar o screening, semeie 5000 células em 99 microlitros de meio de crescimento completo para células-tronco neurais em uma placa de 96 poços. Em seguida, utilizando um pipetador multicanal de 12 canais, trate as células com uma concentração final de dois micromolares dos compostos da biblioteca diluídos ou com o controle DMSO.Incube as células por 72 horas. Adicione agora 150 microlitros de reagente de dissociação celular utilizando um pipetador de 12 canais em cada poço e incube a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, triture suavemente as células em cada poço cerca de 20 a 30 vezes usando um pipetador de 12 canais até obter uma suspensão de células simples.Agora realize a citometria de fluxo e determine a porcentagem de células que expressam o repórter GFAP:GFP. Primeiro, determine o tamanho celular e a viabilidade a partir dos espalhamentos para frente e lateral e selecione a população de células viáveis. Em seguida, determine as células positivas para GFP dentro da população de células viáveis.Um aumento na porcentagem de células GFP-positivas de três desvios padrão em relação aos controles é considerado um acerto positivo, o que pode ser ajustado conforme a preferência do usuário quanto à rigidez. Imagens representativas de subclones de CEG HSR-GBM1 expressando níveis baixos e altos de GFAP:GFP são apresentadas. Os subclones positivos para expressão de GFAP:GFP foram selecionados por citometria de fluxo na linhagem de neuroesferas derivada de paciente.Aqui, GFAP:GFP baixo indica que menos de 5% das células no clone são positivas para GFP, enquanto GFAP:GFP alto indica que mais de 75% das células no clone são positivas para GFP. Esses resultados mostram que a capacidade de auto-renovação in vitro de subclones GFAP-baixos é maior do que a de seus equivalentes GFAP-altos, conforme determinado pelo ELDA. Portanto, os subclones GH são mais diferenciados do que os subclones GL.Por fim, bibliotecas de fármacos foram triadas para identificar agentes capazes de induzir a diferenciação astróglial em CSGs. Doze fármacos foram encontrados para aumentar significativamente a porcentagem de células que expressam o repórter GFAP:GFP. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em algumas semanas, se for executada corretamente.Após este procedimento, outros métodos como o ensaio alamarBlue, ensaio clonogênico em meios semissólidos e injeção de xenografos subcutâneos ou intracranianos podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o efeito de fármacos seletivos sobre a proliferação celular e a clonogenicidade in vitro, bem como a tumorigenicidade in vivo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar compostos capazes de induzir a diferenciação astróglial em células-tronco de glioblastoma.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este protocolo de vídeo demonstra a aplicação do corante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) para a identificação e separação de diferentes sub-populações de células em glioblastoma humano com base na frequência de divisão celular.

Identificação e isolamento de células em divisão lento no glioblastoma humano usando Carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE)

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar uma linhagem repórter de células-tronco de glioblastoma para identificar a diferenciação de células-tronco de glioblastoma (GSCs) em astroglia. Ele descreve as etapas envolvidas na semeadura de GSCs, transduzindo-as com um lentivírus que codifica GFP e determinando a expressão do repórter GFP por meio de citometria de fluxo.

Um sistema repórter transcricional lentiviral para gerar uma linha repórter de diferenciação de células-tronco de glioblastoma

Protocolo para propagação de amostras cirúrgicas de glioma de alto grau dissociadas em meio neuroesfera livre de soro para selecionar para células com fenótipo de células-tronco cancerosas. Para espécimes que não crescem como neurosferas, um protocolo alternativo é sugerido. Uma técnica de incorporação de parafina para manter a arquitetura da neurosfera 3D para imunocytoquímica é descrita.

Otimização da cultura celular glioma de alto grau a partir de espécimes cirúrgicos para uso em modelos animais clinicamente relevantes e imunoquímica 3D

Identificar novos alvos de medicamentos que fazem a transição de testes pré-clínicos para testes em humanos é uma prioridade científica. Para esse fim, descrevemos aqui uma abordagem genômica funcional para examinar o impacto da depleção de genes em esferóides de linhas de células cancerígenas, que modelam mais apropriadamente cânceres humanos in vivo.

Utilizando Genómica Funcional de triagem para identificar alvos de drogas potencialmente romance em Spheroid culturas de células de câncer

Apresenta-se no presente estudo, um ensaio baseado em fluorescência de novo utilizando linfócitos derivados de um ratinho transgénico. Este ensaio é adequado para rastreio de alto rendimento (HTS) de pequenas moléculas dotadas com a capacidade de qualquer inibição ou promoção da activação dos linfócitos.

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

Aqui, descrevemos técnicas de imagem ao vivo-celular para medir quantitativamente a migração e invasão de células-tronco tumor glioblastoma cerebral ao longo do tempo e sob várias condições de tratamento.

Imagem latente da viver-pilha ensaios de migração de células-tronco do estudo Glioblastoma cerebral Tumor e invasão

Este protocolo descreve a geração de spheroids paciente-derivados, e a análise a jusante que inclui a quantificação da proliferação, do teste da citotoxicidade, da citometria do fluxo, da coloração da imunofluorescência e da imagem latente confocal, a fim avaliar a medicina potencial dos candidatos como terapêutica antineoplásica. Este protocolo suporta a medicina da precisão com identificação de drogas específicas para cada paciente e estágio da doença.

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

As células-tronco de glioma (GSCs) são uma pequena fração de células cancerosas que desempenham papéis essenciais na iniciação do tumor, angiogênese e resistência a medicamentos no glioblastoma (GBM), o tumor cerebral primário mais prevalente e devastador. A presença de GSCs torna o GBM muito refratária para a maioria dos agentes alvos individuais, de modo que métodos de triagem de alto rendimento são necessários para identificar potenciais terapêuticas de combinação eficaz. O protocolo...

Um fluxo de trabalho de triagem rápida para identificar terapia de combinação potencial para GBM usando células-tronco glioma derivadas do paciente

Aqui, estabelecemos uma plataforma de perfil metabólico integrando esferóides de glioma tridimensionais (3D) e normalização baseada em imagem por meio de análise de fluxo extracelular. Essa abordagem permite uma avaliação mais precisa das respostas metabólicas do tumor aos tratamentos medicamentosos e fornece informações sobre os possíveis mecanismos de resistência.

Avanços no perfil metabólico de esferoides tridimensionais de tumores cerebrais para triagem de drogas

Apresentamos um modelo de migração de glioblastoma 3D usando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes geradas a partir de tumores recém-diagnosticados e recorrentes. Esta plataforma permite visualização da dinâmica de migração específica do paciente e avaliação da eficácia terapêutica. O ensaio pode ser multiplexado após a migração para avaliar a localização e os padrões de expressão da proteína.

Ensaio de Migração de Glioblastoma 3D Reproduzível com Localização Magnética de Esferoides Mediadas por Nanopartículas sob Condições Hipóxicas

Aprenda a triagem de pequenas moléculas por citometria de fluxo para promover diferenciação astroglial em células-tronco de glioblastoma. Este método de alta vazão utiliza um repórter GFP-GFAP para identificar agentes terapêuticos potenciais contra o câncer.

Drogas baseada em citometria de fluxo sistema de triagem para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação celular de células-tronco Glioblastoma (Vídeo) | JoVE Journal

Drogas baseada em citometria de fluxo sistema de triagem para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação celular de células-tronco Glioblastoma

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