Drogas baseada em citometria de fluxo sistema de triagem para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação celular de células-tronco Glioblastoma

O objetivo geral deste procedimento é rastrear bibliotecas de pequenas moléculas em busca de agentes que promovam a diferenciação astroglial em células-tronco de glioblastoma. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das células-tronco cancerígenas, como quais são as vias de sinalização necessárias para manter as células-tronco do glioblastoma no estado indiferenciado. A execução adequada desta técnica permite a identificação direta de pequenas moléculas que promovem a diferenciação de células-tronco de glioblastoma.

A implicação dessa técnica se estende à terapia para glioblastoma de Ehlers-Danlos, porque a redução da porcentagem de células-tronco de glioblastoma pode diminuir a probabilidade de recorrência. Este método também pode ser aplicado para definir a diferenciação em outras linhagens celulares usando outras construções repórter. Nosso relatório é o primeiro a estabelecer uma abordagem de alto rendimento para rastrear agentes que forçam as células-tronco do glioma a se diferenciarem.

Trabalhar com partículas de lentivírus em células cancerígenas derivadas de pacientes pode ser extremamente perigoso. Portanto, o procedimento padrão para trabalhar com patógenos transmitidos pelo sangue deve sempre ser seguido. Para começar, semeie um milhão de células-tronco de glioblastoma ou GSCs em dois mililitros de meio de crescimento de células-tronco neurais completas em uma placa de seis poços.

Em seguida, transduza as células com o repórter de lentivírus em uma multiplicidade de infecção igual a cinco. À mistura de células e vírus, adicione dois microlitros de polibrino de modo que a concentração final seja de oito microgramas por mililitro e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2 durante a noite. Após a incubação, substitua o meio de crescimento para remover o vírus não ligado.

E centrifugue as células a 360 vezes G por cinco minutos. Em seguida, aspire cuidadosamente as células médias e da placa de volta em uma placa de seis poços. E continue a incubar as células por 24 horas.

Colha 0,5 mililitros do volume total da cultura. Células de pellets por centrifugação a 360 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda as células em meio de crescimento de células-tronco neurais frescas de 0,5 mililitros.

Coloque a placa de volta na incubadora para permitir a expansão por pelo menos 72 horas. Adicione 200 microlitros de reagente de dissociação e incube por cinco minutos em banho-maria ajustado para 37 graus Celsius. Dissocie as células pipetando suavemente para cima e para baixo.

Às células dissociadas adicione 800 microlitros de HBSS para garantir a fixação ou agregação celular mínima. Em seguida, transfira 200 microlitros de cada suspensão de célula para poços de uma placa de 96 multipoços. Determine a porcentagem de células que expressam a proteína fluorescente verde por citometria de fluxo.

Registre pelo menos 10.000 células viáveis em cada aquisição. Em todas as análises de citometria de fluxo, use células parentais não transduzidas ou células não fluorescentes transduzidas por vetor para estabelecer a fluorescência basal. Selecionar e expandir subclones individuais semeie células a uma densidade de 0,7 células por poço em 100 microlitros de meio de células-tronco neurais em uma placa de 96 poços.

Mantenha esses clones em cultura por 11 dias. Fique atento às neuroesferas com diâmetro superior a 100 mícrons. Estabelecemos anteriormente esse tamanho de corte para determinar retrospectivamente se a neuoresfera foi originada por uma célula-tronco de glioblastoma auto-renovadora.

Esse tamanho de corte pode precisar de otimização ao trabalhar com diferentes modelos de células de glioblastoma. Observe as células sob um microscópio de fluorescência equipado com um filtro FITC e marque os poços que contêm uma única neuroesfera na qual aproximadamente 1% a 5% das células são GFP-positivas. Após a marcação, expanda os clones individuais até que um número suficiente de células esteja disponível para análise por citometria de fluxo.

Supondo que os clones repórter contenham 1% a 5% de células positivas para GFP, colha 0,5 mililitros de cada clone junto com uma quantidade igual de células de controle não transduzidas para determinar a porcentagem exata de células positivas para GFP. Depois de peletizar as células a 360 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante. Adicione 200 microlitros de reagente de dissociação a cada pellet e incube os tubos em banho-maria ajustado para 37 graus Celsius.

Após a incubação, triture as células cerca de 20 a 30 vezes para obter uma única suspensão celular. Em seguida, adicione 800 microlitros de HBSS para garantir a fixação ou agregação celular mínima. Agora transfira 200 microlitros de cada suspensão de célula para poços de uma placa de 96 multipoços.

Por fim, realize a citometria de fluxo, registrando pelo menos 10.000 células viáveis em cada aquisição. Para avaliar a capacidade clonogênica, prepare suspensões unicelulares de subclones repórteres de diferenciação, triturando as células cerca de 20 a 30 vezes. Em seguida, coloque essas células em 100 microlitros de meio de crescimento completo de células-tronco neurais a uma densidade de cerca de cinco a 500 células por poço em placas de 96 poços.

Mantenha essas células em cultura por nove a 11 dias. Procure neuroesferas sob um microscópio de luz. Um poço contendo pelo menos uma única grande neuroesfera é considerado positivo.

Considerando células parentais não transduzidas e células transduzidas por lentivírus positivas para GFP como controles, insira o total de poços analisados e o número de células positivas na interface online do ELDA. Para iniciar a triagem, coloque 5000 células em 99 microlitros de meio de crescimento de células-tronco neurais completas em uma placa de 96 poços. Em seguida, com um pipetador de 12 canais, trate as células com duas concentrações finais micromolares de compostos de biblioteca diluídos ou com o controle DMSO.

Incubar as células durante 72 horas. Agora adicione 150 microlitros de reagente de dissociação celular usando um pipetador de 12 canais em cada poço e incube a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, triture suavemente as células em cada poço cerca de 20 a 30 vezes usando um pipetador de 12 canais até que uma única suspensão celular seja alcançada.

Agora execute a citometria de fluxo e determine a porcentagem de células que expressam o repórter GFAP:GFP. Primeiro, determine o tamanho e a viabilidade da célula a partir das dispersões direta e lateral e bloqueie a população de células viáveis. Em seguida, determine as células GFP-positivas dentro da população de células viáveis.

Um aumento da porcentagem de células positivas para GFP em três desvios padrão em relação aos controles é considerado um acerto positivo que pode ser ajustado para acomodar a preferência do usuário pelo rigor. Imagens representativas de subclones HSR-GBM1 GSC expressando níveis baixos e altos de GFAP: GFP são mostradas. Os subclones positivos para a expressão de GFAP:GFP foram selecionados por citometria de fluxo para a linha de neuroesfera derivada do paciente.

Aqui, GFAP: GFP baixo indica que menos de 5% das células do clone são GFP-positivas, enquanto GFAP: GFP alto indica que mais de 75% das células do clone são GFP-positivas. Esses resultados mostram que a capacidade de auto-renovação in vitro de subclones com baixo teor de GFAP é maior do que suas contrapartes com alto teor de GFAP, conforme determinado pelo ELDA. Portanto, os subclones de GH são mais diferenciados do que os subclones de GL.

Finalmente, bibliotecas de medicamentos foram rastreadas para identificar agentes capazes de induzir diferenciação astroglial em GSCs. Descobriu-se que 12 medicamentos aumentam significativamente a porcentagem de células que expressam o repórter GFAP: GFP. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em algumas semanas se for executada corretamente.

Após este procedimento, outros métodos como ensaio alamarBlue, ensaio clonogênico em meio semissólido, flanco ou injeção de xenógrafo intracraniano podem ser realizados para responder a perguntas adicionais como o efeito de drogas seletivas na proliferação celular e clonogenicidade in vitro e tumorigenicidade in vivo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar compostos capazes de induzir a diferenciação astroglial em células-tronco de glioblastoma.