Drogas baseada em citometria de fluxo sistema de triagem para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação celular de células-tronco Glioblastoma

O objetivo geral deste procedimento é triar bibliotecas de moléculas de pequeno porte em busca de agentes que promovam a diferenciação astroglial em células-tronco de glioblastoma. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo das células-tronco cancerígenas, como quais são as vias de sinalização necessárias para manter as células-tronco de glioblastoma no estado indiferenciado. A execução adequada desta técnica permite a identificação direta de moléculas de pequeno porte que promovem a diferenciação das células-tronco de glioblastoma.

A implicação desta técnica estende-se à terapia para o glioblastoma de Ehlers-Danlos, pois reduzir a porcentagem de células-tronco de glioblastoma pode diminuir a probabilidade de recorrência. Este método também pode ser aplicado para definir a diferenciação em outras linhagens celulares utilizando outros construtos de repórter. Nosso relato é o primeiro a estabelecer uma abordagem de alto rendimento para triagem de agentes que forçam as células-tronco de glioma a se diferenciarem.

Trabalhar com partículas de lentivírus em células cancerígenas derivadas de pacientes pode ser extremamente perigoso. Portanto, deve-se sempre seguir o procedimento padrão para o manuseio de patógenos transmitidos pelo sangue. Para começar, semeie um milhão de células-tronco de glioblastoma ou CSGs em dois mililitros de meio de crescimento completo para células-tronco neurais em uma placa de seis poços.

Em seguida, transduza as células com o lentivírus marcador em uma multiplicidade de infecção igual a cinco. À mistura de células e vírus, adicione dois microlitros de polibreno de modo que a concentração final seja de oito microgramas por mililitro e incube as células a 37 graus Celsius e 5%CO2 durante a noite. Após a incubação, substitua o meio de crescimento para remover o vírus não ligado.

Centrifugue as células a 360 vezes G durante cinco minutos. Em seguida, aspire cuidadosamente o meio e plaque as células novamente em uma placa de seis poços. Incube as células por mais 24 horas.

Colete 0,5 mililitros do volume total de cultura. Pela as células por centrifugação a 360 ×g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Re-suspenda as células em 0,5 mililitros de meio de crescimento fresco para células-tronco neurais.

Coloque a placa de volta no incubador para permitir a expansão por pelo menos 72 horas. Adicione 200 microlitros de reagente de dissociação e incube por cinco minutos em banho-maria ajustado a 37 graus Celsius. Dissocie as células pipetando suavemente para cima e para baixo.

Às células dissociadas, adicione 800 microlitros de HBSS para garantir adesão ou agregação celular mínima. Em seguida, transfira 200 microlitros de cada suspensão celular para poços de uma placa de 96 poços. Determine a porcentagem de células que expressam a proteína verde fluorescente por citometria de fluxo.

Registre pelo menos 10.000 células viáveis em cada aquisição. Em todas as análises citométricas de fluxo, utilize células parentais não transduzidas ou células transduzidas com vetor não fluorescente para estabelecer a fluorescência de base. Para selecionar e expandir subclones individuais, semeie as células numa densidade de 0,7 célula por poço em 100 microlitros de meio de células-tronco neurais numa placa de 96 poços.

Mantenha esses clones em cultura por 11 dias. Fique atento a neuroesferas com diâmetro maior que 100 micrômetros. Nós previamente estabelecemos esse tamanho de corte para determinar retrospectivamente se a neuroesfera foi originada por uma célula-tronco de glioblastoma com capacidade de autorrenovação.

Esse tamanho de corte pode precisar de otimização ao trabalhar com diferentes modelos de células de glioblastoma. Observe as células em um microscópio de fluorescência equipado com filtro FITC e marque as poças que contêm uma única neuroesfera na qual aproximadamente de 1% a 5% das células são positivas para GFP. Após a marcação, expanda clones individuais até que um número suficiente de células esteja disponível para análise por citometria de fluxo.

Assumindo que os clones do repórter contenham de 1% a 5% de células GFP-positivas, colete 0,5 mililitros de cada clone juntamente com uma quantidade igual de células controle não transduzidas para determinar a porcentagem exata de células GFP-positivas. Após a centrifugação das células a 360 ×g durante cinco minutos à temperatura ambiente, aspire o sobrenadante. Adicione 200 microlitros de reagente de dissociação a cada pellet e incube os tubos em banho-maria ajustado a 37 graus Celsius.

Após a incubação, triture as células cerca de 20 a 30 vezes para obter uma suspensão simples de células. Em seguida, adicione 800 microlitros de HBSS para garantir adesão ou agregação celular mínima. Agora, transfira 200 microlitros de cada suspensão celular para os poços de uma placa de 96 poços.

Por fim, realize citometria de fluxo, registrando pelo menos 10.000 células viáveis em cada aquisição. Para avaliar a capacidade clonogênica, prepare suspensões simples de células de subclones repórteres de diferenciação pipetando as células cerca de 20 a 30 vezes. Em seguida, plaque essas células em 100 microlitros de meio completo de crescimento de células-tronco neurais, numa densidade de aproximadamente cinco a 500 células por poço em placas de 96 poços.

Mantenha essas células em cultura por nove a 11 dias. Procure por neuroesferas ao microscópio óptico. Um poço contendo pelo menos uma única neuroesfera grande é considerado positivo.

Considerando as células parentais não transduzidas e as células transduzidas com lentivírus GFP-positivo como controles, insira no interface online do ELDA o número total de poços analisados e o número de células positivas. Para iniciar o screening, semeie 5000 células em 99 microlitros de meio de crescimento completo para células-tronco neurais em uma placa de 96 poços. Em seguida, utilizando um pipetador multicanal de 12 canais, trate as células com uma concentração final de dois micromolares dos compostos da biblioteca diluídos ou com o controle DMSO.

Incube as células por 72 horas. Adicione agora 150 microlitros de reagente de dissociação celular utilizando um pipetador de 12 canais em cada poço e incube a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, triture suavemente as células em cada poço cerca de 20 a 30 vezes usando um pipetador de 12 canais até obter uma suspensão de células simples.

Agora realize a citometria de fluxo e determine a porcentagem de células que expressam o repórter GFAP:GFP. Primeiro, determine o tamanho celular e a viabilidade a partir dos espalhamentos para frente e lateral e selecione a população de células viáveis. Em seguida, determine as células positivas para GFP dentro da população de células viáveis.

Um aumento na porcentagem de células GFP-positivas de três desvios padrão em relação aos controles é considerado um acerto positivo, o que pode ser ajustado conforme a preferência do usuário quanto à rigidez. Imagens representativas de subclones de CEG HSR-GBM1 expressando níveis baixos e altos de GFAP:GFP são apresentadas. Os subclones positivos para expressão de GFAP:GFP foram selecionados por citometria de fluxo na linhagem de neuroesferas derivada de paciente.

Aqui, GFAP:GFP baixo indica que menos de 5% das células no clone são positivas para GFP, enquanto GFAP:GFP alto indica que mais de 75% das células no clone são positivas para GFP. Esses resultados mostram que a capacidade de auto-renovação in vitro de subclones GFAP-baixos é maior do que a de seus equivalentes GFAP-altos, conforme determinado pelo ELDA. Portanto, os subclones GH são mais diferenciados do que os subclones GL.

Por fim, bibliotecas de fármacos foram triadas para identificar agentes capazes de induzir a diferenciação astróglial em CSGs. Doze fármacos foram encontrados para aumentar significativamente a porcentagem de células que expressam o repórter GFAP:GFP. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em algumas semanas, se for executada corretamente.

Após este procedimento, outros métodos como o ensaio alamarBlue, ensaio clonogênico em meios semissólidos e injeção de xenografos subcutâneos ou intracranianos podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o efeito de fármacos seletivos sobre a proliferação celular e a clonogenicidade in vitro, bem como a tumorigenicidade in vivo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar compostos capazes de induzir a diferenciação astróglial em células-tronco de glioblastoma.