Aplicação de técnica de FlpOut MultiColor para estudar a alta resolução única célula morfologias e interações de células da Glia em Drosophila
20 de outubro de 2017
Células exibir diferentes morfologias e estabelecer uma variedade de interações com seus vizinhos. Este protocolo descreve como para revelar a morfologia das células únicas e para investigar a interação célula-célula, usando o sistema de expressão Gal4/UAS bem estabelecido.
O objetivo geral desta técnica é visualizar morfologias de células únicas em tecidos anatômicos complexos, simplificando assim o estudo da interação celular em Drosophila. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre morfologias complexas e interações celulares usando a mosca da fruta. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser adaptada ao estudo de morfologias unicelulares em qualquer tecido e em qualquer estágio de desenvolvimento.
Demonstrando o procedimento estará Anja Kieser, técnica em nosso laboratório. A técnica MCFO modifica a técnica FlpOut padrão da seguinte maneira. Um choque térmico FLP recombinase e diferentes repórteres permanecem sob controle UAS, no entanto, cada repórter tem uma espinha dorsal comum de uma superpasta miristoilada GFP, na qual cópias de uma tag de epítopo foram inseridas.
As proteínas não fluorescentes resultantes são chamadas de GFPs de monstro espaguete e são identificadas com anticorpos. Dependendo do número de excisões, uma combinação diferente de epítopos é expressa. Como o promotor HSP é ligeiramente ativo a 25 graus Celsius, configure cruzamentos a 18 graus Celsius onde ele está realmente inativo.
Em seguida, aguarde cerca de 20 dias para obter a geração F1. Separe as fêmeas e os machos F1 em frascos separados. Para chocá-los termicamente, primeiro transfira-os para frascos de alimentos frescos quando tiverem três a quatro dias de idade.
As moscas mais jovens podem ser muito delicadas para causar choque térmico. Em seguida, transfira os frascos para um banho-maria a 37 graus Celsius. Mergulhe-os profundamente para garantir um choque térmico homogêneo.
Para marcação esparsa de células gliais, comece com cinco a oito minutos de choque térmico e depois otimize. O tempo ideal de choque térmico rotulará esparsamente as células-alvo e sua relação depende do driver GAL4 específico em uso. Após o choque térmico, coloque os frascos horizontalmente na bancada por alguns minutos para resfriá-los.
Agora, comece a manter as moscas a 25 graus Celsius nos mesmos frascos. Após dois dias, a expressão do repórter será ideal e as moscas poderão ser dissecadas. Em preparação, coloque três poços de depressão profunda no gelo.
Encha um poço com etanol a 70%, um com PBS e outro com meio de cultura celular S2. Em seguida, coloque um prato de dissecação de três centímetros forrado com silicone preto com S2 frio. Realize todas as dissecções em S2 para manter os tecidos saudáveis. Agora, anestesie as moscas com dióxido de carbono.
Em seguida, usando uma pinça ou uma pena, coloque as moscas em etanol frio a 70% por cerca de 30 segundos, seguido de PBS frio por cerca de 30 segundos e depois transfira-as para o S2 frio. Assim, lave todas as moscas a serem dissecadas. Até 10 moscas de um genótipo geralmente são suficientes. Agora, dentro de 30 minutos, disseque todos os cérebros.
Primeiro, separe a cabeça do resto do corpo e descarte o corpo. Mantenha a cabeça segurada com a mão afastada durante toda a dissecação ou será muito difícil recuperá-la. Em seguida, puxe um olho segurando o tecido apenas logo abaixo da retina.
Em seguida, retire o outro olho e, assim, exponha o cérebro e os tecidos circundantes. Em seguida, remova todo o tecido traqueal e a cutícula restante ao redor do cérebro, até que o tecido cerebral pareça limpo. Todo o tecido traqueal deve ser removido para obter os melhores resultados de coloração.
Isso é tudo o que é necessário para preparar o cérebro para a fixação. Prossiga com a dissecação de todos os cérebros, mantendo os cérebros dissecados em S2 frio. Tente ter até 10 cérebros preparados por tubo de microcentrífuga para uma coloração ideal. Transfira os cérebros isolados usando uma ponta de pipeta P10 para um tubo de microcentrífuga de 200 microlitros com solução fixadora.
Nunca manuseie o cérebro usando fórceps. Incube os tecidos protegidos da luz. Evite aspirar o cérebro durante as transferências de solução.
Para remover o fixador, use três ou mais lavagens de 15 minutos com solução de lavagem. Em seguida, bloqueie os tecidos com solução de bloqueio por 30 minutos ou mais. Em seguida, substitua a solução de bloqueio por anticorpos primários diluídos em solução de lavagem e incube os cérebros durante a noite a quatro graus Celsius.
Para remover os anticorpos primários, use três lavagens de uma hora em solução de lavagem. Em seguida, adicione anticorpos conjugados com fluoróforo secundário em solução de lavagem e incube os cérebros durante a noite a quatro graus Celsius ou por quatro horas em temperatura ambiente. Para lavar completamente os anticorpos não ligados, use três lavagens de uma hora em solução de lavagem seguida de uma lavagem mais longa com PBS.
Em seguida, monte os cérebros. Prepare duas lamínulas com um espaçador de imaginação. No espaçador e na lamínula extra, aplique 10 microlitros de meio de montagem com um agente anti-desbotamento.
Em seguida, usando uma pipeta P10, transfira os cérebros para a lamínula, depositando-os ao lado do meio junto com um pouco de PBS. Não deixe o tecido secar. Agora, mova cuidadosamente os cérebros para o meio de montagem usando a pipeta e, finalmente, mova-os para o meio no espaçador e organize-os com uma pinça.
Em seguida, remova o revestimento adesivo dos espaçadores e coloque uma lamínula. Prenda a lamínula com um pouco de pressão usando uma pinça e prossiga imediatamente com a imagem ou armazene as lâminas a menos 20 graus Celsius para análise posterior. Usando os métodos descritos, três repórteres marcados com membrana diferentes são mantidos em silêncio por terminadores transcricionais flanqueados por locais FRT.
Quando os animais receberam choque térmico, a FLP recombinase foi expressa e removeu aleatoriamente os terminadores, levando à expressão de diferentes combinações de repórteres. No geral, as diferentes combinações de repórteres fornecem sete cores diferentes, portanto, várias morfologias de células únicas podem ser visualizadas e estudadas individualmente. Vários tempos de choque térmico foram testados com EG-GAL4 e ALG-GAL4.
A marcação de uma única célula foi analisada na região do lobo antenal do cérebro. O driver EG-GAL4 expresso no revestimento de células gliais que estão todas embainhadas na superfície do lobo antenal. Em comparação, a glia semelhante a astrócitos visada pelo ALG-GAL4 cobriu principalmente áreas não sobrepostas do lobo antenal.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular células únicas em solução. A fim de entender suas relações complexas e anatômicas usando Drosophila e em princípio e em organismo modelo no qual o sistema binário GAL4 UIS pode ser aplicado. Ao tentar este procedimento pela primeira vez, é importante lembrar primeiro de otimizar o tempo de choque térmico e seguir o máximo possível as etapas individuais do protocolo de coloração para obter os melhores resultados.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para visualizar morfologias de células individuais e investigar interações entre células em Drosophila utilizando o sistema de expressão Gal4/UAS. A técnica simplifica o estudo de tecidos anatômicos complexos e pode ser adaptada para diversos tecidos e estágios de desenvolvimento.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia do Desenvolvimento
Antecedentes
- As células exibem diversas morfologias e interações.
- Compreender essas interações é crucial para a biologia do desenvolvimento.
- O sistema Gal4/UAS é uma ferramenta versátil para estudos de expressão gênica.
- Drosophila serve como um organismo modelo eficaz para tais estudos.
Objetivo do Estudo
- Para visualizar morfologias de células individuais em tecidos complexos.
- Para investigar interações entre células em um contexto de desenvolvimento.
- Para adaptar o método a diversos tecidos e estágios.
Métodos Utilizados
- A técnica MCFO modifica a técnica FlpOut.
- Utiliza a recombinase FLP induzida por choque térmico e repórteres controlados por UAS.
- Emprega GFP superdobrada miroilada com marcadores epitópicos.
- Demonstrada por um técnico de laboratório.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de morfologias de células individuais.
- Compreensão aprimorada das interações entre células.
- Adaptabilidade da técnica em diferentes tecidos.
- Potencial de aplicação em diversos estágios de desenvolvimento.
Conclusões
- O método fornece informações sobre interações celulares complexas.
- Ele pode ser amplamente aplicado em pesquisas de biologia do desenvolvimento.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para uma compreensão mais profunda.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender a morfologia das células gliais e seus padrões de interação in vivo é essencial para reduzir os riscos associados a hipóteses de alvos neurobiológicos e orientar a seleção de modelos pré-clínicos. A técnica MultiColor FlpOut (MCFO) permite a marcação de células individuais com alta resolução em tecidos complexos, apoiando a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer a arquitetura celular e as relações espaciais. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva nos esforços de validação de alvos em programas de neurociência voltados à descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da morfologia e organização espacial de subtipos de células gliais para apoiar testes de hipóteses específicas.
- Valor Operacional: Oferece um método reprodutível para visualizar arquiteturas em nível de única célula em tecido neural intacto.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera rótulos individualizados em células únicas quantitativamente distinguíveis para triagem morfológica e mapeamento de interações.
- Valor Operacional: Produz marcação padronizada e esparsa compatível com leituras de ensaios baseados em imagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem de sistemas relevantes para doenças ao permitir a fenotipagem detalhada de células gliais em modelos de Drosophila de função neural.
- Valor Operacional: Facilita a continuidade entre a avaliação de morfologia descoberta e os fluxos de trabalho de validação pré-clínica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A técnica MCFO integra-se a fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a avaliação orientada por hipóteses da estrutura e interação de células gliais, informando a seleção de alvos e a relevância do modelo antes das etapas de identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a desmistificação mecanicista por meio da visualização de alta resolução das morfologias gliais e do padrão espacial in vivo.
- Triagem: Permite a marcação padronizada e esparsa de células individuais para triagem fenotípica baseada em imagens da arquitetura glial.
- Análises: Gera leituras multicoloridas que permitem a comparação quantitativa de forma celular, território e padrões de interação entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta dados morfológicos da fase de descoberta a modelos pré-clínicos ao estabelecer parâmetros fenotípicos gliais de referência.
- Reutilização Empresarial: Representa uma plataforma de marcação reutilizável aplicável a diferentes tecidos neurais e estágios de desenvolvimento em Drosophila.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos gliais por meio da visualização direta da morfologia e interação em nível de célula única.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e padronização por meio da indução controlada por choque térmico e otimização da marcação esparsa.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não avançar ao fornecer confiança morfológica quanto à relevância do alvo e à fidelidade do modelo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos gliais com base em fenótipos estruturais e espaciais validados.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em genética de Drosophila, sistemas GAL4/UAS e protocolos com recombinase Flp induzível por choque térmico.
- Depende do acesso à microscopia de fluorescência e detecção baseada em anticorpos para repórteres com epítopos marcados (HA, FLAG, V5).
- Necessita otimização da duração do choque térmico para obter marcação esparsa com drivers GAL4 específicos.
- Envolve fluxos de trabalho padronizados de dissecação, fixação e imunomarcagem para preservar a integridade tecidual e a qualidade do sinal.
- Restringe-se à detecção de epítopos marcados, em vez de fluorescência em tempo real, exigindo processamento de tecidos fixados e etapas de imunomarcagem.
