Aplicação de técnica de FlpOut MultiColor para estudar a alta resolução única célula morfologias e interações de células da Glia em Drosophila
October 20th, 2017
Células exibir diferentes morfologias e estabelecer uma variedade de interações com seus vizinhos. Este protocolo descreve como para revelar a morfologia das células únicas e para investigar a interação célula-célula, usando o sistema de expressão Gal4/UAS bem estabelecido.
O objetivo geral desta técnica é visualizar morfologias de células únicas em tecidos anatômicos complexos, simplificando assim o estudo da interação celular em Drosophila. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre morfologias complexas e interações celulares usando a mosca da fruta. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser adaptada ao estudo de morfologias unicelulares em qualquer tecido e em qualquer estágio de desenvolvimento.
Demonstrando o procedimento estará Anja Kieser, técnica em nosso laboratório. A técnica MCFO modifica a técnica FlpOut padrão da seguinte maneira. Um choque térmico FLP recombinase e diferentes repórteres permanecem sob controle UAS, no entanto, cada repórter tem uma espinha dorsal comum de uma superpasta miristoilada GFP, na qual cópias de uma tag de epítopo foram inseridas.
As proteínas não fluorescentes resultantes são chamadas de GFPs de monstro espaguete e são identificadas com anticorpos. Dependendo do número de excisões, uma combinação diferente de epítopos é expressa. Como o promotor HSP é ligeiramente ativo a 25 graus Celsius, configure cruzamentos a 18 graus Celsius onde ele está realmente inativo.
Em seguida, aguarde cerca de 20 dias para obter a geração F1. Separe as fêmeas e os machos F1 em frascos separados. Para chocá-los termicamente, primeiro transfira-os para frascos de alimentos frescos quando tiverem três a quatro dias de idade.
As moscas mais jovens podem ser muito delicadas para causar choque térmico. Em seguida, transfira os frascos para um banho-maria a 37 graus Celsius. Mergulhe-os profundamente para garantir um choque térmico homogêneo.
Para marcação esparsa de células gliais, comece com cinco a oito minutos de choque térmico e depois otimize. O tempo ideal de choque térmico rotulará esparsamente as células-alvo e sua relação depende do driver GAL4 específico em uso. Após o choque térmico, coloque os frascos horizontalmente na bancada por alguns minutos para resfriá-los.
Agora, comece a manter as moscas a 25 graus Celsius nos mesmos frascos. Após dois dias, a expressão do repórter será ideal e as moscas poderão ser dissecadas. Em preparação, coloque três poços de depressão profunda no gelo.
Encha um poço com etanol a 70%, um com PBS e outro com meio de cultura celular S2. Em seguida, coloque um prato de dissecação de três centímetros forrado com silicone preto com S2 frio. Realize todas as dissecções em S2 para manter os tecidos saudáveis. Agora, anestesie as moscas com dióxido de carbono.
Em seguida, usando uma pinça ou uma pena, coloque as moscas em etanol frio a 70% por cerca de 30 segundos, seguido de PBS frio por cerca de 30 segundos e depois transfira-as para o S2 frio. Assim, lave todas as moscas a serem dissecadas. Até 10 moscas de um genótipo geralmente são suficientes. Agora, dentro de 30 minutos, disseque todos os cérebros.
Primeiro, separe a cabeça do resto do corpo e descarte o corpo. Mantenha a cabeça segurada com a mão afastada durante toda a dissecação ou será muito difícil recuperá-la. Em seguida, puxe um olho segurando o tecido apenas logo abaixo da retina.
Em seguida, retire o outro olho e, assim, exponha o cérebro e os tecidos circundantes. Em seguida, remova todo o tecido traqueal e a cutícula restante ao redor do cérebro, até que o tecido cerebral pareça limpo. Todo o tecido traqueal deve ser removido para obter os melhores resultados de coloração.
Isso é tudo o que é necessário para preparar o cérebro para a fixação. Prossiga com a dissecação de todos os cérebros, mantendo os cérebros dissecados em S2 frio. Tente ter até 10 cérebros preparados por tubo de microcentrífuga para uma coloração ideal. Transfira os cérebros isolados usando uma ponta de pipeta P10 para um tubo de microcentrífuga de 200 microlitros com solução fixadora.
Nunca manuseie o cérebro usando fórceps. Incube os tecidos protegidos da luz. Evite aspirar o cérebro durante as transferências de solução.
Para remover o fixador, use três ou mais lavagens de 15 minutos com solução de lavagem. Em seguida, bloqueie os tecidos com solução de bloqueio por 30 minutos ou mais. Em seguida, substitua a solução de bloqueio por anticorpos primários diluídos em solução de lavagem e incube os cérebros durante a noite a quatro graus Celsius.
Para remover os anticorpos primários, use três lavagens de uma hora em solução de lavagem. Em seguida, adicione anticorpos conjugados com fluoróforo secundário em solução de lavagem e incube os cérebros durante a noite a quatro graus Celsius ou por quatro horas em temperatura ambiente. Para lavar completamente os anticorpos não ligados, use três lavagens de uma hora em solução de lavagem seguida de uma lavagem mais longa com PBS.
Em seguida, monte os cérebros. Prepare duas lamínulas com um espaçador de imaginação. No espaçador e na lamínula extra, aplique 10 microlitros de meio de montagem com um agente anti-desbotamento.
Em seguida, usando uma pipeta P10, transfira os cérebros para a lamínula, depositando-os ao lado do meio junto com um pouco de PBS. Não deixe o tecido secar. Agora, mova cuidadosamente os cérebros para o meio de montagem usando a pipeta e, finalmente, mova-os para o meio no espaçador e organize-os com uma pinça.
Em seguida, remova o revestimento adesivo dos espaçadores e coloque uma lamínula. Prenda a lamínula com um pouco de pressão usando uma pinça e prossiga imediatamente com a imagem ou armazene as lâminas a menos 20 graus Celsius para análise posterior. Usando os métodos descritos, três repórteres marcados com membrana diferentes são mantidos em silêncio por terminadores transcricionais flanqueados por locais FRT.
Quando os animais receberam choque térmico, a FLP recombinase foi expressa e removeu aleatoriamente os terminadores, levando à expressão de diferentes combinações de repórteres. No geral, as diferentes combinações de repórteres fornecem sete cores diferentes, portanto, várias morfologias de células únicas podem ser visualizadas e estudadas individualmente. Vários tempos de choque térmico foram testados com EG-GAL4 e ALG-GAL4.
A marcação de uma única célula foi analisada na região do lobo antenal do cérebro. O driver EG-GAL4 expresso no revestimento de células gliais que estão todas embainhadas na superfície do lobo antenal. Em comparação, a glia semelhante a astrócitos visada pelo ALG-GAL4 cobriu principalmente áreas não sobrepostas do lobo antenal.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rotular células únicas em solução. A fim de entender suas relações complexas e anatômicas usando Drosophila e em princípio e em organismo modelo no qual o sistema binário GAL4 UIS pode ser aplicado. Ao tentar este procedimento pela primeira vez, é importante lembrar primeiro de otimizar o tempo de choque térmico e seguir o máximo possível as etapas individuais do protocolo de coloração para obter os melhores resultados.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para visualizar morfologias de células únicas e investigar interações célula-célula em Drosophila usando o sistema de expressão Gal4/UAS. A técnica simplifica o estudo de tecidos anatômicos complexos e pode ser adaptada para vários tecidos e estágios de desenvolvimento.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia do Desenvolvimento
Contexto
- As células exibem morfologias e interações diversas.
- Entender essas interações é crucial para a biologia do desenvolvimento.
- O sistema Gal4/UAS é uma ferramenta versátil para estudos de expressão gênica.
- Drosophila serve como um organismo modelo eficaz para tais estudos.
Objetivo do Estudo
- Visualizar morfologias de células únicas em tecidos complexos.
- Investigar interações célula-célula em um contexto de desenvolvimento.
- Adaptar o método para vários tecidos e estágios.
Métodos Utilizados
- A técnica MCFO modifica a técnica FlpOut.
- Utiliza recombinase FLP sob choque térmico e repórteres controlados por UAS.
- Emprega GFP superfolder miristoilada com tags de epítopos.
- Demonstrado por um técnico de laboratório.
Principais Resultados
- Visualização bem-sucedida de morfologias de células únicas.
- Entendimento aprimorado das interações célula-célula.
- Adaptabilidade da técnica em diferentes tecidos.
- Potencial de aplicação em vários estágios de desenvolvimento.
Conclusões
- O método fornece insights sobre interações celulares complexas.
- Pode ser aplicado amplamente na pesquisa de biologia do desenvolvimento.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para uma compreensão mais profunda.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Understanding glial cell morphology and interaction patterns in vivo is critical for de-risking neurobiological target hypotheses and informing preclinical model selection. The MultiColor FlpOut (MCFO) technique enables high-resolution single-cell labeling in complex tissues, supporting mechanistic de-risking by clarifying cellular architecture and spatial relationships. This capability enhances predictive confidence in target validation efforts within discovery neuroscience programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glial subtype morphology and spatial organization to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible method for visualizing single-cell architectures in intact neural tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively distinguishable single-cell labels for morphological screening and interaction mapping.
- Operational Value: Produces standardized, sparse labeling compatible with imaging-based assay readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling detailed glial phenotyping in Drosophila models of neural function.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery morphology assessment to preclinical validation workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The MCFO technique integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven assessment of glial cell structure and interaction, informing target selection and model relevance prior to lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking through high-resolution visualization of glial morphologies and spatial patterning in vivo.
- Screening: Enables standardized, sparse single-cell labeling for imaging-based phenotypic screening of glial architecture.
- Analytics: Generates multi-color readouts that allow quantitative comparison of cell shape, territory, and interaction patterns across conditions.
- Translational Research: Connects discovery-stage morphology data to preclinical models by establishing glial phenotypic benchmarks.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable labeling platform applicable across neural tissues and developmental stages in Drosophila.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in glial target validation through direct visualization of single-cell morphology and interaction.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization via controlled heat-shock induction and sparse labeling optimization.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing morphological confidence in target relevance and model fidelity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of glial targets based on validated structural and spatial phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, GAL4/UAS systems, and heat-shock inducible Flp recombinase protocols.
- Dependent on access to fluorescence microscopy and antibody-based detection for epitope-tagged reporters (HA, FLAG, V5).
- Necessitates optimization of heat-shock duration to achieve sparse labeling for specific GAL4 drivers.
- Involves standardized dissection, fixation, and immunostaining workflows to preserve tissue integrity and signal quality.
- Limited to epitope-tag detection rather than live fluorescence, requiring fixed-tissue processing and immunostaining steps.
