Name: Aplicação de técnica de FlpOut MultiColor para estudar a alta resolução única célula morfologias e interações de células da Glia em Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a técnica MCFO para visualizar morfologias de células únicas e interações celulares em Drosophila. Este método utiliza o sistema Gal4/UAS e pode ser adaptado para diversos tecidos e estágios de desenvolvimento.

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Os autores agradecer Arnim Jenett Aljoscha Nern e outros membros do laboratório Rubin para aconselhamento e partilha de reagentes inéditos e Janelia voar luz equipe do projeto para a geração de imagens confocal. Os autores também agradecer aos membros do laboratório Gália para comentários sobre o manuscrito.

1. moscas preparando-se para experiências MultiColor FlpOut (MCFO) Nota: técnica de The MCFO refere-se a uma versão modificada da excisão de gaveta mediada por Flp parada chamado (FlpOut). Transgénicas MCFO moscas carregam um promotor de choque térmico (hsp)-recombinase Flp e repórteres diferentes sob UAS controlam. Cada repórter consiste de um backbone comum de um myristoylated (myr) super pasta verde proteína fluorescente (sfGFP), no quais 10 cópias de uma marca de epítopo (EG., HA, bandeira ou V5) foram inseridos. As proteínas não-fluorescente resultantes são nomeadas &#34; monstro de espaguete GFPs &#34; (smGFPs) 14 e podem ser detectados usando anticorpos específicos contra as tags epítopo diferente.
<ol><li>Cruz voa com o hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) e a gaveta MCFO para as glia GAL4 motorista linhas apropriadas (veja a tabela de materiais) .
	<ol><li>Como o hsp já está ativo a 25 ° C e poucas células podem sofrer recombinação, levando a uma rotulagem inespecíficos, configurar cruzes a 18 ° C para evitar a leakiness do sistema. Espere cerca de 20 dias a 18 ° C para obter a geração F1. Após o calor choque (consulte a etapa 2), manter as moscas a 25 ° C ( Figura 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. Choque de calor Nota: dependendo do local de inserção, a eficiência de hsp-Flp pode diferir; portanto, o tempo de choque do calor ideal tem que ser otimizado. Para este protocolo, foi usado um estoque de mosca MCFO no qual o hsp-Flp foi inserido no cromossomo X (veja a Tabela de materiais).
<ol><li>Transferência a descendência da Cruz na etapa 1.1 (moscas de geração F1, 3-4 dias de idade) em novos frascos contendo alimento e calor chocá-los a 37 ° C em banho-maria. 
	Nota: O jovens moscas (1-2 dias de idade) são muito sensíveis ao choque térmico. Espere 1 ou 2 dias antes de realizar o choque térmico a fim de reduzir a mortalidade causada pelo tratamento. Uso alguns da geração F1 voa como um controle, sem choque térmico.</li>
	<li>Durante o choque de calor, manter moscas em frascos normais com alimentos para diminuir a taxa de mortalidade induzida por estresse. Coloque as fêmeas e os machos em frascos separados.</li>
	<li>Certifique-se de mergulhar o frasco inteiro na água, certifique-se de um choque de calor homogêneo. Use um choque de 5-8 min como ponto de partida adequado para a rotulagem esparsas de células da glia com muitas linhas de motorista GAL4; a duração do choque deve ser otimizada para cada motorista e experiência (tempos de choque de calor mais curtos ou mais longos podem ser necessários).</li>
	<li>Após o choque de calor, colocar os frascos horizontalmente no banco por alguns minutos para permitir que as moscas para se recuperar do choque e calor. 
	Nota: Não é necessário mudar os frascos.</li>
	<li>Manter as moscas a 25 ° C e dissecar (consulte a etapa 3 e 4)-2 ou mais dias após o choque do calor para expressão ideal repórter.</li>
</ol> 3. Preparação de dissecação e soluções <ol><li>o dia da dissecação, preparar solução fresca de fixador em 200 tubos PCR µ l misturando 180 µ l de meio de cultura celular S2 com 20 µ l de 20% paraformaldeído (PFA) para obter uma solução PFA de 2%. Manter a solução fixador no gelo antes e durante a dissecção. 
	Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado. 
	Nota: Misturar 160 µ l de meio de cultura celular S2 com 40 µ l de 20% paraformaldeído (PFA) em um tubo de 200 µ l do PCR para preparar uma solução PFA 4% em vez de uma solução de 2%.</li>
	<li>Usar um tubo de PCR por genótipo com um máximo de 8-10 cérebros pelo tubo para obter melhores resultados de coloração.</li>
	<li>Prepara o cérebro adulto solução de lavagem: albumina de soro bovino 0,5%, 0,5% Triton X-100 em PBS. 
	Nota: Dependendo da mancha, uma solução que contém 1% Triton X-100 pode ser necessários. Uma maior concentração de Triton X-100 aumenta a penetração do anticorpo nos tecidos e é necessário para as regiões de mancha que jazem profundamente dentro do tecido (por exemplo, regiões de sináptica no cérebro adulto Drosophila).</li>
	<li>Preparar a solução de bloqueio: soro de cabra normal de 3%, 3% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 em PBS.</li>
	<li>o cérebro de um adulto lavar a solução e a solução de bloqueio pode ser armazenado a 4 ° C por algumas semanas.</li>
	<li>Colocar a placa de vidro de poços de depressão profunda no gelo e encha cada um bem com as seguintes soluções: uma com etanol a 70%, um com PBS e outra com meio de cultura celular S2.</li>
</ol> 4. Adulto dissecação cerebral <ol><li>posicionar um 3cm dissecando o prato no palco de um estereomicroscópio e preenchê-lo com meio de cultura celular S2 frio. Realizar todas as dissecções neste meio para garantir que o tecido permaneça saudável durante o processo de dissecação. 
	Nota: Use um dissecação prato forrado com vários milímetros de silicone preto que fornece um contraste de bons antecedentes (nas imagens) e preservar a pinça durante a dissecção.</li>
	<li>Anestesiar as moscas do genótipo desejado com CO 2.</li>
	<li>Com fórceps, pegue a voar pelas asas e lave-o em álcool etílico frio de 70% por 30 s, então com PBS frio para adicional de 30 s.</li>
	<li>Transferir a mosca para a bem de depressão profunda que é preenchida com meio de cultura celular S2.</li>
	<li>Repita o mesmo procedimento para todas as moscas com o mesmo genótipo e mantê-las em meio de cultura celular S2 frio até dissection, que vai preservar o tecido. 
	Nota: Anestesiar apenas o número de moscas que pode ser dissecado em um período de cerca de 30 min. longos períodos de incubação em meio de cultura celular S2 pode danificar o tecido.</li>
	<li>Pegar mosca com fórceps e, sob um estereomicroscópio, submergir a voar em meio de cultura celular S2.</li>
	<li>Separar a cabeça do resto do corpo. Descartar o corpo e manter a cabeça submergida em meio de cultura celular de S2. É extremamente importante manter a cabeça com fórceps para toda a duração da dissecação. Se a cabeça começa a flutuar, será difícil para recuperá-lo sem danificar o tecido.</li>
	<li>Começar a dissecação por arrancar um olho, enquanto segura a cabeça pelo menos um fórceps em todos os momentos. Certifique-se de que a ponta da pinça é logo abaixo da retina para evitar danificar o tecido por baixo. Puxe para fora o outro olho e começar a remover a cutícula, até o cérebro aparece.</li>
	<li>Remover todo tecido traqueal e cutícula ao redor do cérebro até o tecido parece limpo. Certifique-se de remover todo o tecido traqueal em torno do cérebro para obter melhores resultados de coloração; os tecidos agora estão prontos para ser corrigido e manchada.</li>
	<li>Manter o meio de cultura de células de todos os cérebros dissecados em S2 frio antes de transferi-los para a solução PFA fim de vez a etapa de fixação.</li>
</ol> 5. Cérebro adulto de coloração < ol> <li>Transferir o cérebro isolado com uma pipeta de P10 para a solução PFA em temperatura ambiente (RT). Para evitar danos aos tecidos, nunca use fórceps para transferir o cérebro após a dissecação. Executar todas as etapas em 200 µ l cadeia da polimerase em um nutator.</li>
	<li>Para todas as etapas, antes de eliminar a velha solução com uma pipeta P200, permitir que o cérebro resolver na parte inferior do tubo. Tente remover o sobrenadante sem aspiração do tecido. Proteger o tecido da exposição à luz.</li>
	<li>Consertar o cérebro em 200 µ l de 2% PFA em meio de cultura celular S2 por 1h ou em 4% PFA durante 30 minutos. Manter os tempos de fixação idêntico entre as amostras a fim de aumentar a reprodutibilidade.</li>
	<li>Depois de 3 (ou mais) lava de 15 minutos cada em 200 µ l de solução, de lavagem de cérebro adulto bloquear os tecidos com 200 µ l de solução de bloqueio por 30 minutos. Tempos de incubação mais em solução de bloqueio são possíveis.</li>
	<li>Incubar o cérebro durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários diluídos no cérebro adulto, solução de lavagem em um volume total de 200 µ l. 
	Nota: Os tempos de incubação podem variar dependendo do tipo de anticorpo usado. Incubação do tempo pode ser necessária.
	<ol><li>Para a rotulagem dos três marcadores MCFO, incubar o cérebro com anti-HA (1: 500), anti-FLAG (epítopo DYKDDDDK) (1: 100) e os anticorpos primários de anti-V5.</li>
		Anticorpos conjugados diretamente de <li>primária poderiam ser usados em vez da combinação normal primária + secundária (ex., anti-549 V5:DyLight (1: 200)). Neste caso, tratar os anticorpos conjugados diretamente como anticorpos secundários. 
		Nota: Para cada genótipo, manter um pouco de cérebro como controles para verificar a especificidade da coloração. Pular a incubação do anticorpo primário e ir diretamente para a próxima etapa.</li>
	</ol></li> <li>Lavar os tecidos 3 vezes durante 1 h em 200 µ l de cérebro de um adulto (passo 3.3) de solução de lavagem e incube-os com fluoróforo-conjugados/primário diretamente conjugada com anticorpos secundários diluídos no cérebro adulto, solução de lavagem durante a noite em 4 ° C ou para 4h no RT, em um volume total de 200 µ l Nota: exemplos de anticorpos apropriados: AlexaFluor 488 (1: 250), anti-549 V5:DyLight (1: 200) e DyLight 647 (1: 100)-conjugados anticorpos.</li>
	<li>Lavar o cérebro 3 vezes durante 1 h em 200 µ l de solução, seguida por uma lavagem final em 200 µ l de PBS durante a noite a 4 ° C ou para 1-2 h em RT de lavagem de cérebro adulto; a etapa de lavagem final em PBS remove quaisquer vestígios de Triton X-100 e é necessária para óptimos resultados de coloração. Montar o cérebro no meio de montagem com um agente antidesvanece-se em lamelas de vidro.</li>
</ol> 6. Montagem de cérebros para a imagem latente espaçador <ol><li>Trim uma imagem para o tamanho adequado, com uma tesoura. Para a microscopia de alta resolução, sanduíche do espaçador de espécime e imagem latente entre as lamelas de vidro dois. 
	Nota: Imagem latente de espaçadores é fina (0,12 mm de espessura) adesivos espaçadores que descascam e grudar lâminas lamelas ou microscópio, permitindo a montagem de espécimes sem compressão.</li>
	<li>Usando fórceps, remova o revestimento adesivo de um piso e aplicar o espaçador, o lado adesivo para baixo, sobre a superfície de uma lamela de vidro (22 x 60 mm). Aplicar 10 µ l de meio de montagem a uma lamela de vidro novo.</li>
	<li>Com um P10 pipeta, transferir o cérebro de tubo de 200 µ l para a lamela, junto à gota de meio de montagem. Juntamente com os tecidos, transferir alguns PBS para manter o cérebro em solução.</li>
	<li>Com um P10 pipeta, mover o cérebro da PBS para a gota de meio de montagem a tentar limitar a quantidade de PBS. Transferi as amostras em meio de montagem a lamela com o espaçador de imagem. Use bastante meios de montagem para cobrir o espécime.</li>
	<li>Remover o outro revestimento adesivo do lado superior do espaçador e adicionar uma lamela de vidro em cima dos espécimes. Com a ponta de uma pinça, aplique uma ligeira pressão sobre a área adesiva para selar. A imagem montados tecidos imediatamente ou armazenar os slides a-20 ° C para posterior análise.</li>
</ol> 7. Aquisição de imagem <ol><li>adquirir pilhas de imagens confocal de fluorescência usando um microscópio confocal com um 40 X (at = 1.2, imersão de água) objectivo ou 63 X (nd = 1,4, imersão de óleo) objectivo (tamanho do pixel = 1.024 x 1.024 no plano XY; Distância entre duas seções confocal = 0,5 µm). Ajustar o ganho do detetor e deslocamento em cada canal de forma que nenhum pixels saturados e valores zero pixel estão presente nas imagens; Isto evita a perda de informações e garante o uso da gama dinâmica plena do detector. 
	Nota: Desde que a imagem em 3D é demorada, as medições podem ser automatizadas pela verificação de amostras múltiplas em paralelo em diferentes locais. Para evitar a evaporação, com o objectivo de imersão de água, usar meio de imersão de óleo especial com índice de refração n = 1,33.</li>
	<li>Processar as pilhas confocal para projeções de densidade máxima, alterações na matiz de canal e ajuste de brilho e contraste usando qualquer software de análise de imagem padrão (veja a Tabela de materiais).</li>
</ol>

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</ol>

Nenhum dos autores tem interesses concorrentes ou conflitantes.

Este protocolo descreve um método fácil e eficiente para estudar a morfologia dos diferentes tipos de células dentro de um tecido de interesse em alta resolução. Com a técnica MCFO, vários repórteres com epítopo diferente tags são usados em combinação para a rotulagem estocástico multicolor (Figura 2). Semelhante a outros métodos, como Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO aumenta a diversidade de rótulo at...

Glia, a população de células não-neuronais do sistema nervoso (NS), foram por muito tempo acreditou que fornecem uma estrutura estática de neurônios e, portanto, não foram estudados em detalhe. No entanto, em humanos, glia constituem a grande maioria das células no NS (~ 90%) e caem em várias categorias diferentes, incluindo astrócitos, oligodendrócitos, micróglia e células de Schwann. Em Drosophila, glia constituem cerca de 10% das células da NS. Curiosamente, suas morfologias e funções são muito semelhantes aos encontrados em vertebrados1,2. Suas morfologias incluem a barreira hemato - encefálica (BBB) formando epitélios, ensheathing e células astrocyte.
O sistema nervoso central de Drosophila (CNS) é composto das seguintes estruturas principais: regiões do córtex que contêm os corpos celulares neuronais; neuropils que abrigar conexões sinápticas; intervalos de axônio de pequenos e grandes que se conectar a diferentes neuropiles; nervos periféricos que conectam os músculos e órgãos sensoriais com o CNS (Figura 1). Glia encontram-se associados com todas estas estruturas anatômicas: glia Cortex (CG) nas regiões corticais, como astrocyte glia (AIG) e ensheathing glia (EG) nas regiões neuropile, ensheathing glia também estão associados com intervalos de axônio central e periférico nervos (EGN) e finalmente, duas folha-como glia, glia perineurial (PG) e subperineurial (SPG), que juntos formam uma camada contígua que cobre o NS inteiro (Figura 2).
Estudos anteriores mostraram que glia desempenham papéis importantes no desenvolvimento do NS; monitorar os números de celular neuronal por reagir a circula sistemicamente insulin-como peptides, fornecem suporte trófico para os neurônios, tais como o transporte do lactato astrocyte-neurônio e eliminar os neurônios morrendo por fagocitose3,4 , 5 , 6. no NS maduro, glia manter o BBB, ocupam os neurotransmissores e manter a homeostase iónica, atuam como as principais células do sistema imunológico da ns, desde que os macrófagos não podem violar o BBB e modulam a atividade sináptica, bem como comportamento animal6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Se os diferentes subtipos gliais executam funções especializadas permanece uma importante questão em aberto. No entanto, uma análise sistemática de todo o genoma da glia, especialmente no adulto, é dificultada pela falta de ferramentas genéticas adequadas para sua manipulação. Aqui, um método que permite a caracterização eficiente e fácil de formas de célula para estudar interações célula-célula complexo é apresentado. Esta técnica foi aplicada para caracterizar a morfologia dos diferentes subtipos gliais no cérebro adulto Drosophila , mas, dependendo do driver específico GAL4 usado, isso poderia ser adaptado para estudar neurônios12,13 , qualquer tipo de entrelaçamento de células e em princípio qualquer tecido em qualquer fase do desenvolvimento.

<table><tbody><tr><td>Banho-maria</td><td>Grant</td><td>GD100</td><td></td></tr><tr><td>Tubos PCR</td><td>Sarstedt</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Dumont</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Prato de dissecação 30 mm x 12 mmm</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>70543-30</td><td>Prato de dissecção de vidro</td></tr><tr><td>Pyrex 3 Depressão Placa de ponto de vidro</td><td>Corning</td><td>7223-34</td><td>Placas de dissecação de vidro</td></tr><tr><td>Sylgard Black</td><td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td><td>805998</td><td>feito em casa com carvão</td></tr><tr><td>ExpressFive S2 meio de cultura de células</td><td>Invitrogen</td><td>10486-025</td><td></td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Normal soro de burro</td><td>Jackson Laboratories</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit HA-tag</td><td>Cell Signaling</td><td>C29F4</td><td>Anticorpo primário, diluição 1:500</td></tr><tr><td>Rat FLAG-tag</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-06712</td><td>Anticorpo primário, diluição 1:100</td></tr><tr><td>Mouse V5-tag:DyLight 549</td><td>AdSerotec</td><td>0411</td><td>Conjugado anticorpo, diluição 1:200</td></tr><tr><td>anti-coelho AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>Anticorpo secundário, diluição 1:250</td></tr><tr><td>anti-rato DyLight 647</td><td>Jackson Laboratories</td><td>712-605-153</td><td>Anticorpo secundário, diluição 1:100</td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SlowFate Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Espaçador de Vedação Segura</td><td>Grace Biolabs</td><td>Entre em contato com a</td><td></td> empresa para fazer o pedido</tr><tr><td>de Vidro de cobertura do microscópio 22 X 60 mm</td><td>Marienfeld</td><td>101152</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura do microscópio 22 x 22 mm</td><td>Roth</td><td>H874</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico, Leica MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>518 F</td><td>Óleo de imersão para microscopia de fluorescência, sem halogênio</td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>W 2010</td><td>Fluido de imersão para objetivas de imersão em água, sem halogênio</td></tr><tr><td>R56F03-GAL4 (EG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>39157</td><td>GAL4 driver</td></tr><tr><td>R86E01-GAL4 (ALG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>45914</td><td>GAL4 driver</td></tr><tr><td>hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64085</td><td>Repórter UAS (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td></tr><tr><td>Fiji (Imagem J)</td><td></td><td></td><td>Software de análise de imagem</td></tr><tr><td>Multi Time</td><td>Macro Zeiss</td><td></td><td>Software para digitalização automatizada</td></tr></tbody></table>

aplicação de técnica de flpout multicolor para estudar a alta resolução única célula morfologias e interações de células da glia em drosophila

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Células exibem morfologias diferentes e complexas relações anatômicas. Como as células interagem com seus vizinhos? Que as interações diferem entre tipos de células, ou mesmo dentro de um determinado tipo? Quais os tipos de regras espaciais que eles seguem? As respostas a essas perguntas fundamentais na vivo foram dificultadas até agora por falta de ferramentas para a rotulagem de célula única de alta resolução. Aqui, um protocolo detalhado para atingir células única com uma técnica de FlpOut MultiColor (MCFO) é fornecido. Esse método se baseia em três diferentemente marcados repórteres (HA, bandeira e V5) sob controle UAS que são mantidos em silêncio por um terminador transcricional ladeado por dois sites FRT (FRT-paragem-FRT). Uma onda de choque do calor induz a expressão de um calor induzida por choque Flp recombinase, que aleatoriamente elimina as fitas FRT-FRT-paragem em células individuais: expressão ocorre apenas em células que expressam também um driver GAL4. Isto leva a uma matriz de cores diferentes células de um tipo de célula dado que permite a visualização da morfologia das células individuais em alta resolução. Como exemplo, a técnica MCFO pode ser combinada com drivers de GAL4 gliais específicos para visualizar as morfologias dos diferentes subtipos gliais no cérebro adulto drosófila .

Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos usando a técnica MCFO no cérebro adulto drosófila . A Figura 3 mostra um esquema do método. Três diferentemente a membrana-tag repórteres (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-bandeira e myr-smGFP-V5) sob controle UAS são mantidos em silêncio por um terminador transcricional ladeado por dois sites FRT (FRT-paragem-FRT). Uma onda de choque do calor induz a expressão de recombinase d...

Células exibir diferentes morfologias e estabelecer uma variedade de interações com seus vizinhos. Este protocolo descreve como para revelar a morfologia das células únicas e para investigar a interação célula-célula, usando o sistema de expressão Gal4/UAS bem estabelecido.

Aplicação de técnica de FlpOut MultiColor para estudar a alta resolução única célula morfologias e interações de células da Glia em Drosophila

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

O objetivo geral desta técnica é visualizar as morfologias de células individuais em tecidos anatômicos complexos, simplificando assim o estudo das interações entre células em Drosophila. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre morfologias complexas e interações entre células utilizando a mosca-das-frutas. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser adaptada para o estudo de morfologias de células individuais em qualquer tecido e em qualquer estágio de desenvolvimento.Quem demonstrará o procedimento será Anja Kieser, uma técnica em nosso laboratório. A técnica MCFO modifica a técnica padrão FlpOut da seguinte maneira. Uma recombinase FLP induzida por choque térmico e diferentes repórteres permanecem sob controle de UAS; no entanto, cada repórter possui um arcabouço comum de GFP superdobrada miroilada, no qual cópias de uma marcação por epítopo foram inseridas.As proteínas não fluorescentes resultantes são denominadas spaghetti monster GFPs e são identificadas com anticorpos. Dependendo do número de excisões, uma combinação diferente de epítopos é expressa. Como o promotor HSP apresenta atividade ligeira a 25 graus Celsius, monte os cruzamentos a 1

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Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Descrevemos as características estruturais das sinapses Glia-neuromuscular em um romance de preparação dos tecidos dentro para fora-de larvas de moscas ao vivo usando corantes fluorescentes com microscopia confocal. Nós rotulados terminais de neurônios fluorescentes viver com anticorpos primários para HRP, e também visualizar o espaço perisynaptic com Dextranos fluorescente.

Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Aqui nós descrevemos um protocolo para analisar a migração de células gliais no olho Drosophila desenvolvimento, utilizando análise microscópica ao vivo emparelhado com GFP tag células gliais.

Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem

Este vídeo demonstra a coloração por imunofluorescência de um cérebro transgênico de Drosophila para imagens de células gliais de células únicas. O cérebro expressa proteínas direcionadas à membrana fundidas com diferentes combinações de epítopos antigênicos sob o controle de um sistema de recombinase específico da glia. Os cérebros isolados e fixados são corados com anticorpos primários específicos para os epítopos antigênicos, seguidos por anticorpos secundários conjugados com fluoróforo.

Coloração por imunofluorescência de cérebros de Drosophila para a imagem de célula única de células gliais

Nós apresentamos uma técnica para etiquetar neurônios no sistema nervoso central (SNC)...

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados.

Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

Este protocolo descreve a dissecção e imunocoloração de adultos Drosophila melanogaster tecidos do cérebro. Especificamente, este protocolo destaca o uso da Drosophila cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios como subconjuntos neuronal de exemplo que podem ser usados com precisão para descobrir princípios gerais subjacentes a muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

No embrião drosophila primitivo, muitas organelas são motile. Em princípio, eles podem ser imagens ao vivo através de sondas fluorescentes específicas, mas a casca de ovo impede a aplicação direta ao embrião. Este protocolo descreve como introduzir tais sondas através de microinjeção e, em seguida, analisar o movimento da organela em massa através da velocimetria de imagem de partículas.

Visualizando o tráfico dependente de citoesqueleto de organelas contendo lipídios em embriões Drosophila

Aqui, métodos não invasivos são descritos para localização de proteínas de membrana fotorreceptora e avaliação da degeneração da retina no olho composto de Drosophila usando fluorescência eGFP.

Estudando o tráfico de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas marcadas pelo eGFP

A hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão (EASI-FISH) é uma técnica robusta que combina microscopia de expansão com hibridização in situ de fluorescência (FISH) para detectar a expressão de vários genes em tecidos espessos. Este protocolo descreve os recentes avanços no método e sua adaptação para rotular o sistema nervoso central intacto da Drosophila.

Detecção multiplex da expressão gênica no cérebro intacto de Drosophila usando hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão

Aprenda a técnica MCFO para visualizar morfologias de células únicas e interações celulares em Drosophila. Este método utiliza o sistema Gal4/UAS e pode ser adaptado para diversos tecidos e estágios de desenvolvimento.

Aplicação de técnica de FlpOut MultiColor para estudar a alta resolução única célula morfologias e interações de células da Glia em Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal

Aplicação de técnica de FlpOut MultiColor para estudar a alta resolução única célula morfologias e interações de células da Glia em Drosophila

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