Name: Determinação de área óptica transversal muscular dos músculos de voo indirecto adulto de Drosophila Melanogaster (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Aprenda a quantificar a área muscular em Drosophila melanogaster para avaliar massa muscular indiretamente. Este método utiliza inclusão em resina e análise de imagem para estudar atrofia em modelos de Distrofia Miotônica.

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Os autores gostaria de agradecer os membros do grupo de genômica translacional e Kathryn J Hanson para o feed-back e as melhorias no presente protocolo. Este projeto foi realizado com bolsa de pesquisa SAF2015-64500-R, que inclui fundos europeus de Desenvolvimento Regional, concedido ao Ramalho pelo Ministerio de Economia y competitividade.

1. fixação e incorporação de resina
<ol><li>Anestesia as moscas com dióxido de carbono (CO2) ou através de hipotermia, usando um bloco de gelo. Use um microscópio dissecação (com baixa ampliação para ver toda mosca) e tesoura para remover as pernas, asas, cabeça e a parte terminal do abdômen para facilitar a penetração do fixador. Cuidado, manipulação das carcaças é necessário nesta etapa para evitar a deformação do tórax. Nota: Comece com pelo menos 12 moscas por genótipo para garantir um número suficiente de indivíduos devidamente processados no final do procedimento.</li>
	<li>Transfira as carcaças para um tubo de 1,5 mL no gelo (colocando um máximo de 6 pessoas por tubo) contendo 200 µ l de solução 1. Nota: As carcaças não podem permanecer na solução 1 para mais de 20 min.<ol>
<li>Para a solução 1, misturar componentes nessas proporções de volume: ¼ paraformaldeído 4%, ¼ de 8% de glutaraldeído, ¼ 0,2 M Na2HPO4 e 0,2 M ¼ NaH2PO4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar 200 µ l de solução 2 e incubar no gelo por 30 min.<ol>
<li>Solução 2: Misture a solução 1 e OsO4 em uma proporção de 1:1 (v/v). Cuidado: OsO4 é extremamente tóxico. Manipulá-lo em uma coifa com medidas adequadas de segurança e de reciclagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire todo o líquido. Adicionar 200 µ l de solução 2 e incubar no gelo por 1-2 h.</li>
	<li>Remover a solução e desidratar as amostras através de uma série de etanol classificados da seguinte forma: uma vez em 30%, 50%, 70%, 90% e duas vezes em etanol absoluto; 5 min cada. Adicione 1 mL de etanol para cobrir as amostras. Nota: Uma vez que o tecido é colocado em etanol a 90%, as etapas subsequentes podem ser executadas em temperatura ambiente.</li>
	<li>Incube as amostras duas vezes em óxido de propileno por 10 min cada incubação. Atenção: O óxido de propileno é tóxico, usá-lo em uma coifa.</li>
	<li>Substituir o óxido de propileno por uma mistura de 1:1 (v/v) de óxido de resina e propileno de epóxi e incubar à temperatura ambiente durante a noite. Cuidado: A resina é extremamente tóxica em estado líquido. A resina está disponível como um conjunto de quatro componentes (A, B, C e D).<ol>
<li>Para resina epóxi, adicione num copo descartável de 54 g de resina (A), 44,5 g de endurecedor (B), 2,5 g de accelerator (C) e 10 g de plastificante (D). Combine todos os componentes de resina em uma coifa. Armazene a resina em alíquotas a-20 ° C (por até 6 meses) ou a-80 ° C (por vários anos).</li>
		<li>Para descartar a resina, asse a 70 ° C por 24 h porque resina sólida não é tóxica. Descarte todas as soluções anteriores no grupo de metais pesados, de acordo com os procedimentos internacionais adequados, porque soluções podem conter vestígios de OsO4.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Substitua a mistura anterior com 100% de resina e incubar as amostras para 4 h.</li>
	<li>Transferi as carcaças para moldes de plástico que contém a nova resina (uma carcaça em cada poço do molde). Usar uma vara afiada de madeira ou agulha para transferir e orientar as carcaças dos poços e deixar a resina para polimerizar durante a noite em um forno de Pasteur a 70 ° C. Nota: Para garantir orientação adequada das carcaças para posterior desbaste e de corte, as carcaças devem ser deitado no seu lado comprido, com a parte anterior da carcaça muito perto da borda do poço.</li>
</ol>2. limpeza e corte de blocos
<ol><li>Remova os blocos de resina polimerizada os moldes. Use lâminas de barbear para aparar a resina, uma forma trapezoidal em torno da carcaça e dar orientação adequada no micrótomo. Comece todas as carcaças de corte após a sutura transversal para obter resultados comparáveis. Nota: A seção deve ser perpendicular ao eixo ântero-posterior da webcam para aparar a amostra corretamente ( Figura 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> Figura 3 . Dorsoventral seções de thoraces adultos resina-incorporado a distrofia miotônica modelo moscas. Em (A), o corte da amostra não era correto, conforme a seção na parte dorsal direita da imagem não foi completamente transversal aos músculos. Como consequência, os pacotes de três músculos do lado direito superior parecem maiores do que os do lado esquerdo. Este erro resultaria em uma superestimação da área muscular. (B) seção de um bloco de resina corretamente aparadas. Barra de escala: 200 µm.
<ol><li>Corte 1,5 µm seções espessas com um ultramicrotome e transferir as seções em gotas de água sobre slides gelatinizadas.<ol>
<li>Obter as seções do segmento mesothorax para todas as amostras obter resultados comparáveis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque as lâminas contendo as seções em um bloco de aquecimento a 70-80 ° C, até que se evapore o H2O. Neste ponto, as amostras podem ser observadas com o contraste de4 OsO (Figura 4A).</li>
</ol>3. coloração de seções IFM
<ol><li>Cobrir as seções com suficiente toluidina azul para aproximadamente 30 s no bloco de aquecimento.<ol>
<li>Para a solução de azul de toluidina, dissolver 1% de azul de toluidina e 1% de bórax em H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enxaguar com H2O e deixar os slides sobre uma chapa quente para evaporar a água. Repita a coloração com toluidina azul se o contraste precisa ser reforçada (Figura 4B).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> Figura 4 . Dorsoventral seções de resina-incorporado thoraces adultos com contraste diferentes colorações. Ambos os painéis mostram imagens de DM1 modelo moscas alimentadas com Abp1 como na Figura 2D. (A) a imagem de uma seção com o contraste de4 OsO. (B) seção manchada de toluidina azul permite melhor visualização dos pacotes musculares. Barra de escala: 200 µm.
4. montagem seções IFM
<ol><li>Seca as lâminas com o bloco de aquecimento até que se evapore o H2O.</li>
	<li>Coloque 1 ou 2 gotas de meio de montagem nas secções e coloque sobre uma lamela. Atenção: Realizar esta etapa em uma coifa, porque o meio de montagem é tóxico.</li>
</ol>5. aquisição de imagens e quantificação da área muscular
<ol><li>Com as imagens em baixa ampliação para que todo o conjunto de músculos DLM está em foco. Normalmente usamos 10 X.<ol>
<li>Para análise estatística leva pelo menos 5 imagens seriais por mosca e analisar pelo menos 5 moscas por grupo experimental.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione a imagem que contém os músculos inteiro (Figura 5A). Verifique o eixo ou a orientação da seção e descartar as amostras com orientação inadequada, o que distorceria os resultados (comparar figuras 3A / 3B para distinguir entre o mal e seções bem orientadas, respectivamente).</li>
	<li>Use o software ImageJ para selecionar uma área (em pixels) que contém apenas a webcam (Figura 5A/5B). Para comparação entre diferentes grupos experimentais, a área de referência a ser usado seria sempre a voar com os músculos maiores. Em todas as imagens de diferentes genótipos de comparar, selecionar uma área contendo webcam de dimensões iguais à área de referência (Figura 5B).</li>
	<li>Binarize as imagens com o comando imagem-J: Processo/binário/fazer binário e excluir as áreas ou pixels que não correspondem aos músculos de interesse (Figura 5).<ol>
<li>No caso de artefactual manchas pretas aparecem em outras áreas além do músculo, excluí-los com o comando ferramentas de desenho e selecione o símbolo de borracha.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> Figura 5 . Procedimento de análise para determinação de área do músculo de imagem. (A) seção transversal da distrofia miotônica tipo 1 modelo voar do tórax com um retângulo que contém a DLM. (B) área selecionada com apenas os músculos de voo indirecto e o intestino (*). (C) Binarized imagem. As áreas pretas correspondem aos músculos de interesse. O intestino foi apagado por uma quantificação precisa da área do músculo. Barra de escala: 200 µm.
<ol start="5"><li>Quantificar a percentagem de pixels correspondente ao tecido muscular (pixels pretos) total com o comando: Analyze/medição e selecione a opção fração de área. Esta percentagem de área é uma estimativa da massa muscular de cada mosca DLM.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li>
<li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+%28DLM%29+of+Drosophila%3A+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li>
<li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/00atlas.htm">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li>
<li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Platin+Met+Rev%22%5BJournal%5D)">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li>
<li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1165/">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li>
<li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li>
<li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscleblind%2C+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li>
<li>García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li>
<li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li>
<li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184(2010).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223(2014).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Foi demonstrado que a Drosophila melanogaster é um modelo útil para estudar doenças neuromusculares humanas7,10,11, incluindo distrofias miotônicas, que se caracterizam pelo aparecimento de atrofia muscular. O protocolo aqui apresentado é uma ferramenta útil para quantificar a degeneração muscular causada pelo aparecimento ou progressão de uma doença específica em um modelo de voar. Por exemplo, também é possível acompa...

O tórax de mosca da fruta contém duas classes diferentes dos músculos de voo, que são funcionalmente, fisiologicamente e anatomicamente distintas. Estes músculos são: os músculos de voo indirecto (IFM), que são compostos de dorso-longitudinal (DLM) e músculos dorso-ventral (DVM) (Figura 1) e o voo síncrono controlam músculos1,2. Estes músculos juntos geram a elevada potência mecânica necessária para o voo. O tamanho, a distribuição e a disposição rostro-caudal dos IFMs permitam uma fácil orientação para corte transversal3 (Figura 2A). Por esta razão, nós selecionamos estes músculos para estudar a atrofia muscular em Drosophila melanogaster.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> Figura 1. Diagrama do tórax da mosca da fruta, mostrando os músculos de voo indirecto (IFMs) disposição. (Esquerda) representa uma vista lateral e (direita) representa uma seção transversal do tórax. Os IFMs são compostas dos músculos Dorso-longitudinal (DLM) (em vermelho) e o Dorso-ventral (DVM) músculos (em verde).
Preservação da estrutura do tecido e o controle sobre a orientação do eixo dorso-ventral dos cortes histológicos são críticos para garantir uma avaliação adequada da área transversal do músculo. Para preservar a estrutura muscular, usamos uma mistura de fixação modificada de Tomlinson et al 4 . Além disso, porque os músculos são tecidos internos, a impermeabilidade da drosófilado exoesqueleto é um problema como fixação misturas não podem penetrar os tecidos-alvo. Para contornar este problema, nós removemos a cabeça voar, pernas, asas e os dois últimos segmentos do abdome para criar buracos que permitiram a mistura de fixação entrar. Como parte do protocolo de fixação, que incluímos o tratamento com tetróxido de ósmio (OsO4)5, que é amplamente utilizado devido à sua capacidade de corrigir as gorduras, incluindo os triglicerídeos. OsO4 preserva a maioria das estruturas extremamente bem, particularmente a nível citológico e ao mesmo tempo proporciona o contraste da imagem. Após a fixação, Drosophila thoraces foram embutidos em resina para transversal semi fina corte (1,5 µm). Para melhor contraste, tecido pode ser adicionalmente manchado com toluidina azul. Imagens de thoraces completas foram tiradas em 10 X e área muscular foi quantificada por binarizing imagens (de dimensões iguais) e quantificar a percentagem de pixels correspondente ao tecido muscular (pixels pretos) total, com software ImageJ.
Modificações no tecido preparação e fixação misturas, como o aumento da concentração da solução de4 e glutaraldeído OsO, introduzida no presente protocolo, permitido exclusiva preservação do tecido muscular. Isso ocorre porque o protocolo evita a degradação e a deformação do tecido, tornando a análise posterior das amostras mais confiável, mesmo em condições altamente atróficas associadas com doenças degenerativas neuromusculares tais como distrofia miotônica (DM). Na sua forma mais comum, DM tipo 1, esta desordem genética rara é provocada pela expandido CUG repetições em transcrições de proteína quinase de distrofia miotônica (DMPK). Mutante DMPK RNA agrega focos de ribonuclear de forma que sequestram as Muscleblind como nuclear RNA-proteínas (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) em Drosophila)6. Geramos um modelo de drosófila de distrofia miotônica expressando 250 repetições CTG sob o promotor de cadeia pesada de miosina muscular (Mhc-Gal4). Modelo moscas foram incapazes de voar com um fenótipo típico 'up-realizado asas' e tinham muscular grave atrofia em seus IFMs (Figura 2B). Estudos anteriores realizados em nosso laboratório mostraram que a determinação da área muscular do IFMs é um método confiável para quantificar os efeitos de diferentes modificadores químicos ou genéticos o atrofiamento muscular nestas moscas modelo7. Como exemplo, superexpressão de Mbl isoforma C em moscas, expressando o CTG 250 se repete no músculo, alcançado um resgate da área do músculo, como Mbl depleção por sequestro é o fator desencadeante em DM1 patogênese8 (Figura 2). Área do músculo também foi resgatada depois de alimentar o modelo DM voa com Abp1, um Hexapeptídeo com anti-DM1 comprovada atividade9 (Figura 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> Figura 2. Quantificação das secções dorsoventral da resina-incorporado thoraces adultos. Músculos de voo indireta (A-D) de Drosophila melanogaster com os genótipos relevantes indicados. (A) controle de moscas (yw). (B) a expressão de 250 não-codificantes CTG se repete no músculo (UAS-CTG(250)x) causou uma redução da área de músculo na webcam em comparação com o controle de moscas. (C) este fenótipo de atrofia muscular foi resgatado pela superexpressão de Muscleblind (MblC) (UEA-CTG (250) x UAS-MblC) e (D) alimentando as moscas de modelo com o Hexapeptídeo Abp1 (UEA-CTG (250) x Abp1). Em todas as imagens do lado dorsal está no topo. Transgenes foram impulsionadas a muscle usando um promotor de cadeia pesada de miosina (Mhc)-Gal4. (E) a quantificação da percentagem de área muscular relativo para as controle de moscas confirmou que as diferenças foram significativas. O histograma mostra meios ± no MEV mostrou * *p< 0,01 e * p < 0,05 (Student´s t-teste). Barra de escala: 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O método aqui relatado será de interesse para pesquisadores, com foco no desenvolvimento muscular, manutenção e envelhecimento, patologia da doença e teste de drogas, pois fornece informações confiáveis sobre como o tecido muscular responde a fatores endógenos e externos.

<table><tbody><tr><td>Software Image-J</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Ultramicrótomo</td><td>Leica</td><td>Leica UC6</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Leica</td><td>Leica MZ6</td><td>Técnica de campo claro.</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>71970</td><td>Existem vários fornecedores alternativos.</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Mundo de Precisão Mundial</td><td>14003</td><td>Existem vários fornecedores alternativos.</td></tr><tr><td>Moldes de incorporação</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>70900</td><td>Existem vários fornecedores alternativos.</td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Fluka (Sigma)</td><td>49624</td><td>Tóxico.</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>Polyscience</td><td>0972A</td><td>Extremamente tóxico.</td></tr><tr><td>Óxido de propileno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82320-250ML</td><td>Extremamente tóxico.</td></tr><tr><td>resina (Durcupan)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44611-44614</td><td>Carcinogênico quando não polimerizado.</td></tr><tr><td>Azul de toluidina</td><td>Panreac</td><td>251176</td><td>tóxico.</td></tr><tr><td>Mountant Médio (DPX)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44581</td><td>Perigoso.</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>prejudicial.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Panreac</td><td>122507</td><td>diluição de 0,2 M.</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Panreac</td><td>121677</td><td>diluição de 0,2 M.</td></tr><tr><td>Bórax</td><td>Panreac</td><td>3052</td><td>Tóxico.</td></tr></tbody></table>

determinação de área óptica transversal muscular dos músculos de voo indirecto adulto de drosophila melanogaster

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Massa muscular, perdendo, conhecida como atrofia muscular, é um fenótipo comum em Drosophila modelos de doenças neuromusculares. Nós usamos os músculos de voo indirecto (IFMs) de moscas, especificamente os músculos dorso-longitudinal (DLM), como o experimental sujeito a medida que o fenótipo atrófico provocado por causas genéticas diferentes. Neste protocolo, descrevemos como incorporar os músculos do tórax voar para corte fino de semi, como obter um bom contraste entre o músculo e do tecido circundante e como processar imagens de microscópio ótico para aquisição semi-automática de dados quantificáveis e análise. Nós descrevemos três aplicações específicas do pipeline metodológica. Primeiro, mostramos como o método pode ser aplicado para quantificar a degeneração muscular em um modelo de distrofia miotônica voar; em segundo lugar, a medição da área transversal do músculo pode ajudar a identificar genes que promovem ou evitem a atrofia muscular e/ou degeneração muscular; em terceiro lugar, este protocolo pode ser aplicado para determinar se um candidato composto é capaz de modificar significativamente um determinado fenótipo atrófico induzido por uma doença-causando mutaçãoou por um gatilho ambiental.

Para quantificar se a superexpressão de MblC ou a administração de Abp1 tiveram qualquer efeito no fenótipo atrófica do modelo mosca distrofia miotônica que enfocamos a webcam, que fazem parte do IFMs (Figura 1). Determinamos que o modelo voa, que expresso 250 repetições CTG não-codificante em toda a musculatura conduzido pelo promotor cadeia pesada de miosina (Mhc)-Gal4, teve uma redução de 50% da área muscular comparado com o controle de moscas. Em...

Nós relatamos um método para quantificar a área do músculo, que é um método indireto para determinar a massa muscular em adultos de Drosophila . Demonstraremos que a aplicação de nossa metodologia, analisando o voo indirecto musculares em um modelo de drosófila de doença distrofia miotônica.

Determinação de área óptica transversal muscular dos músculos de voo indirecto adulto de Drosophila Melanogaster

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a área muscular nos músculos de adultos de Drosophila como um meio de quantificar indiretamente a massa muscular e dimensionar corretamente a geração ou atrofia muscular. Para esse fim, focamos nos músculos dorsolongitudinais devido ao seu tamanho, distribuição e também à contagem nessa posição, que apresenta baixa e fácil orientação para o corte transversal. Um, fixação e inclusão em resina.O primeiro passo do procedimento é anestesiar as moscas com CO₂ e, com auxílio de tesoura e pinça, remover as pernas, as asas e a parte terminal do abdômen. Em seguida, transferir cuidadosamente os cadáveres, evitando a deformação do tórax, para um tubo de 1,5 mL sobre gelo, colocando no máximo seis indivíduos por tubo contendo 200 microlitros da solução um. Os cadáveres não podem permanecer nesta solução por mais de 20 minutos.Finalmente, adicione 200 microlitros da solução dois e incube no gelo por 30 minutos. Após a incubação, remova todo o líquido, adicione 200 microlitros da solução dois e incube as carcaças no gelo por uma a duas horas. O próximo passo é remover a solução e desidratar as amostras por meio de uma série graduada de etanol.Incube as amostras duas vezes em óxido de propileno, durante dez minutos cada incubação. Em seguida, substitua o óxido de propileno por uma mistura de 500 microlitros de resina e 500 microlitros de óxido de propileno e incube as amostras à temperatura ambiente durante a noite. No dia seguinte, substitua a mistura por resina a 100 por cento e incube as amostras por quatro horas.Em seguida, transfira as carcaças para moldes de plástico contendo resina nova, certificando-se de colocar uma carcaça em cada poço do molde. Com um palito de madeira, posicione as carcaças nos poços e deixe a resina polimerizar durante a noite em uma estufa de Pasteur a 70 graus Celsius. Para descartar a resina, aqueça-a a 70 graus Celsius por 24 horas, pois a resina sólida e aquecida não é tóxica.Dois, corte e seccionamento dos blocos. Com a ajuda de lâminas de barbear, remova a resina e forme uma forma trapezoidal ao redor do cadáver para obter a orientação apropriada no micrótomo. Verifique ao microscópio se os músculos estão perfeitamente orientados.Após isso, corte seções de um ponto cinco micrômetro de espessura com um ultramicrótomo e transfira as seções para gotas de água sobre lâminas gelatinizadas. Por fim, coloque as lâminas contendo as seções em um bloco aquecedor a 70 a 80 graus Celsius até que toda a água evapore. Três, coloração de seções de MFI.Cubra as seções com azul de toluidina por aproximadamente 30 segundos no bloco de aquecimento. Em seguida, lave com várias mudanças de água e deixe as lâminas em uma placa aquecida para evaporar a água. Quarto, montagem de seções de MFI.Tomando as lâminas, coloque uma ou duas gotas de meio de montagem nas seções e adicione uma lamínula longa. Cinco, aquisição de imagens e quantificação da área muscular. Utilize o software ImageJ para selecionar uma área contendo apenas os DLMs.Tomando como controle as dimensões da imagem da mosca com a maior área muscular, refine as imagens e exclua as áreas ou pixels que não correspondem aos músculos de interesse. Quantifique a porcentagem de pixels correspondentes ao tecido muscular em relação ao total utilizando o comando analisar, medição, e selecione a opção fração de área. Essa porcentagem de área é uma estimativa da massa muscular DLM de cada mosca.Resultados representativos. Determinamos que as moscas modelo, que expressam 250 repetições não codificantes de CTG em toda a musculatura, direcionadas pelo promotor da cadeia pesada da miosina, MhC Gal quatro, apresentaram uma redução de 50 por cento na área muscular em comparação com as moscas controle. Em contraste, a coexpressão de muscle blind C e repetições expandidas de CTG com o mesmo vetor suprimiu fortemente esse fenótipo, e a área muscular em corte transversal foi de 70 por cento das moscas controle.A administração do hexapeptídeo Abp1 no meio nutricional suprimiu de maneira semelhante o fenótipo atrófico, e as moscas modelo que ingeriram o composto apresentaram aproximadamente 60 por cento da área muscular normal, em vez de 50 por cento, valor típico das moscas DF1. Conclusões. O protocolo apresentado aqui é uma ferramenta útil para quantificar a degeneração muscular provocada pelo início ou pela progressão de uma doença específica em um modelo de mosca. Por fim, este método também é otimizado para detectar pequenas diferenças na área muscular, ou mesmo para quantificar a área de diferentes estruturas, como nefrocitos.Obrigado por assistir.

optical-cross-sectional-muscle-area-determination-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Identificação dos mecanismos subjacentes à lesão muscular é crucial. Aqui apresentamos a técnica histológica para preparar parafina e congeladas seções do Drosophila músculos do tórax. Isto permite a análise da morfologia do músculo e localização de proteínas e outros componentes celulares do músculo.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

Os músculos de vôo da Drosophila são usados como um sistema modelo para o desenvolvimento e fisiologia muscular. Este vídeo descreve a musculatura de voo de adultos e destaca um protocolo para dissecar o desenvolvimento de músculos de voo indireto que são adequados para o sequenciamento de RNA de pupas.

drosófila Dissecção do músculo de voo indireto (IFM) da pupa tardia: um método para coleta de tecido de alto rendimento

C. elegans têm dois tipos de músculos, sarcômero único e sarcômero múltiplo, ou músculos estriados. Este vídeo descreve o arranjo dos músculos estriados da parede corporal, que são responsáveis pela locomoção de um verme e inclui um protocolo de amostra para medir a morfologia muscular usando um software de análise de imagem.

Medidas da área muscular de C. elegans: um método padronizado para quantificar a morfologia do músculo estriado

Neste protocolo, podemos demonstrar a aplicação de tomografia de elétrons serial-seção para elucidar a estrutura mitocondrial no músculo de voo indirecto de Drosophila .

3D ultraestrutura mitocondrial do músculo de voo indirecto Drosophila revelada pela série-seção elétron Tomography

Aqui, apresentamos um método fácil de usar e versátil para executar ao vivo de imagens de processos de desenvolvimento em geral e músculo-tendão morfogênese em particular na vida pupas de Drosophila .

Na Vivo Imagem latente da morfogênese músculo-tendão em pupas de Drosophila

O músculo de vôo de Drosophila é um modelo poderoso para estudar a regulação transcricional, splicing alternativo, metabolismo e mecanobiologia. Nós apresentamos um protocolo para a dissecção do músculo fluorescente-etiquetado do vôo das pupas vivos para gerar amostras altamente enriquecidas ideais para o proteômica e profundamente-arranjar em seqüência. Essas amostras podem oferecer importantes insights mecanísticos em diversos aspectos do desenvolvimento muscular.

Dissecção de músculos de vôo de Drosophila melanogaster para abordagens Omics

É apresentado um protocolo que permite a visualização de melanogaster de Drosophila intacto em qualquer estágio de desenvolvimento utilizando tomografia microcomputada.

Imagem Animal inteira de Drosophila melanogaster usando tomografia microcomputada

Descrevemos uma técnica de dissecção que preserva a arquitetura da junção neuromuscular e permite um estudo imunocitoquímico detalhado dos neurônios motores na perna de Drosophila adulta.

Dissecção e Imunohistoquímica da Perna Adulta Drosophila para detectar alterações na junção neuromuscular para um neurônio motor identificado

Drosophila é um modelo bem estabelecido para estudar moléculas-chave que regulam a miogênese. No entanto, os métodos atuais são insuficientes para determinar a dinâmica transcricional do RNAm e a distribuição espacial dentro dos sincícios. Para resolver essa limitação, otimizamos um método de hibridização in situ por fluorescência de RNA, permitindo a detecção e quantificação de mRNAs em escala de molécula única.

Estudando a Dinâmica Transcricional Muscular em Escalas de Molécula Única em Drosophila

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho rápido e de baixo custo para imagens de alta resolução de olhos adultos de Drosophila para quantificar defeitos de padronização e crescimento. Descrevemos nosso protocolo para preparação de amostras por montagem em ponto, aquisição de imagem de alta resolução e análise de imagem.

Um fluxo de trabalho rápido e simples para quantificação de estruturas externas de Drosophila adulta

Drosophila é um modelo poderoso para entender os mecanismos fundamentais da miogênese. Este protocolo para a dissecção e preparação de hemissecções de tórax permite a análise microscópica do músculo de voo indireto dos estágios pupal e adulto. Este protocolo permite imagens confocais da morfologia celular, localização de proteínas, estrutura muscular e vários outros aspectos da miogênese.

Dissecção de músculos de voo indireto de Drosophila melanogaster para abordagens de microscopia

Aprenda a quantificar a área muscular em Drosophila melanogaster para avaliar massa muscular indiretamente. Este método utiliza inclusão em resina e análise de imagem para estudar atrofia em modelos de Distrofia Miotônica.

Determinação de área óptica transversal muscular dos músculos de voo indirecto adulto de Drosophila Melanogaster

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