Indução de paralisia e lesão do sistema Visual em camundongos por específicos de células T para Neuromielite Óptica Autoantigen Aquaporin-4

Os objetivos gerais deste protocolo são induzir uma doença autoimune do sistema nervoso central ou SNC por meio da transferência adotiva de linfócitos T específicos para aquaporina 4 e monitorar os efeitos resultantes sobre o SNC e o sistema visual dinâmico. Este método ajudará a responder perguntas-chave sobre o papel dos linfócitos T específicos para aquaporina 4, comumente conhecida como AQP4, na neuromielite óptica, bem como em outros distúrbios inflamatórios visuais. A principal vantagem da tomografia de coerência óptica é a capacidade de realizar o monitoramento longitudinal da lesão retiniana de maneira não invasiva.

Demonstrará o procedimento Sharon Sagan, pesquisadora associada no meu laboratório, bem como Andreas Cruz Harans, pesquisador colaborador no Laboratório de RE Greens. Comece acoplando um torneira de três vias de náilon com duas conexões macho tipo Luer lock a uma seringa de vidro com conexão Luer lock, sem o êmbolo. Gire a alavanca da torneira em direção à seringa para fechá-la e posicione a seringa com a extremidade aberta voltada para cima.

Após agitar em vórtex, adicione um volume equivalente de peptídeo e solução de Adjuvante Completo de Freund à seringa e reinsira o êmbolo de vidro na seringa. Mantendo o êmbolo no lugar, inverta a seringa de modo que a torneira esteja voltada para cima e mude a alavanca para a conexão fêmea não utilizada. Pressione cuidadosamente o êmbolo para remover o excesso de ar da seringa.

A solução preencherá a segunda conexão macho Luer lock da torneira de três vias. Em seguida, acople uma segunda seringa de vidro com o êmbolo totalmente inserido na segunda conexão macho Luer lock. Para criar uma emulsão, pressione alternadamente os êmbolos para passar a solução entre as duas seringas por cerca de dois minutos e resfrie a solução por aproximadamente 10 minutos até que haja uma mudança visível na viscosidade da solução.

Quando se formar uma emulsão branca muito rígida, transfira toda a solução para uma das seringas e substitua a seringa vazia por uma nova seringa Luer lock de um milímetro. Encha a nova seringa com a emulsão. Remova a seringa do registro e acople uma agulha de 25 graus.

Para testar a emulsão quanto à consistência com água, expulse uma gota da emulsão em um pequeno recipiente com água. Se a emulsão não se dispersar, ela é adequada para injeção. Em seguida, injete uma vez subcutaneamente cada camundongo doador com nulificação de AQP4 em cada lado do abdômen inferior e em cada lado da parede torácica medialmente à axila.

10 a 12 dias após a imunização, faça uma incisão mediana na pele desde a virilha até o pescoço e descendo por cada perna do primeiro camundongo. Puxe a pele afastando-a do peritônio e fixe-a firmemente à tábua. Em seguida, colete os linfonodos inguinais e axilares e coloque os tecidos em um filtro celular dentro de uma placa de Petri contendo meio completo.

Após coletar todos os linfonodos, coloque o filtro celular sobre um tubo cônico de 50 mililitros contendo meio completo fresco sobre gelo e use a extremidade plana do êmbolo de uma seringa estéril de cinco mililitros para pressionar as células dos linfonodos através da malha do filtro. Enxágue a malha com 20 a 30 mililitros de meio completo para facilitar a recuperação celular, seguido por duas lavagens com centrifugação. Após a segunda centrifugação, ressuspenda o pellet em meio para linfócitos T para contagem.

Adicione as concentrações apropriadas de antígeno, interleucina recombinante de camundongo 23 e IL-6 recombinante de camundongo às células, e adicione dois mililitros de células por poço dessa mistura polarizadora Th17 a cada poço de uma placa de 12 poços. Em seguida, coloque a placa em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de CO₂ por 72 horas. No terceiro dia de polarização, pipete os cultivos em cada poço algumas vezes para desprender as células polarizadas e reúna-os em um tubo cônico de 50 mililitros sobre gelo para contagem.

Após duas lavagens em PBS, dilua as células até uma concentração de um vezes 10 à oitava células por mililitro em PBS e misture suavemente a suspensão celular por meio de movimentos de rotação. Dentro de uma hora após a coleta, transfira as células para uma seringa de um mililitro e administre 200 microlitros de células a cada animal receptor por via intravenosa através da veia da cauda. Em seguida, injete em cada camundongo, por via intraperitoneal, imediatamente e dois dias depois, 200 nanogramas de toxina de B pertussis diluídos em 200 microlitros de PBS.

Para a imagem de retina in vivo dos animais receptores por tomografia de coerência óptica, cinco minutos antes da aquisição de imagem, dilate as pupilas com uma gota de tropicamida 1% em cada olho e ligue o tapete aquecido. Posicione o camundongo sobre o cilindro de imagem e redirecione o fluxo de anestesia adequadamente. Proteja os olhos com hidroxipropil metilcelulose 0,3% para mantê-los úmidos e garantir a continuidade da refração, e coloque uma lente de contato personalizada sobre o olho a ser examinado.

Guiado pela imagem do fundo infravermelho, direcione o laser para o olho coberto pela lente, tomando cuidado para que o feixe esteja centralizado na cabeça do nervo óptico. Realize 25 B-scans no modo de alta resolução e rasterize as imagens a partir de 30 A-scans médios. Após a aquisição de imagens de ambos os olhos, substitua a lente de contato por gel oftálmico e coloque o camundongo em uma gaiola aquecida de recuperação.

Para analisar as imagens adquiridas utilizando o software modular de imagem para a segmentação automatizada, corrija primeiro manualmente os segmentos correspondentes à membrana limitante interna e à camada plexiforme interna, de modo a representar os limites das camadas retinianas internas. Em seguida, verifique se as camadas de fibras nervosas retinianas e de células ganglionares estão situadas dentro dos limites da camada retiniana interna e se não se sobrepõem. A imunização subcutânea com peptídeos AQP4 que contêm epítopos de células T patogênicos induz fortes respostas proliferativas de células T nos linfonodos drenantes de camundongos knockout para AQP4, em comparação com as respostas de células T de tipo selvagem.

As análises citométricas de fluxo da expressão individual de V beta demonstram que linfócitos T específicos por peptídeos de AQP4 que contêm epítopos de linfócitos T patogênicos utilizam repertórios únicos de TCR e apresentam uma hiperproliferação seletiva, indicando que as respostas de linfócitos T patogênicos a esses determinantes são normalmente reguladas pela seleção negativa timica. Aproximadamente de seis a nove dias após a injeção de linfócitos T polarizados, quase todos os camundongos receptores desenvolveram sinais clínicos de doença autoimune do SNC, incluindo cauda mole e paralisia das patas traseiras. Linfócitos T específicos para AQP4 polarizados para Th17 induziram uma doença clínica mais grave do que linfócitos T específicos para AQP4 polarizados para Th1.

Por exemplo, este camundongo desenvolveu paralisia completa dos membros posteriores após a administração de células T específicas pelo peptídeo AQP4 polarizadas para Th17. A doença clínica induzida por células Th17 específicas pelo peptídeo AQP4 também está associada à infiltração de células mononucleares no parênquima e nas meninges do SNC, bem como à inflamação do nervo óptico, evidenciada ainda por inchaço e aumento da espessura da camada interna da retina, que retorna ao valor basal conforme os camundongos se recuperam da doença. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir e monitorar a autoimunidade direcionada à AQP4, o que permitirá estudos adicionais para compreender como as células T participam da neuromielite óptica.