Indução de paralisia e lesão do sistema Visual em camundongos por específicos de células T para Neuromielite Óptica Autoantigen Aquaporin-4

Os objetivos gerais deste protocolo são induzir doença autoimune do sistema nervoso central ou do SNC pela transferência adotiva de células T específicas da aquaporina 4 e monitorar os efeitos resultantes no SNC e no sistema visual dinâmico. Este método ajudará a responder a perguntas-chave sobre o papel da aquaporina 4, comumente conhecida como AQP4, células T específicas na neuromielite óptica, bem como em outros distúrbios visuais inflamatórios. A principal vantagem da tomografia de coerência óptica é a capacidade de fazer o monitoramento longitudinal da lesão retiniana de maneira não invasiva.

Demonstrando o procedimento estarão Sharon Sagan, pesquisadora associada em meu laboratório, bem como Andreas Cruz Harans, membro do RE Greens Laboratory. Comece conectando uma torneira de nylon de três vias com duas conexões Luer lock macho a uma seringa Luer lock de vidro sem o êmbolo. Mude a alavanca da torneira em direção à seringa para fechar a torneira e posicione a seringa com a extremidade aberta voltada para cima.

Após o vórtice, adicione um volume de peptídeo um para um e Complete a solução adjuvante de Freund à seringa e reinsira o êmbolo de vidro na seringa. Segurando o êmbolo no lugar, inverta a seringa de modo que a torneira fique voltada para cima e mude a alavanca para a conexão fêmea não utilizada. Pressione cuidadosamente o êmbolo para remover o excesso de ar da seringa.

A solução preencherá a segunda conexão de trava Luer macho da torneira. Em seguida, coloque uma segunda seringa de vidro com o êmbolo totalmente inserido na segunda conexão Luer lock macho. Para criar uma emulsão, pressione alternadamente os êmbolos para passar a solução entre as duas seringas por cerca de dois minutos e resfrie a solução por cerca de 10 minutos até que haja uma mudança visível na viscosidade da solução.

Quando uma emulsão branca muito rígida se formar, transfira toda a solução para uma das seringas e substitua a seringa vazia por uma nova seringa Luer lock de um milímetro. Encha a nova seringa com a emulsão. Retire a seringa da torneira e coloque uma agulha de calibre 25.

Para testar a consistência da emulsão, expulse uma gota da emulsão em um pequeno prato com água. Se a emulsão não se dispersar, é adequada para injeção. Em seguida, injete cada camundongo nocaute AQP4 doador por via subcutânea uma vez em cada lado da parte inferior do abdômen e em cada lado da parede torácica medial à axila.

10 a 12 dias após a imunização, faça uma incisão na linha média da pele da virilha ao pescoço e desça cada perna do primeiro camundongo. Afaste a pele do peritônio e prenda-a firmemente à placa. Em seguida, colha os gânglios linfáticos inguinais e axilares e coloque os tecidos em um filtro de células dentro de uma placa de Petri contendo meio completo.

Quando todos os gânglios linfáticos tiverem sido coletados, coloque o filtro de células em um tubo cônico de 50 mililitros contendo meio completo fresco em gelo e use a extremidade plana de um êmbolo de seringa estéril de cinco mililitros para pressionar as células dos linfonodos através da malha do filtro. Enxágue a malha com 20 a 30 mililitros de meio completo para facilitar a recuperação da célula seguida de duas lavagens de centrifugação. Após a segunda centrifugação, ressuspenda o pellet em meio de células T para contagem.

Adicione as concentrações apropriadas de antígeno, interleucina de camundongo recombinante 23 e IL-6 de camundongo recombinante às células e adicione dois mililitros de células por poço nesta mistura polarizadora Th17 em cada poço de uma placa de 12 poços. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de CO2 por 72 horas. No terceiro dia de polarização, triture as culturas em cada poço algumas vezes para desalojar as células polarizadas e agrupe-as em um tubo cônico de 50 mililitros no gelo para contagem.

Após duas lavagens em PBS, dilua as células para uma concentração de uma vez 10 elevado ao oitavo por mililitro em PBS e misture suavemente a suspensão celular girando. Dentro de uma hora após a coleta, transfira as células para uma seringa de um mililitro e entregue 200 microlitros de células a cada animal receptor por via intravenosa através da veia da cauda. Em seguida, injete cada camundongo por via intraperitoneal imediatamente e dois dias depois com 200 nanogramas de toxina B pertussis diluída em 200 microlitros de PBS.

Para imagens retinianas in vivo dos animais receptores por tomografia de coerência óptica, cinco minutos antes da imagem, dilate as pupilas com uma gota de tropicamida a 1% por olho e ligue o tapete térmico. Coloque o mouse no cilindro de imagem e redirecione o fluxo de anestesia de acordo. Proteja os olhos com 0,3% de hidroxipropilmetilcelulose para mantê-los úmidos e garantir a continuidade da refração e coloque uma lente de contato personalizada no olho a ser examinado.

Guiado pela imagem infravermelha do fundo de olho, direcione o laser para o olho coberto pela lente, tomando cuidado para que o feixe esteja centralizado na cabeça do nervo óptico. Execute 25 B-scans no modo de alta resolução e rasterize as imagens de 30 A-scans médios. Depois de obter imagens de ambos os olhos, substitua a lente de contato por gel oftálmico e coloque o mouse em uma gaiola de recuperação quente.

Para analisar as imagens adquiridas usando o software de imagem modular para a segmentação automatizada, primeiro corrija manualmente os segmentos correspondentes à membrana limitante interna e à camada plexiforme interna para representar os limites das camadas internas da retina. Em seguida, verifique se as camadas de fibras nervosas e células ganglionares da retina residem dentro dos limites da camada interna da retina e se não se sobrepõem. A imunização subcutânea com peptídeos AQP4 que contêm epítopos de células T patogênicas provoca fortes respostas proliferativas de células T nos linfonodos de drenagem de camundongos knockout para AQP4 em comparação com as respostas de células T do tipo selvagem.

As análises de citometria de fluxo da expressão individual de V beta demonstram que as células T específicas para peptídeos AQP4 que contêm epítopos de células T patogênicas utilizam repertórios únicos de TCR e demonstram uma hiperproliferação seletiva indicando que as respostas das células T patogênicas a esses determinantes são normalmente reguladas por seleção tímica negativa. Aproximadamente seis a nove dias após a injeção de células T polarizadas, quase todos os camundongos receptores desenvolveram sinais clínicos de doença autoimune do SNC, incluindo cauda flácida e paralisia dos membros posteriores. Com células T específicas para AQP4 polarizadas Th17 induzindo uma doença clínica mais grave do que as células T específicas para AQP4 polarizadas Th1.

Por exemplo, este camundongo desenvolveu paralisia completa dos membros posteriores após a administração de células T específicas do peptídeo AQP4 polarizado Th17. A doença clínica induzida por células Th17 específicas do peptídeo AQP4 também está associada a uma infiltração de células mononucleares no parênquima e nas meninges do SNC, bem como à inflamação do nervo óptico, como evidenciado por um inchaço e aumento da espessura da camada interna da retina que retorna à linha de base à medida que os camundongos se recuperam da doença. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir e monitorar a autoimunidade direcionada ao AQP4, o que permitirá um estudo mais aprofundado para entender como as células T participam da neuromielite óptica.