Name: Indução de paralisia e lesão do sistema Visual em camundongos por específicos de células T para Neuromielite Óptica Autoantigen Aquaporin-4 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprenda a induzir doença autoimune no SNC por transferência de células T específicas para AQP4 em camundongos. Este método permite monitorar lesões retinianas de forma não invasiva usando tomografia de coerência óptica.

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Apoiaram-S.S.Z. pelo Instituto Nacional de saúde (RO1 AI073737 e RO1 NS092835-01), sociedade nacional de esclerose múltipla (4768 RG, RG 5179 e RG 5180), Fundação Maisin e Guthy Jackson Charitable Foundation.

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Sagan S.A., A. Cruz-Herranz, C.M. Spencer, P.P. Ho, L. Steinman, AJ Green e R.A. Sobel relatam sem divulgações. S.S. Zamvil é Editor-adjunto de Neurologia, neuroimunologia e Neuroinflammation e é membro do Conselho Consultivo para a sociedade internacional de Neuroimunologia. Ele serviu no Conselho Editorial do Journal of Clinical Investigation, The Journal de Imunologia e O jornal de ciências neurológicase tem sido um membro do Comité de revisão de concessão para os institutos nacionais de de Neuroimunologia clínicas de saúde (NIH) e tumores cerebrais (CNBT) estude a seção e a sociedade nacional de esclerose múltipla (NMSS). Ele tem servido como um consultor e recebeu honorários da Biogen Idec, EMD Serono, Genzyme, Novartis, Roche/Genentech e Teva Pharmaceuticals, Inc. e serviu ou serve nas placas de monitoramento de segurança de dados para Lilly, BioMS, Teva e Opexa Therapeutics. Atualmente, Dr. Zamvil recebe apoio de bolsa de pesquisa do NIH, NMSS, Fundação Maisin, Biogen e Celgene.

AQP4 foi identificado como o principal alvo no OMN IgG em 20053. Então, reconheceu-se que seria importante estabelecer um modelo animal AQP4-alvo de auto-imunidade CNS. Esse modelo pode ser útil para investigar como células específicas AQP4 T e B participarem no desenvolvimento de auto-imunidade CNS e para testar terapêutica candidato OMN. Embora a identificação da célula de T AQP4 específico epitopes em ratos do selvagem-tipo foi primeiramente relatada em 201013, respondendo a esses resumos de células T não causou doença clínica ou histológica14,17. A incapacidade de gerar um modelo de auto-imunidade CNS com base na reatividade imune a AQP4 permanecido um enigma até 2015, quando Jones, et al 25 descobriu que o doador AQP4 p135-153-carregado as pilhas de T do AQP4- / - ratos foram capazes de causar sinais clínicos e histológicos de auto-imunidade CNS em camundongos WT. De interesse, prevê-se para vincular MHC II (-Ab) com alta afinidade17AQP4 p135-153. Apenas um outra AQP4 sequência de aminoácidos, 201-220, prevê-se que vincule-Ab com afinidade elevada similar. Com efeito, observamos que AQP4 p135-153 e p201-220 ambos provocam proliferação robusta em AQP4- / -, mas não WT, ratos. Aqui, mostramos como pode isolar-se e expandir encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153 - e p201-220-reativa as células T de AQP4- / - ratos. Quando transferidos para destinatários camundongos WT, células Th17 AQP4-reativo de doador induzida por paralisia, que foi acompanhada por infiltrações de células mononucleares de medula espinhal e o nervo óptico. Lesão do sistema visual aferente é bem conhecido em pacientes com NMOSD AQP4-seropositivos26. Aqui, observamos que a inflamação do nervo óptico induzida pelas células AQP4-reativo e Th17 MOG-reativa era distinta. Considerando que células Th17 AQP4 específicas induzidas perineuritis óptica, células Th17 MOG específicas induziram grave neurite óptica. Também descrevemos as técnicas usadas para monitorar a inflamação do nervo óptico induzida por células T MOG específicos e específicos AQP4 out serial. Outros investigadores agora devem ser capazes de aplicar os protocolos descritos aqui para avançar seus próprios estudos centrados-se mecanismos de patogenicidade de ATCA.
Um pode facilmente evitar três possíveis armadilhas em nosso protocolo. Primeira, adotiva transferência de ATCA requer o uso de células T específicas AQP4 de ratos de doador- / - AQP4. Especificamente, as células do doador WT AQP4 p135-153-específico T não causa ATCA no destinatários camundongos WT. Em segundo lugar, é importante realizar um "água-teste" com uma gota da emulsão CFA/peptídeo antes de imunização das AQP4- / - ratos (protocolo passo 1.5). A emulsão não deve dispersar na água quando é apropriado para a injeção s.c.. Se a emulsão dispersa, um deve misturar a emulsão mais uma vez, relaxar novamente e repita o teste de água. Por último, as pilhas de T antígeno-específicos registrados doador CNS induzem auto-imunidade CNS mais eficientemente do que as células T a descansar. Um deve Inspecione visualmente essas culturas sob o microscópio de luz antes da colheita as pilhas de T do doador para transferência adotiva. Dividir-se rapidamente as células pode formar clusters, que são facilmente identificados. Também, quando culturas contêm muitas células T ativadas, a mídia pode transição do rosa ao laranja ou até mesmo para o amarelo, devido à diminuição do pH. Um pode também avaliar ativação de células de doador AQP4-aprontadas linfonodo T para proliferação por 3H-timidina incorporação, conforme descrito na etapa 3 de protocolo.
Nossa descoberta de que o dois epitopos de célula AQP4 T patogênicos são (1) previu vincular MHC II com alta afinidade e (2) eliciar respostas proliferativas potentes em AQP4- / -, mas não WT, ratos sugerem que células T alvejando aqueles determinantes são normalmente controlada pela seleção negativa do Timo17. Os repertórios TCR utilizados para reconhecimento das AQP4 p135-153 e p201-220 em AQP4- / - ratos são exclusivos (Figura 2), que também é consistente com deleção clonal mediada por células epiteliais medulares do timo. Outros mecanismos de tolerogenic normalmente podem conter respostas imunes para AQP4. Na sequência do nosso relatório inicial17, outro grupo também demonstrou que AQP4 p201-220 contém um encephalitogenic determinante de célula T27. Quando ratos de célula T-deficiente α/β (TCRα- / -) foram reconstituídos com AQP4- / - CD4+ T células, foi possível eliciar uma resposta de célula T encephalitogenic AQP4 específicos, mas não uma específico AQP4 resposta humoral, que implica que, em Camundongos WT respostas de células B AQP4 específicas, semelhantes a respostas de célula T AQP4 específicos, estão sujeitos a seleção negativa. Na verdade, perda de axônios de medula espinhal e RGCs, que não foi observada em camundongos WT com ATCA induzida por células T específicas AQP4 sozinhos, pode exigir participação de patogenicidade anticorpos específicos AQP4. É claro que modelos de rato de auto-imunidade CNS AQP4-alvo continuará a evoluir à medida que aprendemos mais sobre os mecanismos de tolerogenic normalmente controla a imunidade específica AQP4 T cell e células B.
Outros modelos de auto-imunidade CNS AQP4-alvo também estão sendo desenvolvidos6,16,28,29,30. Cada um pode oferecer vantagens para estudar aspectos particulares que são relevantes para a patogênese OMN. As células T AQP4 específicas foram identificadas em WT ratos6,16,29. Essas células T específicas AQP4 causaram mudanças histológicas de auto-imunidade CNS mas, semelhante às observações em camundongos, pilhas de T AQP4 específicas do rato WT não causam sinais significativos da doença clínica. Portanto, os mecanismos de tolerância restringindo células T e células B respostas imunes específicas AQP4 em camundongos WT também são operacionais em ratos. Independentemente disso, um não deve subestimar o poder em usando modelos de rato para estudar os mecanismos envolvidos na patogênese da doença. A riqueza de mata-mata, transgênico e repórter ratos pode ser vantajosa. Deve-se reconhecer também que várias descobertas fundamentais em auto-imunidade foram feitas utilizando modelos EAE de rato. Por exemplo, a demonstração de que a célula T clones específicos para um autoantígeno pode mediar doença auto-imune31,32, identificação do papel das células T costimulation em auto-imunidade33 e a descoberta do caminho do desenvolvimento para a diferenciação de Th1734 foi primeiramente descrito usando modelos EAE de rato. Usando o modelo do rato de ATCA que temos desenvolvido, um agora tem os meios para estudar o desenvolvimento e regulamentação dos patogénicos específicos AQP4 respostas imunes in vivo, que deve fornecer importantes visões relacionadas à patogênese OMN.

Neuromielite Óptica (NMO) é uma sistema nervoso central (SNC) inflamatória desmielinizante doença auto-imune que provoca episódios recorrentes de paralisia e perda visual, levando a incapacidade neurológica permanente1. NMO é atualmente considerada principalmente uma doença auto-imune humoral2 está associada com anticorpos (Igs) segmentação aquaporina 4 (AQP4), um canal de água abundantemente expressado em astrócitos3,4. No entanto, inflamação do CNS é um pré-requisito para a entrada de CNS de AQP4 Ig5,6. Assim, não foi possível estabelecer um modelo de NMO por transferência de anti-AQP4 Igs sozinho. As conclusões que (1) patogénicos específicos AQP4 Igs em pacientes OMN são IgG11,2, um Ig de célula T-dependente subclasse7 (2) T células são identificadas no OMN lesões8,9 (3) NMO é associado com determinados genes MHC II (por exemplo, HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10e (4) proinflammatory DR AQP4-reativa-restrito Th17 células são expandidas no OMN pacientes11,12 todos indicam que células T AQP4 específicos têm um papel fundamental na patogênese da OMN. Assim, é importante desenvolver modelos animais para determinar como as células T específicas AQP4 poderão contribuir para a patogênese OMN.
Há vários anos, múltiplos epitopos de célula T AQP4 foram identificados no selvagem-tipo (WT) ratos13,14 e ratos15. Enquanto observou-se que as células T reativas-AQP4 podem induzir inflamação opticospinal em ingênuo ratos destinatário15,16, significativos sinais clínicos de doença do CNS não foram observados. Da mesma forma, direcionar a imunização de camundongos WT com peptídeos contendo AQP4 T célula epitopos14,17, ou transferência de células proinflammatory T alvejando aqueles determinantes17, não causar sinais clínicos ou histológicos evidências de auto-imunidade CNS.
Recentemente, ele observou-a imunização de camundongos C57BL/6 AQP4 deficiente (AQP4- / -) com AQP4 peptídeo (p) 135-153 ou p201-220, dois determinantes previstos para vincular MHC II (-Ab) com alta afinidade18, suscitou forte CD4 + De respostas de células T17. Em contrapartida, estes dois peptídeos suscitou apenas modestas respostas proliferativas em camundongos WT. Além disso, o repertório de células T do receptor (TCR) usado para reconhecimento destes determinantes por pilhas de T do AQP4- / - ratos era único. Coletivamente, esses achados indicam que células T reconhecimento das AQP4 é regulamentado pela seleção negativa do timo. AQP4 p135-153-p201-220-específico ou células Th17 de ratos de doador- / - AQP4 induzida por paralisia em quase 100% dos ratos WT destinatários ingênuo; Isto foi associado com opticospinal infiltrados de células T, células B e monócitos. Serial opticospinal tomografia de coerência (OCT) demonstrou o envolvimento do sistema visual dinâmico. Ratos com autoimunidade mediada por células T CNS AQP4-alvo (ATCA) recuperaram de paralisia e lesão do sistema visual. Em contraste com a EAE induzida pela mielina oligodendrocyte glicoproteína (MOG) p35-55-T células específicas, que levaram à doença clínica persistente, ATCA induzida por células T sozinhos não esteve associada a perda axonal ou redução nas células ganglionares da retina (RGCs). Nossos resultados demonstraram claramente que existem múltiplos determinantes de célula T AQP4 patogénicos. Este novo modelo de ATCA é útil para estudar os mecanismos para controlar o desenvolvimento de patogénicos específicos AQP4 T células, aprendendo como essas células induzem inflamação CNS e como eles podem cooperar com células específicas AQP4 B e anticorpos para promover a patogênese OMN .
No presente relatório, nós descrevemos os protocolos usados para induzir e avaliar ATCA induzida por células T. Começamos com as técnicas utilizadas para imunização, cultura de células T e Th17 polarização para gerar patogénicos específicos AQP4 T células, análise de citometria de fluxo para confirmar a polarização e transferência adoptiva essas células T. Em seguida descreveremos métodos utilizados para avaliação clínica e histológica da doença e o uso da OCT serial para monitorar a lesão do sistema visual em ratos do destinatários.

<table><tbody><tr><td>M. tuberculosis H37Ra</td><td>BD Difco</td><td>231141</td><td>Dessecado, morto M. tuberculosis</td></tr><tr><td>Incompleto Adjuvante de Freund</td><td>BD Difco</td><td>263910</td><td></td></tr><tr><td>AQP4 peptídeo p135-153</td><td>Genemed</td><td>Sequência</td><td>de peptídeos de síntese personalizada: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN</td></tr><tr><td>Peptídeo AQP4 p201-220</td><td>Genemed</td><td>Sequência de peptídeos de síntese personalizada: HLFAINYTGASMNPARSFGP</td><td></td></tr><tr><td>Peptídeo MOG p35-55</td><td>Genemed / Auspep</td><td>Sequência de peptídeos de síntese personalizada: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td><td></td></tr><tr><td>Torneira de 3 vias</td><td>Kimble</td><td>420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fetal Bovine Serum (Caracterizado)</td> <td>GE Cuidados de saúde Ciências da vida</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>mouse recombinante IL-23</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td> <td>1887-ML</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Recombinante IL-6 R</td><td>& D Systems (BioTechne)</td> <td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Recombinante IL-12 R</td><td>& D Systems (BioTechne)</td> <td>419-ML</td><td></td></tr><tr><td>Timidina [Methyl-3H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET027</td><td></td></tr><tr><td>Filtradores de fibra de vidro</td><td>PerkinElmer</td><td>1450-421</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos anti-camundongo</td><td>eBioscience (Affymetrix)</td><td>[vários]</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse TCR V&beta; Painel de Triagem</td><td>BD Biosciences</td><td>557004</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Mancha de Células Mortas Corrigível</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>[vários]</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (16%)</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Solução de Fixação/Permeabilização com GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Iomomicina (sal de cálcio)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Toxina da coqueluche de B. pertussis</td><td>List Biological Laboratories</td><td>181</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica de fluxo variável</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de Biópsia de Espuma, Retangulares</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-221</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia (isoflurano, USP)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>050033</td><td>NDC: 11695-0500-2</td></tr><tr><td>Solução Oftálmica de Tropicamida, USP (1%)</td><td>Akorn</td><td></td><td>NDC: 17478-102-12</td></tr><tr><td>Plataforma de Diagnóstico por Imagem Spectralis</td><td>Heidelberg Engineering</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

indução de paralisia e lesão do sistema visual em camundongos por específicos de células t para neuromielite Óptica autoantigen aquaporin-4

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Enquanto é reconhecido que aquaporina-4 (AQP4)-células T e anticorpos específicos participarem na patogênese da Neuromielite Óptica (NMO), uma doença desmielinizante autoimune do sistema nervoso central humano (CNS), a criação de um modelo AQP4-alvo com ambos manifestações clínicas e histológicas de auto-imunidade CNS provou-se um desafio. Imunização de camundongos (WT) de tipo selvagem com peptídeos AQP4 suscitou a proliferação de células T, embora essas células T não poderiam transferir a doença aos ratos destinatário ingênuo. Recentemente, dois romance epitopos de célula T AQP4, peptídeo (p) 135-153 p201-220, foram identificadas e quando estudar respostas imunes para AQP4 em camundongos deficientes em AQP4 (AQP4- / -), sugerindo a reatividade de células T para estes resumos é normalmente controlado pelo tímicos seleção negativa. AQP4- / - Th17 polarizadas células T aprontadas para paralisia induzida p135-153 ou p201-220 em destinatários camundongos WT, que foi associada predominantemente leptomeníngeo inflamação da medula espinhal e nervos ópticos. Nervos ópticos circundantes de inflamação e envolvimento das camadas internas da retina (IRL) foram manifestados por alterações na tomografia de coerência óptica serial (OCT). Aqui, podemos ilustrar as abordagens usadas para criar este modelo novo na vivo de auto-imunidade CNS AQP4-alvo (ATCA), que agora pode ser empregada para estudar os mecanismos que permitem o desenvolvimento de patogénicos específicos AQP4 T células e como eles podem cooperar com B células na patogênese OMN.

Neste protocolo, usamos células de doador T de AQP4 C57BL/6- / - ratos. Imunização subcutânea destes ratos com AQP4 p135-153 ou p201-220, que contêm resumos de patogenicidade de célula T, suscitou respostas proliferativas forte T cell na drenagem dos gânglios linfáticos (Figura 1), Considerando que estes dois peptídeos induzido muito mais fraca célula T proliferação em camundongos WT. Em comparação, a imunização com AQP4 p91-110, que contém um não-patogênicas AQP4 T célula determinante13, ou MOG p35-55, um peptídeo de mielina que ativa as células T que causam encefalomielite auto-imune experimental (EAE)22,23 ,24, induzidas pelo semelhante magnitude da proliferação de células T em AQP4- / - e camundongos WT. Análise da utilização de TCR pela coloração de citometria de fluxo do Vβ individuais ou famílias Vβ, demonstrou que células p135-153-p201-220-específicas e T de AQP4- / - ratos utilizaram exclusivos repertórios TCR. Hiperproliferação seletiva de AQP4 p135-153 e p201-220 em AQP4- / - ratos, bem como a utilização exclusiva de TCR (Figura 2), indicado que patogenicidade de célula T respostas a estes determinantes normalmente é regulada pela negativa do Timo seleção, ressaltando a importância para o uso de células de doador T- / - AQP4 neste protocolo.
Antes da transferência adoptiva para indução de ATCA, linfonodo células de ratos de peptídeo-aprontadas AQP4 foram cultivadas in vitro em condições Th17 - ou de polarização Th1 para três dias. O grau de polarização do doador CD4+ T células foi confirmada por citocinas intracelulares coloração (ICS) e medida por citometria de fluxo (Figura 3). Ingênua destinatários ratos foram injetados por via intravenosa com 2 x 107 doador AQP4 peptídeo específico as células T. Depois de aproximadamente seis dias, quase 100% dos ratos destinatários desenvolvido sinais clínicos de doença auto-imune do CNS, incluindo paralisia flácida de cauda e membro posterior (Figura 4). Th17 polarizado as células T AQP4 específicas induzidas por doença clínica mais grave do que as células Th1-polarizada AQP4 específico T. Um rato representativo que recebeu Th17 AQP4-peptídeo específico e desenvolvido paralisia completa dos membros de hind (paraplegia) é mostrado no vídeo 1. Em contraste com os ratos que desenvolveram EAE após a administração de células Th17 MOG específicos, ratos destinatários recuperaram de doença clínica induzida pelas células Th17 AQP4 específicos. Quanto EAE induzida pelas células de Th17 MOG p35-55-específico, doença clínica induzida por AQP4 p135-153-específicos ou células de Th17 p201-220-específico foi associado com a infiltração de células mononucleares no parênquima do CNS e meninges (Figura 5). As lesões foram mais abundantes em meninges do que no parênquima para auto-imunidade CNS induzida pelas células Th17 AQP4 específicos.
Envolvimento do nervo óptico foi demonstrado pela avaliação histológica e pelo serial OCT. AQP4 específicos e Th17 MOG específicas células ambos inflamação induzida nervo óptico, que foi caracterizado pela presença de células mononucleares. Considerando que células Th17 AQP4 específicos causaram perineuritis óptica, células Th17 MOG específicas induziram grave neurite óptica (Figura 5). Usando a OCT serial, inflamação do nervo óptico era evidente por inchaço e aumento da espessura da camada interna da retina (IRL) para doença clínica induzida por AQP4 específicos ou células Th17 MOG específico (Figura 6). Para auto-imunidade induzida por AQP4 Th17 CNS, espessura IRL retornada à linha de base como ratos recuperou de doença clínica. Em contraste, persistência da EAE induzida por MOG específicos Th17 correspondia com IRL afinamento e, como temos demonstrado anteriormente17, foi associada com a perda de células ganglionares da retina.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig1.jpg"> 
Figura 1 : AQP4 p135-153 e p201-220 eliciam robusto T cell proliferação em AQP4- / - ratos, mas não os ratos WT. Os ratos foram imunizados s.c. com os peptídeos indicados no CFA. Onze dias depois, gânglios linfáticos foram removidos e então cultivados com ou sem antígeno, ou com o peptídeo usado para a imunização. Proliferação foi medida pela incorporação de 3H-timidina (média ± SEM, representativa de 5 experiências). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig2.jpg"> 
Figura 2 : Células T específicas AQP4 de AQP4- / - ratos utilizam exclusivos repertórios TCR. AQP4- / - e WT ratos foram imunizados com os peptídeos indicados. Onze dias depois, linfonodos foram removidos e cultivados com peptídeo usado para a imunização. As células foram colhidas. Utilização de TCR Vβ foi analisada por citometria de fluxo (quer dizer SEM ±, n = 5). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig3.jpg"> 
Figura 3 : Proinflammatory polarização das células do doador específico AQP4 T. Onze dias após a imunização com AQP4 p135-153 ou p201-220, células do linfonodo foram colhidas e cultivadas com o peptídeo usado para imunização em condições não-polarização, condições de polarização Th1 ou Th17. Polarização de Th17 ou Th1 foi examinada por citometria de fluxo e ICS para IL-17 ou IFN-γ, respectivamente. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig4.jpg"> 
Figura 4 : Células Th17 polarizado AQP4 específico T induzem paralisia em camundongos destinatários WT. Destinatários camundongos WT receberam 2 x 107 doador polarizado Th17 AQP4 p135-153 ou as células T específicas p201-220 AQP4- / - ratos. Th17 polarizado pilhas de T de MOG específicos serviram como controle positivo. Os resultados são representativos de 8 experimentos (n = 5/grupo). * p &#60; 0.05, * * p &#60; 0,01, * * * p &#60; 0.001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig5.jpg"> 
Figura 5 : Células Th17 AQP4 específicos induzem inflamação opticospinal em camundongos WT. Ratos de destinatários receberam 2 x 107 doador Th17 AQP4 p135-153 - ou p201-220-aprontadas Th17 nas células de AQP4- / - ratos ou Th17 MOG p35-55-específicos e sacrificaram-se 10 dias depois. Tecidos da medula espinhal e do nervo óptico foram preparados e corados com H &#38; E/LFB para a evidência de inflamação e desmielinização, respectivamente. Os resultados são representativos de 5 ratos/grupo. Barra de escala = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig6.jpg"> 
Figura 6 : Inflamação do nervo óptico induzida pelas células Th17 AQP4 específicas pode ser monitorizada por Oct da retina longitudinal Destinatários camundongos WT receberam 2 x 107 doador polarizado Th17 AQP4 p201-220-específicos ou pilhas de T do MOG p35-55-específicos no dia 0. Eles foram examinados pelo OCT no dia 0 (antes da administração de células T) e em seguida nos dias 4, 7, 8, 9, 10, 11 14 e 21. Espessura da IRL foi medido (média ± SEM). As estatísticas indicam uma comparação com controle de ingênuo. Os resultados são representativos de 3 experimentos (5 ratos/grupo). * p &#60; 0.05, * * p &#60; 0,01, * * * p &#60; 0.001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir paralisia e opticospinal inflamação por transferência da aquaporina 4 (AQP4)-células T específicas de AQP4- / - ratos em camundongos WT. Além disso, demonstramos como usar a tomografia de coerência óptica serial para monitorar a disfunção do sistema visual.

Indução de paralisia e lesão do sistema Visual em camundongos por específicos de células T para Neuromielite Óptica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Os objetivos gerais deste protocolo são induzir uma doença autoimune do sistema nervoso central ou SNC por meio da transferência adotiva de linfócitos T específicos para aquaporina 4 e monitorar os efeitos resultantes sobre o SNC e o sistema visual dinâmico. Este método ajudará a responder perguntas-chave sobre o papel dos linfócitos T específicos para aquaporina 4, comumente conhecida como AQP4, na neuromielite óptica, bem como em outros distúrbios inflamatórios visuais. A principal vantagem da tomografia de coerência óptica é a capacidade de realizar o monitoramento longitudinal da lesão retiniana de maneira não invasiva.Demonstrará o procedimento Sharon Sagan, pesquisadora associada no meu laboratório, bem como Andreas Cruz Harans, pesquisador colaborador no Laboratório de RE Greens. Comece acoplando um torneira de três vias de náilon com duas conexões macho tipo Luer lock a uma seringa de vidro com conexão Luer lock, sem o êmbolo. Gire a alavanca da torneira em direção à seringa para fechá-la e posicione a seringa com a extremidade aberta voltada para cima.Após agitar em vórtex, adicione um volume equivalente de peptídeo e solução de Adjuvante Completo de Freund à seringa e reinsira o êmbolo de vidro na seringa. Mantendo o êmbolo no lugar, inverta a seringa de modo que a torneira esteja voltada para cima e mude a alavanca para a conexão fêmea não utilizada. Pressione cuidadosamente o êmbolo para remover o excesso de ar da seringa.A solução preencherá a segunda conexão macho Luer lock da torneira de três vias. Em seguida, acople uma segunda seringa de vidro com o êmbolo totalmente inserido na segunda conexão macho Luer lock. Para criar uma emulsão, pressione alternadamente os êmbolos para passar a solução entre as duas seringas por cerca de dois minutos e resfrie a solução por aproximadamente 10 minutos até que haja uma mudança visível na viscosidade da solução.Quando se formar uma emulsão branca muito rígida, transfira toda a solução para uma das seringas e substitua a seringa vazia por uma nova seringa Luer lock de um milímetro. Encha a nova seringa com a emulsão. Remova a seringa do registro e acople uma agulha de 25 graus.Para testar a emulsão quanto à consistência com água, expulse uma gota da emulsão em um pequeno recipiente com água. Se a emulsão não se dispersar, ela é adequada para injeção. Em seguida, injete uma vez subcutaneamente cada camundongo doador com nulificação de AQP4 em cada lado do abdômen inferior e em cada lado da parede torácica medialmente à axila.10 a 12 dias após a imunização, faça uma incisão mediana na pele desde a virilha até o pescoço e descendo por cada perna do primeiro camundongo. Puxe a pele afastando-a do peritônio e fixe-a firmemente à tábua. Em seguida, colete os linfonodos inguinais e axilares e coloque os tecidos em um filtro celular dentro de uma placa de Petri contendo meio completo.Após coletar todos os linfonodos, coloque o filtro celular sobre um tubo cônico de 50 mililitros contendo meio completo fresco sobre gelo e use a extremidade plana do êmbolo de uma seringa estéril de cinco mililitros para pressionar as células dos linfonodos através da malha do filtro. Enxágue a malha com 20 a 30 mililitros de meio completo para facilitar a recuperação celular, seguido por duas lavagens com centrifugação. Após a segunda centrifugação, ressuspenda o pellet em meio para linfócitos T para contagem.Adicione as concentrações apropriadas de antígeno, interleucina recombinante de camundongo 23 e IL-6 recombinante de camundongo às células, e adicione dois mililitros de células por poço dessa mistura polarizadora Th17 a cada poço de uma placa de 12 poços. Em seguida, coloque a placa em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de CO₂ por 72 horas. No terceiro dia de polarização, pipete os cultivos em cada poço algumas vezes para desprender as células polarizadas e reúna-os em um tubo cônico de 50 mililitros sobre gelo para contagem.Após duas lavagens em PBS, dilua as células até uma concentração de um vezes 10 à oitava células por mililitro em PBS e misture suavemente a suspensão celular por meio de movimentos de rotação. Dentro de uma hora após a coleta, transfira as células para uma seringa de um mililitro e administre 200 microlitros de células a cada animal receptor por via intravenosa através da veia da cauda. Em seguida, injete em cada camundongo, por via intraperitoneal, imediatamente e dois dias depois, 200 nanogramas de toxina de B pertussis diluídos em 200 microlitros de PBS.Para a imagem de retina in vivo dos animais receptores por tomografia de coerência óptica, cinco minutos antes da aquisição de imagem, dilate as pupilas com uma gota de tropicamida 1% em cada olho e ligue o tapete aquecido. Posicione o camundongo sobre o cilindro de imagem e redirecione o fluxo de anestesia adequadamente. Proteja os olhos com hidroxipropil metilcelulose 0,3% para mantê-los úmidos e garantir a continuidade da refração, e coloque uma lente de contato personalizada sobre o olho a ser examinado.Guiado pela imagem do fundo infravermelho, direcione o laser para o olho coberto pela lente, tomando cuidado para que o feixe esteja centralizado na cabeça do nervo óptico. Realize 25 B-scans no modo de alta resolução e rasterize as imagens a partir de 30 A-scans médios. Após a aquisição de imagens de ambos os olhos, substitua a lente de contato por gel oftálmico e coloque o camundongo em uma gaiola aquecida de recuperação.Para analisar as imagens adquiridas utilizando o software modular de imagem para a segmentação automatizada, corrija primeiro manualmente os segmentos correspondentes à membrana limitante interna e à camada plexiforme interna, de modo a representar os limites das camadas retinianas internas. Em seguida, verifique se as camadas de fibras nervosas retinianas e de células ganglionares estão situadas dentro dos limites da camada retiniana interna e se não se sobrepõem. A imunização subcutânea com peptídeos AQP4 que contêm epítopos de células T patogênicos induz fortes respostas proliferativas de células T nos linfonodos drenantes de camundongos knockout para AQP4, em comparação com as respostas de células T de tipo selvagem.As análises citométricas de fluxo da expressão individual de V beta demonstram que linfócitos T específicos por peptídeos de AQP4 que contêm epítopos de linfócitos T patogênicos utilizam repertórios únicos de TCR e apresentam uma hiperproliferação seletiva, indicando que as respostas de linfócitos T patogênicos a esses determinantes são normalmente reguladas pela seleção negativa timica. Aproximadamente de seis a nove dias após a injeção de linfócitos T polarizados, quase todos os camundongos receptores desenvolveram sinais clínicos de doença autoimune do SNC, incluindo cauda mole e paralisia das patas traseiras. Linfócitos T específicos para AQP4 polarizados para Th17 induziram uma doença clínica mais grave do que linfócitos T específicos para AQP4 polarizados para Th1.Por exemplo, este camundongo desenvolveu paralisia completa dos membros posteriores após a administração de células T específicas pelo peptídeo AQP4 polarizadas para Th17. A doença clínica induzida por células Th17 específicas pelo peptídeo AQP4 também está associada à infiltração de células mononucleares no parênquima e nas meninges do SNC, bem como à inflamação do nervo óptico, evidenciada ainda por inchaço e aumento da espessura da camada interna da retina, que retorna ao valor basal conforme os camundongos se recuperam da doença. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir e monitorar a autoimunidade direcionada à AQP4, o que permitirá estudos adicionais para compreender como as células T participam da neuromielite óptica.

induction-paralysis-visual-system-injury-mice-t-cells-specific-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O vídeo demonstra a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo injetando uma combinação de glicoproteínas de oligodendrócitos de mielina e Mycobacterium tuberculosis inativado. O modelo permite que os pesquisadores estudem os mecanismos da doença e testem intervenções terapêuticas.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Este vídeo demonstra o método de indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) injetando peptídeos derivados de mielina com um adjuvante para ativar células T autorreativas, que migram para o cérebro. A toxina da coqueluche é administrada para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que essas células T e outras células imunológicas entrem no cérebro. Essas células imunes causam desmielinização, levando ao comprometimento da transmissão nervosa e ao...

Geração de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Neste vídeo, um modelo de camundongo com esclerose múltipla é estabelecido usando encefalomielite autoimune experimental (EAE). O camundongo é injetado com uma emulsão contendo um peptídeo neuronal e um adjuvante, desencadeando uma resposta imune que ativa as células T autorreativas. Isso é seguido por uma injeção de toxina coqueluche (PTX) para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que as células T autorreativas se infiltrem no cérebro. Essa infiltração inicia uma...

Este vídeo demonstra o procedimento de indução de paralisia transferindo células Th17 ativadas direcionadas à aquaporina-4 para um modelo de camundongo. No sistema nervoso central, as células Th17 ativadas interagem com os astrócitos que expressam aquaporina-4, desencadeando uma resposta imune que leva à paralisia da cauda e dos membros no camundongo.

Induzindo paralisia em um modelo de camundongo por meio da transferência de células Th17 específicas para aquaporina 4

Este vídeo demonstra o processo de avaliação da disfunção motora em um modelo de camundongo por meio da administração de toxina coqueluche e um inóculo contendo peptídeos e adjuvantes que imitam a mielina, seguidos de testes em esteira para avaliar a função motora e avaliar o dano nervoso resultante devido à ativação imunológica e desmielinização.

Avaliação da função motora em um modelo experimental de neurite autoimune em camundongo

Descrevemos um método para implantar e manter janelas de vidro sobre a medula espinhal exposta de camundongos adultos para estudar a encefalomielite autoimune experimental. Essas janelas fornecem acesso óptico crônico à medula espinhal para monitorar a dinâmica celular no nível subcelular em animais vivos usando microscopia de dois fótons.

Implantação de vidro Medular do Windows em camundongos adultos com Experimental Auto-imune Encephalomyelitis

Este manuscrito descreve os métodos de indução e pontuação do modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE), juntamente com a avaliação da distribuição de células imunes e níveis de citocinas de mRNA em linfonodos, baço, sangue e medula espinhal usando citometria de fluxo e PCR quantitativo, respectivamente, em várias fases da doença.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Este relatório apresenta uma abordagem simples para induzir com êxito neurite auto-imune experimental (EAN) usando a proteína mielina zero peptídeo de180-199 (P0) em combinação com adjuvante completo de Freund e coqueluche toxina. Apresentamos um paradigma sofisticado capaz de avaliar com precisão a extensão dos défices funcionais e neuropatologia que ocorrem neste EAN.

Uma abordagem simples para induzir a neurite auto-imune Experimental em camundongos C57BL/6 para avaliações funcionais e neuropatológicas

Baseada em célula de ensaio é um método amplamente utilizado para detectar imunoglobulina de soro antiaquaporina-4 G. Esse método pode ser aplicado para o diagnóstico clínico e pesquisas científicas de transtornos do espectro óptico Neuromielite.

Deteção de imunoglobulina Antiaquaporina-4 G de soro humano por ensaio baseados em células

O presente protocolo descreve a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo utilizando glicoproteína de oligodendrócitos de mielina e monitorando o processo da doença usando um sistema de pontuação clínica. Os sintomas experimentais relacionados à encefalomielite autoimune são analisados usando tomografia microcomputadorizada de fêmur de camundongo e teste de campo aberto para avaliar o processo da doença de forma abrangente.

Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal de esclerose múltipla (EM), que compartilha com a doença humana uma resposta autoimune humoral robusta. Aqui, relatamos um protocolo ELISA simples e flexível para quantificar autoanticorpos no soro de camundongos imunizados com EAE.

Quantificação de anticorpos autorreativos em camundongos após encefalomielite autoimune experimental

Aprenda a induzir doença autoimune no SNC por transferência de células T específicas para AQP4 em camundongos. Este método permite monitorar lesões retinianas de forma não invasiva usando tomografia de coerência óptica.

Indução de paralisia e lesão do sistema Visual em camundongos por específicos de células T para Neuromielite Óptica Autoantigen Aquaporin-4 (Vídeo) | JoVE Journal

Indução de paralisia e lesão do sistema Visual em camundongos por específicos de células T para Neuromielite Óptica Autoantigen Aquaporin-4

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