Name: Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Aprenda a técnica de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) para amostras embrionárias de baixa abundância em embriões de galinha. Este método permite analisar perfis de modificações de histonas e identificar genes reguladores em tecidos embrionários.

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Os autores Agradecemos sua excelente assistência técnica durante o estabelecimento deste protocolo Jan Appel. Trabalho no laboratório Rada-Iglesias é suportado pelo CMMC intramural financiamento, bolsas de investigação DFG (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 e TE 1007/3-1), o pesquisador avançado UoC grupo Grant e o CECAD Grant.

<ol><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin.+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of human epigenomes.</a> Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Benayoun, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+breadth+is+linked+to+cell+identity+and+transcriptional+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency.</a> Cell. 158 (3), 673-688 (2014).</li>
<li>Rehimi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics-Based+Identification+of+Major+Cell+Identity+Regulators+within+Heterogeneous+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations.</a> Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Valouev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+based+on+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data.</a> Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dynam%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).</li>
<li>Ho, J. W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+metazoan+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of metazoan chromatin organization.</a> Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).</li>
<li>Calo, E., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+enhancer+chromatin%3A+what%2C+how%2C+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?</a> Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).</li>
<li>Spitz, F., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors%3A+from+enhancer+binding+to+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcription factors: from enhancer binding to developmental control.</a> Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).</li>
</ol>

Os autores não tem quaisquer interesses financeiros concorrentes a ser divulgada.

Epigenomic caracterização das modificações do histone usando ChIP-seq pode ser usado para melhorar a anotação funcional de genomas de vertebrados em diferentes contextos celular4,5,18. Estes perfis de epigenomic podem ser usados, entre outras coisas, para identificar elementos potenciador, para definir o estado regulador de realçadores (i.e., ativo, preparado, ou preparada) e definir reguladores de célula grande identid...

Borne-translational modificações do histone estão directamente envolvidas nos diversos processos dependentes de cromatina, incluindo a transcrição, replicação e reparo de ADN a1,2,3. Além disso, modificações do histone diferentes mostram positivas (por exemplo, H3K4me3 e H3K27ac) ou negativo (por exemplo, H3K9me3 e H3K27me3) correlações com a expressão de gene e pode ser amplamente definida como marca de histona ativando ou repressiva, respectivamente,2,3. Por conseguinte, mapas de modificação do histone global, também conhecidos como epigenomic mapas, têm emergido como ferramentas poderosas e universais para anotar funcionalmente genomas vertebrados4,5. Por exemplo, sequências reguladoras distais como potenciadores podem ser identificados baseiam na presença de assinaturas específicas da cromatina (por exemplo, potenciadores de ativo: H3K4me1 e H3K27ac), que distingui-las das regiões proximais promotor (por exemplo, ativos promotores: H3K4me3)6,7,8. Por outro lado, os genes com funções reguladoras de identidade de células grandes são encontrados tipicamente com domínios de cromatina amplo marcados com H3K4me3 ou H3K27me3, dependendo do estado transcricionalmente ativo ou inativo dos genes subjacentes, respectivamente9 ,10. Da mesma forma, a expressão de genes de identidade principal célula parece ser frequentemente controlado por múltiplo e espacialmente agrupado realçadores (ou seja, super potenciadores), que podem ser identificadas como grandes domínios H3K27ac-marcado11.
Atualmente, mapas de modificação de histonas são gerados usando a tecnologia de ChIP-seq, que, em comparação com abordagens anteriores como ChIP-chip (ChIP acoplado ao microarrays) fornece maior resolução, menos artefatos, menos ruído, maior cobertura e menor custa12. No entanto, a geração de mapas de epigenomic usando a tecnologia de ChIP-seq tem suas limitações inerentes, principalmente associadas com a capacidade de executar com êxito o ChIP nas amostras de interesse. Protocolos de ChIP tradicionais normalmente necessários milhões de células, que limite a aplicabilidade deste método de vitro em células, linhas ou células que pode ser facilmente isoladas na vivo (por exemplo, células do sangue). Nos últimos anos, um número de protocolos modificados de ChIP compatíveis com celulares de baixo foram descritos13,14,15,16. No entanto, esses protocolos são projetados especificamente para ser acoplado a próxima geração sequenciamento (i.e., ChIP-seq), e eles geralmente usam ad-hoc biblioteca preparação métodos13,14, 15 , 16.
Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP que pode ser usado para investigar perfis de modificações do histone usando números de telemóvel baixas a intermédias (5 x 104 - 5 x 105 células) em qualquer loci selecionado (ou seja, ChIP-qPCR) ou globalmente (ou seja, ChIP-seq) (Figura 1). Quando acoplado à tecnologia ChIP-seq, nosso protocolo de ChIP pode ser usado em conjunto com os métodos de preparação de biblioteca padrão, tornando-se amplamente acessível para muitos laboratórios10. Este protocolo tem sido usado para investigar várias marcas de histona (por exemplo, H3K4me3, H3K27me3 e H3K27ac) em tecidos embrionários de frango diferente (por exemplo, na coluna tubo neural (SNT), proeminências frontonasal e epiblasto). No entanto, nós antecipamos que deve ser amplamente aplicável para outros organismos em que amostras biologicamente e/ou clinicamente relevantes podem ser obtidas apenas em pequenas quantidades.

<table><tbody><tr><td>Reagente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA em pó</td><td>Carl Roth</td><td>3737.3</td><td></td></tr><tr><td>Tampão salino de fosfato (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL pH 8.0</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-Desoxicolato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750-24</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroylsarcosine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>61743-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Applichem</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Carl Roth</td><td>3739.2</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>1833</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G/contas magnéticas</td><td>Invitrogen</td><td>1004D</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Peqlab</td><td>12-RA-03</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46.35 E</td><td></td></tr><tr><td>Na-butirato</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>SLB2659V</tr><tr><td>Inibidor de proteinase</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>SYBRgreen Mix</td><td>biozym</td><td>617004</td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb escada</td><td>Thermofisher</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>Laranja G</td><td>Sigma Alrich</td><td>03756-25</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA (1x)</td> <td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Octilfenol Etoxilato (Triton X 100)</td> <td>Roth</td><td>3051,4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&acute; s Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de carregamento de gel Multiflex</td><td>A.Hartenstein</td><td>GS21</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Plates</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>384 well</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,000 &micro; L Pontas de filtro</td><td>Sarstedt</td><td>70,762,211</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 &micro; L Pontas de filtro</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>2 - 200 &micro; L Pontas de filtro</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,211</td><td></td></tr><tr><td>0.5 - 10 &micro; L pontas do filtro</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3 anticorpo</td><td>Active Motif</td><td>39155</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac anticorpo</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3 anticorpo</td><td>Active Motif</td><td>39159</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me2 anticorpo</td><td>Active Motif</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>End Repair Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Contas paramagnéticas</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Amortecedor de ressuspensão</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de cauda A</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de ligação</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Índices de adaptador de RNA Illumina</td><td></td><td>RS-122-2101</td><td></td></tr><tr><td>Parar o buffer de ligação</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>PCR Primer Cocktail</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de PCR aprimorada</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Escada de DNA genômico</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de eluição</td><td>Agilent</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de amostra</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Kit</td> <td>de quantificação de bibliotecaKapa Biosystems</td><td>KK4835 &ndash; 07960204001</td><td></td></tr><tr><td>Ovos férteis de galinha branca</td><td>LSL Rhein Main</td><td>KN: 15968</td><td></td></tr><tr><td>Agulha (Neoject)</td><td>A.Hartenstein</td><td>10001</td><td></td></tr><tr><td>Seringa (Ecoject 10 mL)</td><td>Dispomed witt oHG</td><td>21010</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Hermle</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>ITABIS</td><td>MKR13</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Active Motive</td><td>Sonda de cisalhamento sonicador</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>Bioruptor Plus</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>Volume variável (5 - 5 - 1.000 &mu; L) pipetas</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Sigma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>Thermo Fisher</td><td>DynaMag-2 12321D</td><td></td></tr><tr><td>Spinner de mesa</td><td>Heathrow Scientific</td><td>Sprout</td><td></td></tr><tr><td>Mixer</td><td>LMS</td><td>VTX 3000L</td><td></td></tr><tr><td>Real-Time PCR Cycler</td><td>Roche</td><td>Light Cycler; Serial Nr.5662</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Gene Amp Sistema de PCR 9700</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de controle de qualidade de DNA e RNA</td><td>Agilent</td><td>Agilent 4200 TapeStation System</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Dumont</td><td>5-Inox-H</td><td></td></tr><tr><td>Colher perfurada</td><td>Instrumentos de precisão mundiais</td><td>501997</td><td></td></tr></tbody></table>

cromatina (chip) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma técnica amplamente utilizada para mapear a localização das histonas post-translationally modificadas, variantes de histona, fatores de transcrição ou enzimas de modificação de cromatina em um determinado locus ou na escala do genoma. A combinação de ensaios de ChIP com a próxima geração de sequenciamento (i.e., ChIP-Seq) é uma poderosa abordagem globalmente descobrir redes reguladoras do gene e melhorar a anotação funcional de genomas, especialmente de sequências reguladoras não-codificante. Microplaqueta protocolos normalmente requerem grandes quantidades de material celular, impedindo, assim, a aplicabilidade desse método para investigar os tipos de células raras ou biópsias de tecido pequeno. Para fazer o ensaio da microplaqueta compatível com a quantidade de material biológico que normalmente pode ser obtido na vivo durante a embriogênese precoce de vertebrados, descrevemos aqui um protocolo simplificado de ChIP em que o número de passos necessários para completar o ensaio foram reduzidos para minimizar a perda de amostra. Este protocolo de ChIP tem sido utilizado com sucesso para investigar as modificações do histone diferentes em vários galinha embrionária e tecidos de rato adulto usando baixa para números de telemóvel médio (5 x 104 - 5 x 105 células). Importante, este protocolo é compatível com a tecnologia de ChIP-seq usando métodos de preparação de biblioteca padrão, proporcionando assim global epigenomic mapas em tecidos embrionários altamente relevantes.

Para ilustrar o desempenho do nosso protocolo de ChIP, realizamos experimentos usando seções SNT em pool de embriões de galinha HH19, proeminências maxilares de HH22 frango embriões e embriões de galinha HH3-palco para investigar os perfis de ligação do ChIP-seq diversas modificações do histone (i.e., H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 e H3K27me3). Uma vez que o ChIP DNAs foram obtidos, a eficiência de sonication foi avaliada pela electroforese do gel do agarose dos DNAs de entrada corres...

Aqui, descrevemos uma imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e protocolo de preparação ChIP-seq biblioteca para gerar perfis de epigenomic global de amostras embrionárias de galinha baixa abundância.

Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar os perfis de ligação de diferentes modificações de histonas, usando amostras embrionárias de baixa abundância, a fim de melhorar a anotação funcional dos genomas de vertebrados. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do desenvolvimento, como quais são os principais intensificadores e genes que definem a identidade de um determinado tecido embrionário. As principais vantagens desta técnica são que ela requer uma quantidade limitada de material específico e também pode ser usada para análise local específica e ampla do genoma.Embora esse método possa fornecer informações sobre a regulação da transcrição ou heterogeneidade celular com os tecidos embrionários, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como amostras de patentes. Para obter o estágio HH19, embriões de galinha para este experimento, incubar ovos férteis de galinha Leghorn branca na orientação horizontal a 37 graus Celsius e 80% de umidade por três dias. Para começar a isolar os embriões HH19, torne-os acessíveis extraindo três mililitros de albumina com uma seringa de 10 milímetros para abaixar o blastoderma.Para remover membranas em

chromatin-immunoprecipitation-chip-protocol-for-low-abundance

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

A diferenciação do ESC coincide com células tipo mudanças específicas na estrutura e composição da cromatina. A detecção dessas mudanças fornece informações valiosas sobre os mecanismos que definem stemcellness e diferenciação celular. Cromatina imunoprecipitação (CHIP) representa um método valioso para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes à diferenciação de células-tronco.

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

Nós demonstramos uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) para identificar as interações fator em tecido-específicos genes durante ou após o início da tecido-específicos de expressão gênica em camundongos tecido embrionário. Este protocolo deve ser amplamente aplicáveis ​​para o estudo do tecido-específicos ativação do gene como ocorre durante o desenvolvimento embrionário normal.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato

Nós descrevemos um método robusto para cromatina imunoprecipitação utilizando células T primárias. O método baseia-se em métodos normais, mas utiliza um conjunto específico de condições e reagentes que melhoram a eficiência de uma quantidade limitada de células. Importante, é apresentada uma descrição detalhada da fase de análise de dados.

Imunoprecipitação da Cromatina eficiente usando Limitando quantidades de biomassa

A combinação de cromatina imunoprecipitação e sequenciamento ultra-high-throughput (CHIP-seq) pode identificar e mapear as interações DNA-proteína em uma determinada linha de tecido ou célula. Delineado é como gerar um modelo de alta chip de qualidade para o seqüenciamento posterior, utilizando a experiência com o fator de transcrição TCF7L2 como um exemplo.

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

A questão de como os reguladores e os estados de cromatina cromatina afetar o genoma in vivo é essencial para a nossa compreensão de como o diagnóstico precoce decisões destino celular são feitas no embrião em desenvolvimento. Abordagem mais popular para investigar características de cromatina em um nível-se global definida aqui para embriões de Xenopus o chip-Seq-.

Snapshot Genome-wide de Reguladores da cromatina e Estados em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões por Chip-Seq

Um regulamento ajuste fino da transcrição do gene subjacente a decisão destino da célula embrionária. Aqui, descrevemos ensaios de imunoprecipitação de cromatina utilizados para investigar regulação epigenética de ambos diferenciação cardíaca de células estaminais e desenvolvimento cardíaco de embriões de camundongos.

Regulação epigenética da Cardiac diferenciação de células estaminais embrionárias e Tecidos

Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) - uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

Aqui, descrevemos os métodos para executar o ChIP-Seq e CARIP-Seq, incluindo preparação de biblioteca para o sequenciamento de última geração, para gerar epigenomic global e cromatina associada RNA mapas em pilhas do ES.

CARIP-Seq e ChIP-Seq: métodos para identificar a cromatina associada RNAs e interações da proteína-ADN em células-tronco embrionárias

Aqui descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação eficiente de cromatina (ChIP) seguido por sequenciamento de DNA do elevado-throughput (ChIP-seq) do tecido adiposo marrom (BAT) isolado de um rato. Este protocolo é apropriado para o mapeamento de modificações do histone e investigando a localização de todo o genoma de proteínas não-histonas de interesse em vivo.

Imunoprecipitação da cromatina do tecido de adiposo marrom murino

A imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma ferramenta poderosa para a compreensão dos mecanismos moleculares da regulação genética. No entanto, o método envolve dificuldades na obtenção de fragmentação cromatina reprodutível por cisalhamento mecânico. Aqui, nós fornecemos um protocolo melhorado para um ensaio da microplaqueta usando a digestão enzimática.

Ensaio de imunoprecipitação cromatina utilizando nucleases Microcócicas em células de mamíferos

Este protocolo concentra-se na preparação de cromatina a partir de tecidos congelados instantâneos e é adequado para Imunoprecipitação de Cromatina de Reticulação (X-ChIP) seguida de análise quantitativa de PCR (X-ChIP-qPCR) ou abordagens de sequenciamento de próxima geração (X-ChIP-seq).

Extração de cromatina de tecido hepático quimérico congelado para análise de imunoprecipitação de cromatina

Aprenda a técnica de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) para amostras embrionárias de baixa abundância em embriões de galinha. Este método permite analisar perfis de modificações de histonas e identificar genes reguladores em tecidos embrionários.

Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

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