Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras
29 de agosto de 2017
Aqui, descrevemos uma imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e protocolo de preparação ChIP-seq biblioteca para gerar perfis de epigenomic global de amostras embrionárias de galinha baixa abundância.
O objetivo geral deste procedimento é investigar os perfis de ligação de diferentes modificações de histonas, usando amostras embrionárias de baixa abundância, a fim de melhorar a anotação funcional dos genomas de vertebrados. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do desenvolvimento, como quais são os principais intensificadores e genes que definem a identidade de um determinado tecido embrionário. As principais vantagens desta técnica são que ela requer uma quantidade limitada de material específico e também pode ser usada para análise local específica e ampla do genoma.
Embora esse método possa fornecer informações sobre a regulação da transcrição ou heterogeneidade celular com os tecidos embrionários, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como amostras de patentes. Para obter o estágio HH19, embriões de galinha para este experimento, incubar ovos férteis de galinha Leghorn branca na orientação horizontal a 37 graus Celsius e 80% de umidade por três dias. Para começar a isolar os embriões HH19, torne-os acessíveis extraindo três mililitros de albumina com uma seringa de 10 milímetros para abaixar o blastoderma.
Para remover membranas embrionárias extras, use uma tesoura fina para fazer uma pequena abertura no olho. Adicione um mililitro de solução de bloqueio. Com a ajuda de uma agulha dobrada, adicione 0,5 mililitros de tinta preta da China.
Use tesouras cirúrgicas finas e fórceps para cortar a membrana embrionária extra que envolve o embrião. Em seguida, transfira o embrião com uma colher perfurada para uma placa de Petri de 4,5 centímetros contendo 20 mililitros de solução de PBS. Trabalhando no gelo sob um microscópio estereoscópico, use tesouras finas e fórceps para dissecar e descartar o âmnio e as partes restantes da membrana embrionária extra.
Em seguida, corte o tubo neuro espinhal transversal ou o segmento SNT no nível braquial do embrião. Estenda a dissecção caudalmente para a região torácica para isolar o SNT. Para finalizar, use uma pinça para remover os tecidos que circundam lateral e ventralmente o SNT.
Depois de isolar os SNTs, mergulhe cada segmento em uma placa de Petri de 3,5 centímetros contendo tripsina quente a 37 graus Celsius. Quando o afrouxamento dos tecidos não neurológicos ao redor do SNT for visível sob um microscópio estereoscópico, transfira as amostras para PBS 1x frio. Para interromper a tripsinização, transfira as amostras para um novo prato com DMEM frio contendo 10% de FBS.
Use uma pinça para remover manualmente os tecidos mesenquimais e ectodérmicos restantes do SNT. Transfira esta seção SNT limpa para um tubo de 1,5 mililitro e congele-a rapidamente em nitrogênio líquido. Em seguida, homogeneizar o tecido de acordo com o protocolo de texto.
Adicione 13,5 microlitros de formaldeído a 37% e incube em temperatura ambiente em um rotador por 15 minutos. Para extinguir o formaldeído, adicione 25 microlitros de glicina 2,5 molar ao tubo e incube em temperatura ambiente em um rotador por 10 minutos. Centrifugue o tubo e, em seguida, lave o pellet de acordo com o protocolo de texto.
Após a reticulação, ressuspenda o pellet em 300 microlitros de tampão de lise completo e gelado por pipetagem. Incubar as amostras a quatro graus Celsius em uma plataforma de balanço por 10 minutos. Em seguida, sonicar as amostras a quatro graus Celsius.
Após a sonicação, centrifugar as amostras a 16 000 x G a quatro graus Celsius durante 10 minutos. Transfira o sobrenadante ou lisado para um tubo novo de 1,5 mililitro e descarte o pellet de detritos celulares. Diluir o lisado de acordo com o protocolo de texto.
Em seguida, mantenha uma pequena alíquota de cada amostra como controle de entrada e congele a 20 graus Celsius. Incubar as amostras restantes que serão submetidas à precipitação de cromatina ou chip com anticorpos apropriados de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, adicione 300 microlitros de cromatina ligada a anticorpos às esferas magnéticas previamente lavadas.
Inverta os tubos para misturar as amostras. Para ligar os anticorpos aos grânulos, coloque os tubos em um rotador de tubo e gire verticalmente a quatro graus Celsius por um mínimo de quatro horas. Para lavar as contas de cromatina, adicione um mililitro de tampão de lavagem RIPA gelado ao tubo mantido no gelo e misture invertendo ou sacudindo o tubo.
Depois de colocar o tubo no suporte magnético à temperatura ambiente, espere que as contas assentem na lateral. Despeje o líquido claro e repita esta lavagem mais três vezes. Depois de adicionar um mililitro de cloreto de sódio TE 50 milimolar ao tubo, transfira as esferas ligadas à cromatina nesta solução para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetro.
Coloque o tubo no suporte magnético e, quando as contas assentarem, despeje o líquido. Em seguida, centrifugue os grânulos a 900 x G a quatro graus Celsius por três minutos em uma centrífuga pré-resfriada. Depois que as contas forem assentadas no suporte magnético, remova todo o TE restante usando uma ponta de carregamento de gel.
Trabalhando à temperatura ambiente, adicione 210 microlitros de tampão de eluição aos grânulos e ressuspenda sacudindo. Incube o tubo em um bloco de calor pré-aquecido a 65 graus Celsius por 15 minutos, agitando. Após incubação, centrifugar os tubos com os grânulos a 16 000 x G à temperatura ambiente, durante um minuto.
Uma vez que as esferas tenham se acomodado no suporte magnético, transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga. Descongele a amostra de controle de entrada previamente congelada de 20 graus Celsius à temperatura ambiente. Adicione 90 microlitros de tampão de eluição à amostra e misture brevemente por vórtice.
Para reverter as ligações cruzadas, incube o chip e controle as amostras a 65 graus Celsius durante a noite. Trabalhando à temperatura ambiente, adicione um volume de tampão TE por tubo e inverta para misturar. Para digerir o RNA, adicione a RNAse A ao controle e lasque as amostras até uma concentração final de 0,2 miligramas por mililitro e inverta os tubos para misturar.
Incube os tubos em um bloco de calor pré-aquecido a 37 graus Celsius por duas horas. Para digerir a proteína para a purificação subsequente do DNA, adicione a protease K a uma concentração final de 0,2 miligramas por mililitros nos tubos e inverta os tubos para misturar. Incube os tubos em um bloco de calor pré-aquecido a 55 graus Celsius por duas horas.
Extraia e purifique o DNA de acordo com os materiais suplementares. Este DNA agora pode ser usado para PCR quantitativo e preparação de biblioteca de busca de chip. A eficiência da sonicação essencial para um chip bem-sucedido é confirmada pela eletroforese em gel de agarose das amostras de controle de entrada.
Neste exemplo, usando tubos neurais espinhais de galinha ou seções SNT, 11 ciclos de sonicação foram usados para obter um tamanho de fragmento ideal variando de 200 a 500 pares de bases. O DNA lascado foi analisado por PCR quantitativo para medir os níveis de enriquecimento de marcas de histonas ativadoras e repressivas em torno das regiões promotoras de genes ativos e inativos no SNT de galinha. Isso mostra que é possível avaliar a qualidade do lascamento quantificando apenas alguns lados baixos sem perder muito DNA para análise posterior.
Depois que as bibliotecas de busca de chips foram preparadas em sequência, um gafanhoto representativo é mostrado para os dados de trimetilação H3K27 e H3K4 trimetilação gerados em SNT de frango. Perfis semelhantes de busca de chips também foram gerados com sucesso em diferentes tecidos embrionários de galinhas, como proeminências maxilares e embriões em estágio HH3. Isso demonstra que, aqui apresentado, o protocolo de chip pode ser usado para gerar perfis epigenômicos a partir de quantidades limitadas de vários tecidos embrionários.
Ao usar este protocolo para gerar os perfis de modificação de histonas em um tecido embrionário, é importante lembrar que os sinais virão de todos os diferentes tipos de células presentes nesse tecido. Seguindo este protocolo e utilizando mais material biológico inicial, deve ser possível investigar os perfis de ligação de outras proteínas envolvidas na regulação transcricional, tais como, fatores de transcrição, co-ativadores ou subunidades de RNA polimerase 2. Uma vez estabelecidos, esses protocolos permitirão que pesquisadores no campo da biologia do desenvolvimento ou genética médica melhorem a alteração funcional dos genomas de vertebrados e obtenham informações importantes sobre a base molecular da miogênese, evolução e doenças humanas.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e preparação de biblioteca para ChIP-seq, projetado para gerar perfis epigenômicos globais a partir de amostras embrionárias de frango com baixa abundância. O método tem como objetivo elucidar os perfis de ligação de modificações da histona para aprimorar a anotação funcional dos genomas de vertebrados.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Biologia do Desenvolvimento
- Epigenômica
- Perfilagem Genômica
Contexto
- Investiga os perfis de ligação das modificações da histona.
- Utiliza amostras embrionárias de baixa abundância.
- Objetiva melhorar a anotação funcional dos genomas de vertebrados.
- Pode ser aplicado a diversos sistemas biológicos.
Objetivo do Estudo
- Identificar enhancers e genes-chave em tecidos embrionários.
- Fornecer informações sobre a regulação da transcrição.
- Explorar a heterogeneidade celular em tecidos embrionários.
Métodos Utilizados
- Protocolo de preparação de biblioteca de ChIP e ChIP-seq.
- Isolamento de embriões de galinha HH19 de ovos férteis.
- Incubação de ovos em temperatura e umidade específicas.
- Extração de albúmina para acessar o blastoderma.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de perfis epigenômicos a partir de amostras de baixa abundância.
- Melhor compreensão da ligação de modificações de histonas.
- Informações sobre a identidade de tecidos embrionários.
- Aplicações potenciais em outros sistemas biológicos.
Conclusões
- O método é eficaz para analisar tecidos embrionários.
- Requer material limitado, tornando-o acessível para diversos estudos.
- Pode contribuir para avanços na pesquisa em biologia do desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo de ChIP permite o perfil epigenético de tecidos embrionários de baixa abundância, apoiando a validação de alvos na fase inicial de descoberta ao associar modificações de histonas a redes regulatórias de genes. Ele reduz os requisitos de quantidade de amostra, tornando modelos de doenças mecanicamente relevantes acessíveis para a redução de riscos pré-clínicos. O método aumenta a confiança preditiva na identificação de alvos terapêuticos por meio de mapeamento epigenômico quantitativo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas por meio da análise de padrões de modificações de histonas em enhancers e promotores que definem a identidade de tecidos embrionários.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos utilizando amostras primárias limitadas de modelos de desenvolvimento relevantes para doenças.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao correlacionar estados epigenéticos com programas de expressão gênica em vias de desenvolvimento inicial.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara entradas padronizadas de cromatina para ensaios reprodutíveis de precipitação com anticorpos em diferentes marcas de histonas.
- Valor Operacional: Fornece resultados quantitativos de ChIP-qPCR para avaliar níveis de enriquecimento em locos específicos, permitindo a otimização do ensaio.
- Escalabilidade: Compatível com a preparação de bibliotecas para ChIP-seq, permitindo a ampliação para triagem epigenômica em todo o genoma em sistemas com baixa quantidade de material inicial.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Fornece mapas epigenéticos relevantes para doenças a partir de tecidos embrionários que refletem estados patogênicos iniciais em distúrbios do desenvolvimento.
- Valor Operacional: Garante continuidade da descoberta à validação pré-clínica ao gerar perfis epigenômicos comparáveis entre sistemas modelo.
- Mitigação de Riscos: Permite decisões baseadas em mecanismos de prosseguir/não prosseguir ao avaliar o engajamento do alvo por meio de alterações nas modificações de histonas em tecidos acessíveis.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação de hipóteses na biologia inicial até a identificação de compostos promissores por meio do alinhamento de biomarcadores epigenéticos, apoiando decisões de avanço baseadas em dados.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao associar modificações de histonas à atividade de enhancers na regulação gênica tecido-específica.
- Triagem: Permite a preparação do ensaio mediante a otimização da sonicação e a validação do controle de entrada para imunoprecipitação reprodutível.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de recuperação e enriquecimento de DNA que permitem a comparação da dinâmica de marcas de histonas entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao gerar perfis epigenômicos aplicáveis a modelos de doenças do desenvolvimento humano.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho ChIP de baixa entrada reutilizável para triagem epigenética em múltiplos tecidos embrionários e adultos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas redes de regulação gênica.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de etapas padronizadas de reticulação cruzada, sonicação e imunoprecipitação.
- Valor Estratégico: Aumenta a eficiência do capital ao permitir análise epigenômica a partir de amostras limitadas e valiosas, reduzindo a necessidade de ampla expansão do material.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco ao identificar locos com disregulação epigenética associados a vias patogênicas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecidos, otimização da reticulação e ajuste dos parâmetros de sonicação para amostras com baixa quantidade de material.
- Necessita de acesso a equipamentos de separação magnética, rotadores e blocos térmicos para etapas eficientes de imunoprecipitação e reversão.
- Exige protocolos padronizados de validação e titulação de anticorpos para garantir a precipitação específica da cromatina em diferentes marcas de histonas.
- Envolve considerações de adaptação ao ser estendido a tecidos adultos ou amostras humanas primárias com acessibilidade cromatínica variável.
- Inclui limitações práticas relacionadas ao sinal de fundo proveniente de populações celulares heterogêneas em tecidos embrionários dissecados.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:57
Preparation of Eggs and Microdissection of Chicken Spinal Neural Tube (SNT)
11:48
Conclusion
10:06
Results: Evaluation of the ChIP Protocol by ChIP-seq Experiments
4:12
Crosslinking Proteins to DNA
5:01
Lysis, Sonication, and Immunoprecipitation
6:33
Washing, Elution, and Reversal of Crosslinking
8:57
Cellular Protein and RNA Digestion
