Protocolo para síntese de fase sólida de oligómeros de ARN contendo um 2'- O -tiofenilmetilo Modificação e Caracterização através do Dicroísmo Circular

O objetivo geral deste relatório é ilustrar o procedimento para obter oligonucleotídeos de RNA via síntese em fase sólida. Dodecâmeros de RNA serão sintetizados como modelos e sua purificação e caracterização também serão demonstradas. Através da sua componente visual, esta publicação alargará o âmbito das metodologias e facilidades utilizadas aos investigadores em diversas áreas.

Fornecer um auxílio visual, juntamente com um pequeno protocolo, permitirá que os pesquisadores empreguem essas técnicas. Uma vantagem dessa técnica é sua facilidade de uso para uma ampla gama de modificações. À medida que as aplicações de hoje se tornam mais exigentes, é importante ter um protocolo padrão.

A química da fosforamidita está ressurgindo devido à robustez do método e seu potencial para a obtenção de oligonucleotídeos para aplicações terapêuticas. Embora a compra de oligonucleotídeos seja atraente, o preço e a disponibilidade de modificações mudam o interesse para a preparação interna desses oligômeros, tornando esse procedimento de extrema importância. Para iniciar este procedimento, pese cada fosforamidita em frascos âmbar de 10 mililitros secos em estufa e tampe cada frasco com um septo previamente perfurado com uma agulha de calibre 20.

Coloque os frascos imediatamente sob vácuo usando um dessecador contendo um agente de secagem. Depois de encher o dessecador com argônio seco, remova cada frasco e adicione imediatamente acetonitrila anidra antes de prendê-lo em um sintetizador de peptídeo de fase sólida. Em seguida, remova os septos de cada frasco e coloque no sintetizador por meio de uma função de troca de frasco.

Para configurar a síntese de fase sólida, selecione o ícone do software. Selecione o nome do sintetizador e clique em OK. Em seguida, crie uma nova síntese selecionando Arquivo e Nova Ordem de Síntese. Em seguida, use a janela de prompt para inserir a data de execução, o cliente e o ID de execução.Selecione o instrumento, o nome da sequência e a sequência.

Na guia Ciclo, atribua o método criado anteriormente. Em seguida, escolha o manual de Procedimento Final, que deixa o oligonucleotídeo ligado à resina CPG. Selecione DMT Desligado.

Salve o arquivo selecionando Arquivo e Salvar como.Em seguida, forneça um nome para o experimento e clique em Salvar. Em seguida, envie o arquivo para iniciar a síntese selecionando Pedido e Enviar pedido para sintetizador. Na janela de prompt, selecione uma posição de coluna e clique em OK. Na janela Sintetizador, selecione Monitor de Tritil.

Clique em Escolher função e Trityl Monitor a cada passo digitando 1. Comece a síntese selecionando Sintetizador e Prepare-se para começar. Coloque as colunas com a extremidade de três primos desejada nas posições indicadas no instrumento.

Em seguida, clique em Iniciar e Não no instrumento. Uma vez concluída a síntese, retirar a coluna do instrumento e colocá-la num balão de fundo redondo. Seque a coluna sob pressão reduzida por cerca de 0,5 horas.

Transfira a resina branca da coluna para um tubo de centrífuga de 1,6 mililitro e adicione 0,5 mililitros de uma solução aquosa de metilamina e amônia. Prenda a tampa do tubo da centrífuga com parafilme e aqueça o conteúdo a 60 graus Celsius por uma hora e meia. Coloque um objeto pesado em cima dos tubos para garantir que a concentração seja mantida constante.

Depois de resfriar até a temperatura ambiente, centrifugue brevemente a amostra para reduzir o conteúdo. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga. Resfrie o tubo a 70 graus Celsius colocando-o em um banho de etanol com gelo seco por cinco minutos e, em seguida, concentre até secar usando um concentrador de vácuo rápido.

Agora, ressuspenda os sólidos em 0,4 mililitros de uma solução de trifluoreto de amina e, em seguida, prenda a tampa com filme de laboratório. Aqueça a solução a 60 graus Celsius por uma hora e meia. Coloque um objeto pesado em cima dos tubos para garantir uma concentração constante.

Depois de resfriar a solução à temperatura ambiente, adicione 0,04 mililitros de uma solução de acetato de sódio seguida de uma mistura suave com uma ponta de pipeta. Adicione um mililitro de etanol e resfrie a solução a aproximadamente 70 graus Celsius com um banho de etanol de gelo seco por 15 minutos. Em seguida, centrifugar a solução a 15 000 rpm a quatro graus Celsius durante dez minutos.

Utilizar uma pipeta para extrair o sobrenadante e secar o sedimento resultante sob pressão reduzida. Após a secagem, ressuspender o sólido obtido e o tampão de carga e misturar até obter uma solução homogénea. Em seguida, carregue a suspensão em um gel de poliacrilamida previamente preparado.

Aplique uma corrente através do gel até que o marcador azul de brometilol esteja localizado entre metade a dois terços abaixo do gel. Depois de remover o gel do suporte, transfira o conteúdo do gel do vidro para o filme plástico e coloque sobre uma placa de cromatografia de camada fina coberta com sílica, para visualizar as bandas usando uma lâmpada UV. Use um marcador para delinear a posição onde a faixa superior está localizada e corte-a com uma lâmina de barbear.

Coloque o gel contendo o RNA em um tubo cônico de 50 mililitros e esmague-o em pedaços pequenos usando uma haste de vidro. Agora, suspenda os resíduos de gel em uma solução aquosa de cloreto de sódio e agite a suspensão a 37 graus Celsius por 12 horas. Transferir a suspensão para um tubo de 15 mililitros e centrifugar a 3400 RPM durante dez minutos.

Para dessalinizar a amostra usando um cartucho C18 de fase reversa, primeiro lave o cartucho com acetonitrila, água, cloreto de amônio aquoso e a solução de RNA, deixando os resíduos de gel para trás. Após a lavagem com água, eluir o RNA da coluna usando três mililitros de solução aquosa de metanol a 60% em três tubos de ensaio diferentes. Resfrie os tubos a 70 graus Celsius em um banho de gelo seco por cinco minutos e, em seguida, concentre o conteúdo até a secura usando um concentrador de vácuo rápido.

Depois de concentrar o eluente sob pressão reduzida, dissolva novamente o resíduo em 0,3 mililitros de água livre de RNase. Depois de diluir a solução, depositar um microlitro no instrumento de vis UV para medir o espectro de vis UV entre 200 e 450 nanômetros. Para análise MALDI-TOF, primeiro lave uma ponta de pipeta C18 com 50% de acetonitrila.

Equilibre a ponta da pipeta com ácido trifluoroacético a 0,1%. Em seguida, carregue a ponta da pipeta com uma solução contendo 100 a 150 picomoles de amostra. Depois de lavar a ponta da pipeta com 0,1% de TFA e água, eluir a amostra em uma solução contendo a matriz desejada.

Deposite 0,9 microlitros da solução em uma placa MALDI e deixe a amostra secar. Para análise da estrutura do RNA, transfira a amostra contendo RNA para uma microcubeta e posicione no trocador de amostras de um instrumento de dicroísmo circular. Abra o tanque de nitrogênio para fornecer um fluxo que mova o flutuador de ar localizado no instrumento para aproximadamente 40.

Em seguida, ligue o refrigerador. Agora, ligue o instrumento. Abra o software clicando no ícone do Gerenciador de Espectro e, em seguida, abra a janela Aquisição clicando em Medição de Espectro.

Depois de purgar o instrumento com nitrogênio, adquira os espectros de dicroísmo circular selecionando Medida e Parâmetros. Na guia Geral, selecione 200-350 nanômetros para a varredura, CD e HT para os canais, 0,1 nanômetros para o passo de dados, 100 nanômetros por minuto para a velocidade de varredura, um nanômetro para a largura de banda e cinco para o número de acúmulos. Na guia Unidade de célula, escolha 20 graus Celsius.

Na guia Controle, selecione O obturador é aberto e fechado automaticamente. Na guia Informações, insira o nome da amostra, o operador, a concentração e o solvente. Na guia Dados, navegue até a pasta desejada e clique em OK. Adquira os espectros clicando em Medir e Sample Measurement.

Por fim, identifique as posições das cubetas no trocador de amostras de um a seis e clique em OK. As quatro fitas de RNA foram obtidas por síntese em fase sólida e, após a purificação, produziram entre 300 e 700 nanomoles de cada oligonucleotídeo. Os cromatogramas MALDI-TOF dos oligonucleotídeos são mostrados aqui. Nenhuma grande diferença nos espectros de vis UV normalizados é observada a partir da comparação da banda em 260 nanômetros e oligonucleotídeos canônicos e modificados, seja comparando amostras de fita simples ou estruturas duplex.

No entanto, pequenas mudanças são observadas após a medição de seus espectros de dicroísmo circular. Além disso, as medições de Tm das três estruturas duplex exibiram um valor distinto que foi indicativo da desestabilização induzida pela incorporação das duas modificações de otiofenilmetil primos em uma das fitas. É importante lembrar que o rendimento da síntese em fase sólida depende da pureza do reagente.

A umidade terá um impacto negativo em cada etapa, pois a quantidade de água presente deve ser reagente o tempo todo. A metodologia relatada destina-se a servir como um recurso geral para os cientistas. A técnica pode variar dependendo da modificação desejada, instrumentação disponível ou restrições de tempo.

O tipo de química aqui empregado representa uma metodologia muito robusta que está em uso desde a década de 1980 e ainda é muito usada em ambientes acadêmicos e industriais. Depois de assistir a este vídeo, você poderá realizar a síntese, purificação e caracterização de seus próprios oligonucleotídeos modificados ou canônicos de RNA ou DNA. Não se esqueça de que trabalhar com os reagentes necessários pode ser perigoso, e equipamentos de proteção, como óculos de segurança, luvas e jalecos, devem ser usados o tempo todo.

Todos os reagentes devem ser manuseados com cuidado e dentro de uma hotte, quando apropriado.