Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a atividade citotóxica de células NK humanas. Este método pode ser utilizado para monitorar pacientes com deficiência funcional ou clássica de células NK. As principais vantagens desta técnica baseada em citometria de fluxo são sua sensibilidade, reprodutibilidade e velocidade em comparação com os métodos padrão de avaliação da função de células NK, como o ensaio de liberação de cromo radioativo.

Este método pode ser utilizado para testar terapias inovadoras direcionadas às células NK, bem como para realizar análises citométricas de fluxo multiparamétricas em profundidade da biologia das células NK, as quais anteriormente não eram alcançáveis. Comece utilizando a separação por gradiente de densidade para isolar as células mononucleares do sangue periférico, ou PBMCs, de amostras de sangue total de acordo com protocolos padrão. O uso de PBMCs em vez de células NK purificadas é altamente benéfico ao lidar com espécimes clínicos.

Dilua as células isoladas até uma concentração de cinco vezes 10 à sexta células por mililitro em meio completo e colete imediatamente as células-alvo K562 por centrifugação. Re-suspenda cinco vezes 10 à quinta células K562 em 500 microlitros de meio fresco suplementado com 1% de FBS. Em seguida, marque as células-alvo com 500 microlitros da solução trabalho de CFSE e misture suavemente a solução celular por pipetagem de três a cinco vezes.

Após 10 minutos a 37 graus Celsius protegidos da luz, interrompa a reação de marcação com 10 mililitros de meio completo durante 10 minutos no escuro e à temperatura ambiente. Ao final da incubação de interrupção, recolha as células por centrifugação e re-suspenda a paleta de células-alvo marcadas em um mililitro de meio completo para contagem. Em seguida, dilua as células até uma concentração de um vezes 10 à quinta células por mililitro de meio completo fresco e coloque as células-alvo em um incubador umidificado a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono.

Para um ensaio bem-sucedido, reduza ao mínimo o estresse das células-alvo e teste as células efetoras o mais rápido possível após a coleta. Dentro de 30 minutos após a marcação das células-alvo, rotule uma placa de cultura de tecidos com fundo redondo de 96 poços conforme a tabela. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio completo aos poços nas proporções de células efetoras para células-alvo de 25 para 1, 12,5 para 1 e 6,25 para 1, bem como aos poços contendo apenas células-alvo e aos poços contendo apenas células efetoras.

Adicione 100 microlitros de células efetoras aos poços de controle de citotoxicidade e aos poços nas proporções de 50:1 e 25:1 (células efetoras:células-alvo). Em seguida, começando pelo poço na proporção de 25:1 (células efetoras:células-alvo), transfira 100 microlitros de células para o poço com a próxima proporção mais baixa de células, nos dois poços seguintes, pulando os poços contendo apenas células-alvo, misturando bem entre cada transferência celular e adicionando os últimos 100 microlitros de células aos poços contendo apenas células efetoras. Adicione 100 microlitros de solução de trabalho 2X de Tween a 0,2% aos poços de controle positivo de morte K562 contendo apenas Tween.

Adicione 30 microlitros da solução de trabalho do frasco dois aos poços de controle positivo da citotoxicidade de células NK. Em seguida, adicione um vezes 10 à quinta células-alvo K562 marcadas por mililitro em 100 microlitros de meio completo a todos os poços, exceto aos poços somente com células efetoras. Depois que todas as células tiverem sido semeadas, misture todos os poços com a pipeta multicanal.

Centrifugue as células brevemente e coloque a placa no incubador de cultura celular por quatro horas. Ao final da incubação, coloque a placa sobre gelo ou uma plataforma fria e adicione 50 microlitros de corante para células mortas recém-preparado em cada poço. Em seguida, misture suavemente todos os poços e analise as células por citometria de fluxo.

A análise citométrica de fluxo de CSFE e coloração de células mortas após quatro horas de cultura a frio, conforme acabou de ser demonstrado, revela que as células nos poços contendo apenas células-alvo apresentam 15% ou menos de morte celular. Nenhum sinal de CSFE é detectado nos poços contendo apenas células efetoras se menos de cinco por cento de morte celular for observado nesses poços. Embora a morte celular nos poços de lise mediada por Tween nas células-alvo seja tipicamente superior a 85%, em pacientes com defeito na função das células NK observa-se uma atividade citolítica reduzida na maioria ou em todas as proporções testadas, comparado a indivíduos saudáveis, demonstrando que as células NK desses pacientes exibem uma redução diferencial na citotoxicidade que se correlaciona com uma proporção decrescente entre células efetoras e células-alvo.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em seis horas e meia, incluindo duas horas de preparação e semeadura, quatro horas de incubação e 30 minutos de aquisição. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de preparar as células-alvo e efetoras em paralelo para minimizar o tempo de espera entre o preparo celular e o início da co-incubação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a atividade citotóxica de células NK humanas contra células-alvo marcadas com fluoróforo por citometria de fluxo.