Preciso, elevado-throughput análise do crescimento bacteriano
19 de setembro de 2017
Avaliação quantitativa do crescimento bacteriano é essencial para a fisiologia microbiana como um fenômeno de sistemas-nível de compreensão. Um protocolo para uma abordagem analítica e manipulação experimental são introduzidos, permitindo a análise precisa, elevado-throughput de crescimento bacteriano, que é um tema chave de interesse em biologia de sistemas.
O objetivo geral deste experimento é analisar com precisão o crescimento bacteriano de maneira de alto rendimento. Utilizando este procedimento, é possível testar simultaneamente diversos meios ou diferentes cepas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia de sistemas e microbiologia, como, por exemplo, quais são os fatores determinantes do crescimento celular.
As principais vantagens desta técnica são permitir aos pesquisadores avaliar com precisão parâmetros globais da taxa máxima de crescimento e da densidade máxima da população em curvas de crescimento de células bacterianas. Embora este método possa fornecer informações sobre o crescimento de E. coli, ele também pode ser aplicado a outros microrganismos, como no ensaio de crescimento e na triagem de bactérias ambientais.
Para começar, coloque cinco tubos de vidro esterilizados com tampas de borracha de silicone, pipetas e as linhagens-alvo sobre uma bancada limpa. Exponha a boca do tubo de vidro à chama de um bico de Bunsen antes de abrir a tampa de borracha de silicone. Exponha a tampa de borracha de silicone à chama após a abertura do tubo e, em seguida, recoloque levemente a tampa sobre o tubo de vidro.
Em seguida, utilize a pipeta eletrônica e uma pipeta serológica descartável para adicionar cinco mililitros de M63 a um dos tubos de vidro e 4,5 mililitros de M63 aos outros quatro tubos. Use a ponteira p200 para coletar uma colônia e inoculá-la no tubo de vidro contendo cinco mililitros de M63. Agite o tubo em vórtex para obter uma suspensão.
Em seguida, dilua a solução 10 vezes, transferindo 0,5 mililitros dessa solução para um dos quatro tubos contendo 4,5 mililitros de M63. Repita este processo para os tubos restantes. Após a esterilização das bordas dos tubos de vidro e das rolhas de borracha de silicone, tampe os tubos com as rolhas.
Em seguida, coloque os cinco tubos em um incubador com agitação pré-aquecido a 37 °C e agite a 200 rpm. Incube a cultura durante a noite ou por 10 a 30 horas. Após a incubação, adicione 1.000 microlitros de M63 a uma cubeta descartável com o p1000.
Coloque a cubeta descartável em um espectrofotômetro. Inicie o programa em um comprimento de onda fixo de 600 nanômetros e meça o branco. Transfira os cinco tubos de vidro do incubador agitador para a bancada limpa.
Descarte o M63 da cubeta descartável e adicione 1.000 microlitros de cultura à mesma cubeta descartável com o p1000. Em seguida, meça a turbidez óptica da cultura celular. A seguir, adicione 250 microlitros de solução esterilizada de glicerol a 60% e 750 microlitros da cultura celular selecionada a um microtubo de 1,5 mililitro e misture por pipetagem.
Coloque os nove microtubos restantes no suporte para microtubos e distribua 100 microlitros da mistura preparada para cada tubo. Armazene os estoques no congelador ultracongelador a 80 graus celsius. Para configurar o leitor de microplacas, primeiro abra o software, abra os protocolos no gerenciador de tarefas e selecione criar novo.
Em seguida, selecione o protocolo padrão. Abra o procedimento e ajuste as configurações. Abra a definição de temperatura e selecione, incubadora ligada.
Em seguida, ajuste a temperatura para 37 graus Celsius e o gradiente para zero grau Celsius. Verifique o pré-aquecimento antes de prosseguir com o próximo passo. Abra o início cinético e defina o tempo de execução para 24 ou 48 minutos; em seguida, defina o intervalo de 30 minutos ou uma hora.
Abra o agitador e defina o modo de agitação como linear. Marque a opção de agitação contínua e ajuste a frequência em 567 cpm. Em seguida, abra a leitura, selecione absorbância, ponto final/cinética e monocromadores.
Defina o comprimento de onda em 600. Por fim, clique em validar para confirmar que o procedimento está correto. E clique em salvar para salvá-lo como um novo programa para uso futuro.
Para a gravação em tempo real do crescimento, adicione aproximadamente 25 mililitros de M63 a um reservatório de reagentes esterilizado. Em seguida, adicione 900 microlitros de M63 aos microtubos para preparar diluições seriadas. Depois, adicione 900 microlitros de M63 ao estoque de glicerol descongelado e vortexe.
Transfira 100 microlitros da diluição em dez vezes para outro microtubo contendo 900 microlitros de M63 e vortex. Repita este passo até que o número desejado de diluições seja alcançado. Agora, preencha as cavidades nas bordas de uma microplaca esterilizada de 96 poços com fundo plano com 200 microlitros de M63, utilizando uma pipeta de oito canais.
Carregue 200 microlitros de cada amostra diluída nos poços da microplaca conforme a tabela de referência. Para evitar camadas de alocação devido ao aquecimento e à eficiência de semeadura, nunca utilize os poços nas bordas da microplaca para suas amostras e carregue a mesma amostra em múltiplos poços em diferentes localizações na microplaca. Coloque a microplaca de 96 poços no leitor de placas.
Abra o leitor agora e o gerenciador de tarefas e escolha o programa. Clique em OK para iniciar a medição. Por fim, salve a gravação como um novo arquivo experimental para análise de dados.
É mostrado aqui um exemplo de uma tabela de referência que foi feita antes da realização do experimento. Um pictograma de placa de 96 poços foi desenhado como uma tabela de oito por doze para indicar as posições das amostras de cultura inoculadas na placa de 96 poços. A taxa de crescimento é calculada aplicando a equação a todos os pares de valores consecutivos de OD600.
A média e o desvio padrão de cinco taxas de crescimento consecutivas foram calculadas para estimar a taxa máxima de crescimento. As taxas de crescimento de um total de 60 culturas celulares são indicadas no mapa de calor exibido. A degradação do branco para o vermelho indica as taxas de crescimento de baixa a alta.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em poucos minutos, desde que seja executada corretamente e em ordem. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar e carregar amostras na microplaca para medições altamente precisas do crescimento bacteriano de maneira de alto rendimento. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de elaborar uma tabela de referência antes de realizar o experimento, a fim de evitar culturas celulares de baixa densidade e garantir que as células comecem a crescer dentro de 24 horas.
Após este procedimento, outros métodos, como a automação da manipulação experimental e a análise computacional, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais são os fatores determinantes para a propagação populacional e para a dinâmica. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de biologia de sistemas e microbiologia, a fim de explorar os princípios fundamentais do crescimento celular e otimizar as composições dos meios de cultura.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para a análise precisa e de alto rendimento do crescimento bacteriano, essencial para compreender a fisiologia microbiana. O método permite o teste simultâneo de diversos meios ou cepas variadas, fornecendo informações sobre fatores-chave que afetam o crescimento celular.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Fisiologia microbiana
- Biologia de sistemas
- Micробiologia
Contexto
- Compreender o crescimento bacteriano é essencial para a fisiologia microbiana.
- A análise de alto rendimento permite a avaliação de parâmetros de crescimento.
- Este método pode ser aplicado a diversos microrganismos.
- Ele auxilia na resposta a questões fundamentais em microbiologia.
Objetivo do Estudo
- Para analisar o crescimento bacteriano com precisão.
- Para avaliar parâmetros globais de taxas de crescimento e densidade populacional.
- Para fornecer informações sobre o crescimento de E. coli e outros microrganismos.
Métodos Utilizados
- Manipulação experimental das condições de crescimento bacteriano.
- Técnicas de análise de alto rendimento.
- Teste simultâneo de múltiplas cepas e meios de cultura.
- Avaliação de curvas de crescimento bacteriano.
Resultados Principais
- Avaliação precisa das taxas máximas de crescimento alcançadas.
- Avaliação da densidade máxima da população em curvas de crescimento.
- Compreensão dos fatores que determinam o crescimento bacteriano.
- Aplicabilidade ao screening de bactérias ambientais.
Conclusões
- O método aprimora a compreensão da dinâmica de crescimento microbiano.
- Ele fornece uma estrutura para pesquisas futuras em biologia de sistemas.
- Potencial para aplicações mais amplas em estudos microbiológicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise de crescimento bacteriano de alto rendimento permite a avaliação rápida da aptidão de cepas e da otimização de meios, apoiando a validação precoce de alvos na descoberta de agentes antimicrobianos. A quantificação precisa da taxa de crescimento e da densidade populacional fornece confiança preditiva para reduzir riscos em candidatos líderes em pipelines focados em microbiologia. Este método atende à necessidade de triagem fenotípica escalonável e reprodutível em pesquisas de biologia de sistemas e microbiologia translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas mediante a medição da taxa máxima de crescimento como indicador da aptidão celular sob diferentes condições genéticas ou ambientais.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da comparação em alto rendimento de cepas selvagens e mutantes em diversas formulações de meio de cultura.
- Valor Preditivo: Apoia a seleção de projetos ao quantificar a coordenação de funções gênicas dependentes do crescimento, reduzindo a ambiguidade mecanicista na escolha de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara estoques bacterianos validados para padronização reprodutível de ensaios, garantindo leituras consistentes baseadas em DO600 em campanhas de triagem.
- Valor Operacional: Utiliza o formato de placa de 96 poços para permitir testes escalonáveis e em paralelo de dezenas de cepas ou condições com consumo mínimo de reagentes.
- Prontidão do Ensaio: Gera curvas detalhadas de crescimento temporal que melhoram a confiabilidade da triagem ao capturar as fases de adaptação, exponencial e estacionária para confirmação de resultados positivos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta fenótipos de crescimento na fase de descoberta a modelos pré-clínicos, mantendo a fidelidade do sistema relevante para a doença em bactérias ambientais e patogênicas.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões de prosseguir ou interromper projetos ao vincular a cinética de crescimento à reorganização do transcriptoma e tendências de aptidão em todo o genoma.
- Redução de Riscos Mecanística: Foca na confiabilidade preditiva de vias dependentes do crescimento, ao invés de desfechos clínicos, alinhando-se a objetivos iniciais de redução de riscos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no continuum de descoberta, desde a verificação de hipóteses na biologia inicial até a preparação de ensaios para a identificação de compostos líderes, particularmente em programas voltados para antimicrobianos e microbioma.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir comparação precisa das dinâmicas de crescimento entre diferentes mutantes de genes, variantes de promotores ou condições de estresse.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios por meio de medições padronizadas de DO600, preparação reprodutível de culturas estoque e saída de dados cinéticos para validação de alvos positivos.
- Análises: Fornece resultados quantitativos — taxa máxima de crescimento e densidade populacional — que permitem comparação estatística entre condições e desempenho de cepas.
- Pesquisa Translacional: Estabelece continuidade pré-clínica mediante o uso de bactérias e meios de cultura ambientalmente relevantes que imitam condições fisiológicas.
- Reutilização Corporativa: Cria uma plataforma reutilizável para perfis de crescimento em diversos projetos, reduzindo o desenvolvimento redundante de protocolos e permitindo alinhamento de dados entre equipes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos, redução da ambiguidade mecanicista em vias ligadas ao crescimento.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade das medições de crescimento entre cepas e meios de cultura.
- Valor Estratégico: Decisões mais assertivas de avançar ou interromper projetos, eficiência no uso de capital por meio de testes paralelos e redução do risco biológico em programas precoces de antimicrobianos.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco com base em dados de aptidão de crescimento, permitindo o avanço de cepas com perfis fenotípicos robustos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer conhecimento em microbiologia em técnica estéril, preparação de estoques e calibração de OD600.
- Depende de leitora de microplacas com controle de temperatura, capacidade de agitação e leitura cinética de absorbância a 600 nm.
- Necessita padronização entre equipes de tabelas de referência, protocolos de diluição e posicionamento de poços para evitar efeitos de borda.
- Considerações para adaptação incluem o ajuste da densidade do inóculo e da composição do meio para cepas de crescimento lento ou exigentes.
- Limitação prática: limite de detecção mais rigoroso em baixas densidades populacionais comparado ao UFC, exigindo inóculo suficiente para sinal confiável.
