Etapas de preparação para medição de reatividade no Mouse arteríolas retina Ex Vivo

O objetivo geral deste método de preparação da retina é utilizar microscopia de vídeo para medir a reatividade arterial retiniana em camundongos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da regulação do fluxo sanguíneo retiniano e pode contribuir para aprofundar o entendimento da fisiopatologia de diversas doenças oculares. A principal vantagem desta nova técnica é que ela permite medir a reatividade dos vasos sanguíneos retinianos com resolução óptica extremamente alta.

E, ao mesmo tempo, não exige muito equipamento sofisticado. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois pode ser difícil localizar a artéria oftálmica e seus ramos. Demonstrarei este procedimento juntamente com Jenia Kouchek Zadeh e Wael Omran, estudantes de pós-graduação do meu laboratório.

Prepare-se para os procedimentos experimentais disposto os instrumentos necessários. Em seguida, use uma tesoura de aço para cortar o crânio do camundongo sagitalmente em duas metades e use a tesoura de olho para remover a pele e o cérebro. Use a tesoura de olho para remover o osso do crânio até que apenas o osso orbital permaneça e transfira a órbita para uma placa de dissecação contendo tampão Krebs-Henseleit gelado sobre gelo sob um microscópio cirúrgico.

Corte o osso orbital com tesoura para olhos e use pinças de precisão tipo quatro e tesoura cirúrgica Vannas de estudante para remover suavemente o globo ocular e o tecido orbital. Usando pinças de precisão tipo cinco e tesoura cirúrgica Vannas para capsulotomia, remova cuidadosamente a glândula de Harder, o tecido conjuntivo e os músculos extraoculares, tomando cuidado para não danificar o ramo principal da artéria oftálmica. Use suturas de Nylon 10-0 para ligar os ramos orbitais na extremidade proximal do ramo principal das artérias oftálmicas e use as pinças de precisão tipo quatro para transferir o globo ocular para uma placa de Petri contendo álcool 70%.

É muito importante que todos os ramos orbitais da artéria oftálmica sejam ligados para evitar vazamentos durante o experimento. Após 10 segundos, retorne o globo ocular para a cuba de dissecação. A córnea apresentará uma coloração esbranquiçada devido à exposição ao etanol.

Substitua o tampão pela solução de Krebs fresca e use o microscópio e uma agulha de calibre três para perfurar a córnea periférica. Use a tesoura de capsulotomia Vannas para dissecar a córnea e cortar suavemente o tecido da íris. Em seguida, posicione uma ponta afiada da tesoura de capsulotomia Vannas entre a coroide e a retina e corte a coroide e a esclera.

Para montar a retina em uma câmara de perfusão personalizada, use primeiro um segurador de agulha para empurrar a extremidade de uma micropipeta de vidro com ponta de diâmetro de 100 micrômetros para dentro do tubo de silicone da câmara. Em seguida, conecte a seringa à outra extremidade do tubo para lavar a ponta da micropipeta de qualquer resíduo. Encha a câmara de perfusão com tampão Krebs frio e coloque a câmara sob um microscópio estereoscópico.

Coloque uma plataforma de plástico transparente com uma reentrância de 1,8 milímetro sobre dois fios de aço com diâmetro de 1,6 milímetro dentro da câmara de perfusão e posicione um anel de aço inoxidável sobre a plataforma. Use uma espátula para transferir a retina com o nervo óptico, mantendo a artéria oftálmica ainda ligada, para a plataforma e remova a extremidade suturada da artéria oftálmica. Coloque dois laços pré-confeccionados de sutura de Nylon 10-0 sobre a micropipeta e fixe a artéria à micropipeta com as suturas.

Use uma pinça de ponta fina para posicionar a retina sobre a plataforma transparente e utilize um segundo par de pinças de ponta fina para rasgar suavemente a cápsula anterior do cristalino. Remova o cristalino e use tesoura microcirúrgica para retirar toda a cápsula do cristalino e o humor vítreo. Em seguida, faça quatro incisões radiais na retina, a meia distância entre a pars plana e o nervo óptico, e posicione o anel de aço inoxidável sobre a retina para fixá-la à plataforma.

Para preparar as arteríolas retinianas para análise, transfira a câmara de perfusão para sob um microscópio óptico e selecione a objetiva de imersão em água de 100X. Conecte tubos às portas de entrada e saída de uma bomba paracíclica e circule a câmara com solução de Krebs aquecida a 37 graus Celsius, oxigenada com 95% de oxigênio e carbonatada com 5% de dióxido de carbono. Conecte o tubo de silicone equipado com a micropipeta a uma mangueira de silicone reservatório por meio de uma torneira de três vias e encha o reservatório com solução de Krebs até uma altura correspondente a 50 milímetros de mercúrio.

Usando as objetivas, foque manualmente na superfície retiniana para procurar vasos sanguíneos ou hemácias. Quando um vaso sanguíneo for encontrado, foque no vaso e abra o registro de três vias. O diâmetro do vaso deve aumentar imediatamente e hemácias devem aparecer.

Após um período de equilíbrio de 30 minutos, as arteríolas desenvolverão um tônus intrínseco fraco com redução do diâmetro luminar inferior a 10%. Adicione um agente restritor da retina de camundongo à solução do banho e confirme a viabilidade do vaso. Em seguida, circule a bomba para remover o agonista do banho e adicione tampão Krebs fresco à câmara.

No experimento representativo, a U46619, um análogo do tromboxano, produziu respostas vasoconstritoras dependentes da concentração em arteríolas retinianas de camundongos selvagens da linhagem C57Bl/6J, com redução de aproximadamente 50% no diâmetro luminar em relação ao repouso, na concentração de um vezes 10 à potência menos seis molar. Em arteríolas previamente constritas pelo agonista, a administração cumulativa de acetilcolina provocou aumentos dependentes da concentração no diâmetro luminar, atingindo aproximadamente 25% do diâmetro previamente constrito na concentração de acetilcolina de um vezes 10 à potência menos cinco molar, indicando uma endotelização vascular íntegra. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 90 a 120 minutos, se executada corretamente.

Ao realizar estes procedimentos, lembre-se de ligar todos os ramos arteriais retrobulbares, imergir o olho em etanol antes de abrir o globo ocular para evitar torção da artéria oftálmica e, por fim, verificar as pontas das micropipetas de vidro quanto à obstrução. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar a retina de camundongo para a medição arterial com microscopia de vídeo in vitro.