Name: Preparação de Dissociated rato Culturas Neuron Cortical (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 2 s
Description: Aprenda a preparar culturas neurais dissociadas do córtex de ratos para estudos em neurociência celular. Este método permite aplicar eletrofisiologia e técnicas de imageamento em neurônios corticais.

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Preparações antes do dia da cultura: <ul><li> Preparar a solução de dissecação estéril (DS). </li><li> Prepare NBM/B27 (Mediom Neurobasal com suplementos B27). </li><li> Autoclave DDH 2 O e esterilizar coversilps vidro, se necessário. </li><li> Brasão pratos de cultura de tecidos ou lamínulas de vidro com poli-D-lisina. </li></ul> Poli-D-lisina Revestimento: Prepare um dia antes de cultivo em condições estéreis. <ul><li> Alíquota de descongelar PDL 10X e colocar no gelo. </li><li> Adicionar 9 ml de água ultra-filtrado estéril para 1 ml de PDL e misture bem (1X). </li><li> Revestimento com superfícies 1X PDL durante a noite a temperatura ambiente da seguinte forma: <ul><li> lamínulas de vidro (Bellco Cat Glass, Inc. # 1943-00012.): 75 mL / lamela OR </li><li> 24 placa de cultura bem: 300 l / poço OR </li><li> 35 milímetros placa de cultura: 1ml/dish </li></ul></li><li> Enxágüe com água estéril 5X (use pipetas Pasteur estéril para aspirar líquido). </li><li> Remover a água até a superfície está completamente seca. </li></ul> Procedimento de cultivo (feito em capela de fluxo laminar em condições estéreis) <ol><li> Cortar bloco de agar e cola-lo para o bloco de apoio do Vibraslicer micrótomo (Campden Instruments Ltd.), utilizando cola super. </li><li> Ao usar fase embrionária tardia (E17-18) fetos de rato, barragem eutanásia, retirada do útero e livre fetos individuais de saco embrionário. Fetos colocar em placa de Petri estéril e continuar como descrito abaixo. </li><li> Decapitar feto de rato ou cachorro (siga as orientações aprovadas pelo seu Animal Care Institucional e Comitê de Uso). </li><li> Retire a pele e crânio e do cérebro lugar em papel de filtro Whatman disco numa placa de Petri 60 milímetros cheio de DS frio. </li><li> Cortar o cerebelo usando uma lâmina estéril. </li><li> Pick up cérebro usando uma espátula e drenar o excesso de fluido em papel de filtro, em seguida, transferir cérebro para Vibraslicer bloco de apoio e cole no lugar do cérebro (lado caudal acima e parte ventral de frente para agar). </li><li> Encher a câmara com o DS frio. Seletor de velocidade para 8-9. </li><li> Corte 200-400 seções M, a partir do bulbo olfativo. Uma vez que a lâmina da Vibraslicer entra no córtex, começar a cortar 600μm cortes coronais. Um cérebro E17-18 do mouse normalmente produz 3-4 fatias utilizável, enquanto que um cérebro de camundongo P0 rendimentos 4-5 fatias utilizável. </li><li> Transferência de fatias do cérebro a 35 milímetros prato petri rotulados DS 2 com fim de reverter un-conectado 10 ml de vidro pipeta Pasteur. </li><li> Dissecar córtex e remover meninges utilizando agulhas de vidro retirado tubos capilares. </li><li> Cortar cascas cortical em pequenos pedaços, 0,5-1 mm de comprimento. </li><li> Filtro ES através de filtro de 0,2 mm acoplada a uma seringa cc 5 em uma placa de Petri 35 mm. </li><li> Transferir os pedaços de tecido cortical para placa de Petri contendo ES filtrada. </li><li> Incubar a 37 ° C por 30 min. </li></ol> Nesse meio tempo: <ol><li> Limpar Vibraslicer capô, e ferramentas de dissecação. </li><li> Adicionar 5 ml de NBM/B27 quente em uma placa de Petri 60 mm. </li></ol> Depois de 30 min. de incubação: <ol><li> Transferência de tecido para 10 ml DS. Vamos se contentar com 1 min. </li><li> Transferência de tecido para redemoinhos primeiro tubo Hi e deixar assentar por 2-3 min. </li><li> Transferência para Hi segundo. Repita como indicado acima. </li><li> Transferência para Li em primeiro lugar. Repita como indicado acima. </li><li> Li transferência para segundo. Repita como indicado acima. </li><li> Li transferência para terceiros. Repita como indicado acima. </li><li> Transferência de tecido para o prato com 60 milímetros de mídia. </li></ol> Sob o microscópio de dissecção: <ol><li> Restos de tecido limpo e triturar cada peça suavemente passa através de uma pipeta de vidro puxado (use a diminuir tamanhos de furo) para soltar o tecido. </li><li> Transferência de suspensão de células a 15 ml tubo cônico contendo o resto da NBM + B27 (Adicione um total de 13 ml para uma placa de 24 poços ou 11 ml por 5 - 35. Pratos milímetros Misture suavemente e espere grandes pedaços de tecido para resolver). </li><li> Suspensão de transferência de células (0,5 ml / poço de uma placa de 24 poços ou 2 ml / 35 placa de cultura mm). </li><li> Ao usar lamínulas de vidro, adicionar 80 mL de suspensão celular por lamínula e permitir uma hr em cultura de tecidos incubadora para as células a aderirem antes de inundar a câmara com mais NBM/B27 mídia. </li><li> Manter culturas a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol> Dia Seguinte 24 placa assim: Alimente-se bem com 0,5 de células não-neuronais ml condicionado NBM/B27 médio (cNBM/B27; Protocolo para a preparação de cNBM/B27 médio aparece abaixo) Pratos 35mm: Substitua 0,5 ml com cNBM/B27 médio. Manter a cultura através da substituição de 0,5 ml de meio com cNBM/B27 novo a cada 2-3 dias. Embora os meios de cultura não promove a proliferação de células glia, as culturas podem ser tratados com 5m FDU (5 Fluoro-2&#39;-deoxiuridina, Sigma F0503) no dia 05/03 na cultura para reduzir ainda mais o número de células gliais, se necessário. SET<html> -SE para dissecção e Cultura Esterilizar instrumentos de dissecação em EtOH 70% ou autoclave eles: <ul><li> Tesoura (empresas de médio e pequeno) Espátulas (empresas de médio e pequeno) </li><li> Pinças lâmina de barbear (empresas de médio e pequeno) </li><li> Lâmina para vibraslicer banho de tampão </li><li> Cunha metálica para suporte de lâmina para o cérebro </li></ul> Outros materiais: <ul><li> Placas de Petri (60 mm) </li><li> Placas de Petri (35 mm) </li><li> Papel-filtro </li><li> Pipeta de vidro de 10 ml </li><li> Pipetas estéreis descartáveis, 5,10 e 25 ml </li><li> Seringa filtro, 0,2 m </li><li> Seringa de 5 cc </li><li> Tubos de centrífuga, 15 ml </li><li> Estéril Pasteur de vidro pipetas </li><li> PDL revestido placas de cultura ou de lamínulas de vidro </li></ul> Rótulo seis tubos de centrífuga de 15 ml e siga preparação: Tubo # 1: solução enzimática: Adicionar 50 U de papaína (Worthington LS 03126) a 5 DS ml contendo: <ul><li> 100μl de L-cisteína (0,8 mg) </li><li> 7 mL NaOH 0,1 N </li><li> 50 APV mL (5mm) </li></ul> Deixar solução em temperatura ambiente para limpar. Note-se que solução enzimática aparecerá &quot;nublado&quot; em primeiro lugar e precisa clara antes de usar. Tubo # 2 e # 3: Hi inibidor da enzima: 3 ml + 300 ml DS BSA / Ti + 30 mL APV (5mm). Misture com cuidado para evitar bolhas, em seguida, dividir em duas alíquotas de 1,5 ml. Tubo # 4 - # 6: inibidor da enzima Low: 8 ml DS + 80 mL BSA / Ti + 80 mL APV (5mm). Misture com cuidado para evitar bolhas, divida em três alíquotas de 2,6 ml. Colocar os tubos numerados # 2 a # 6 em gelo. Deixe tubo # 1 (solução enzimática) em temperatura ambiente. SOLUÇÕES e alíquotas <ul><li> Uma solução (Buffered Saline) Sigma Formula wt 500 ml [conc.] </li><li> Cloreto de Sódio NaCl S-9625 58,45 80.0g 137mm </li><li> Cloreto de potássio KCl P-4504 74,56 4,0 G 5.4mm </li><li> Fosfato de sódio dibásico anidro Na 2 HPO 4 S-0876 142,0 0,24 g 0.17mm </li><li> Potássio fosfato monobásico anidro KH 2 PO 4 P-5379 136,09 0,3 g 0,22 mm </li></ul> Pesar todos os ingredientes e misture até dissolver com 400 ml de água ultra-filtrada. Trazer um volume final de 500 ml. Coloque em uma garrafa limpa e autoclave. Armazenar a 4 ° C e etiqueta &quot;Solução DS A&quot;. <ul><li> Solução B (Hepes) Sigma Formula wt 250 ml [conc.] </li><li> Hepes Hepes H-3375 283,3 20.97g 9,9 mm </li></ul> Adicionar ultra-água filtrada até 200 ml. Misture até dissolver e trazer um volume final de 250 ml. Coloque em uma garrafa limpa e autoclave. Armazenar a 4 ° C e etiqueta &quot;Solução DS B&quot;. <ul><li> Solução de trabalho 500 ml [conc.] </li><li> Ultra água filtrada 400 ml </li><li> A solução estoque de 25 ml </li><li> Solução estoque B 14 ml </li><li> D (+) glicose-Sigma G-8270 3,0 g 33.3mM </li><li> Sacarose Sigma S-0389 7,5 g 43,8 mM </li></ul> Ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1N. Trazer um volume final de 500 ml com água filtrada ultra. Decantar dentro de uma garrafa de vidro limpa e autoclave. Armazenar a 4 ° C. &quot;Solução Dissecando&quot; rótulo. Poli-D-lisina de preparação: <ol><li> Preparar a solução estoque 10x de poli-D-lisina (PDL; Sigma P-7280), em H 2 O estéril em 1mg/ml. </li><li> Faça alíquotas 1,0 ml. Esta solução pode ser armazenada a -20 ° C por até 3 meses. </li></ol> MÍDIA <ol><li> Adicionar 10ml de B-27 Suplemento (Gibco 17504-044) para frasco de 500 ml NBM (Medium Neurobasal, Gibco 21103-049). </li><li> Fazer 40 ml alíquotas e armazenar a 4 ° C. </li></ol> APV <ol><li> Adicionar 10 ml H 2 O estéril para o frasco de 10 mg APV (2-Amino-5-phosphonopentanoic ácido, Sigma A-5282) e misture bem. </li><li> Prepare 180 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C. </li></ol> BSA / Ti <ol><li> Dissolver 1 g BSA (albumina bovina. Sigma A-7030) e 1 g inibidor de tripsina (Sigma T-9253) em 10 ml DS. </li><li> Ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1N. </li><li> Esterilizar por filtração através de filtro de seringa de 0,2 mM. </li><li> Dividem-se em 400 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C. </li></ol> L-cisteína Em um tubo Eppendorf dissolver 0,6 mg L-Cisteína (Sigma C-7755) em 200 mL DS. AGAR (4%) <ol><li> Dissolver 4 g de Agar Bacto (Difco 0140-01) em 100 ml de água estéril. Manter a 4 ° C até ser necessário para a cultura. </li><li> Agar microondas para derreter e encher um 35 milímetros placa de Petri. Vamos sentar para esfriar e polimerizar. </li></ol> Papaína (Worthington LS 03126) e_title &quot;&gt; não neuronais CULTURAS EM GARRAFAS CULTURA NUNC GARRAFA DE REVESTIMENTO DE CULTURA (4 garrafas Nunc) <ol><li> Adicionar 9 ml de água estéril para cada um dos três tubos de PDL 10X fazer PDL 1X. </li><li> Transferência de 30 ml 1X PDL na primeira garrafa. </li><li> Mover-se ligeiramente até que todas as superfícies de crescimento são cobertos. Deixe descansar por 1 min. </li><li> Transferência 1x PDL a segunda garrafa. Deixe descansar por 1 min. </li><li> Repita com as garrafas de terceira e quarta. </li><li> Lave bem todas as quatro garrafas 2X com 150 ml estéril H 2 O. </li></ol> PREPARE solução enzimática (ES): <ol><li> Em um tubo de 0,6 ml de peso centrífuga para fora 0,8 mg L-Cisteína (Sigma C7755), adicione 150ml DS e vortex até que os cristais são dissolvidos. </li><li> Transferir 5 ml DS a um tubo cônico de 15 ml, em seguida, adicione 150ml L-Cisteína. </li><li> Adicionar 50 unidades de papaína. (Worthington LS 03126) </li><li> Adicionar 7ml 0.1N NaOH. </li></ol> PREPARE MEM (GIBCO # 11090-081) <ol><li> Retire 65 ml da garrafa MEM 500 ml. Economize 10 ml para preparar glicose. </li><li> Adicionar 5 ml Pen / Strep (Gibco # 15070-063). </li><li> Adicionar 10 ml de glicose 1M (Sigma G-8270) (1,8 ml g / 10 MEM) </li><li> Adicionar 50 ml de soro fetal bovino (Gibco # 16140-071) ou bovina Calf Serum (Omega BC-04). </li><li> Misture bem alíquota, e armazenar a 4 ° C. </li></ol> SUPLEMENTO MEDIUM/B-27 NEUROBASAL (NBM/B27) NBM, 500 ml (Gibco # 21103-049); B-27 (50X), 10 ml (Gibco # 17504-044) <ol><li> Adicionar todo o conteúdo do frasco B-27 para a garrafa NBM e misturar. </li><li> Alíquotas e armazenar a 4 ° C. </li></ol> DISSECTION do tecido cerebral <ol><li> Seca dissecar ferramentas de EtOH 70% antes da dissecção. </li><li> Transfira 10 ml DS em cada um tubo de 15/03 ml. </li><li> Selecione filhotes mouse (P0 - P3), você precisará de três cérebros para 4 garrafas. </li><li> Adicionar DS fria a 35 milímetros prato de petri. </li><li> Decapitar rato filhote e dissecar o cérebro. </li><li> Cérebros colocar na placa de petri contendo DS frio. </li><li> Pique em pedaços de tecido, pequeno o suficiente para passar através de uma pipeta de vidro. </li></ol> ENZIMA DISSOCIAÇÃO <ol><li> Remover o DS tanto quanto possível, a partir do prato com uma pipeta Pasteur. </li><li> Filtro ES através de uma seringa 0,2 m de filtro e 5cc. </li><li> Lugar ES no prato com o tecido. </li><li> Incubar tecido a 37 ° C incubadora (CO 2 livre) por 30 min. </li></ol> LAVAGEM DE TECIDOS <ol><li> Tecidos de transferência com pipeta de vidro para o tubo DS primeiro, certificando-se de obter o ES mínimo possível. </li><li> Centrifugar por 30 segundos a 1500 rpm. </li><li> Transferência de tecidos e repetir o procedimento mais duas vezes. </li></ol> TRITURAÇÃO <ol><li> Coloque 38 ml de MEM / FBS em um tubo de centrífuga de 50ml </li><li> Adicionar 3 ml de MEM / FBS a um prato de 35 mm e tecido transferir para esta placa de Petri. </li><li> Dissociar o tecido suavemente triturando-lo através de uma ponta de pipeta 1000μl eppendorf. </li><li> Transferência de suspensão de células para o tubo contendo 38ml de MEM / FBS e misture bem. </li></ol> PLATING <ol><li> Suportar a cultura garrafas em posição vertical para obter a mesma quantidade de suspensão de células e meios de comunicação em cada garrafa. </li><li> Coloque 90 ml de MEM / FBS em cada frasco de cultura. </li><li> Adicionar 10 ml de suspensão de células em cada garrafa. </li><li> Label: Non-Neuronal, iniciais e data. Incubar a 37 ° C e 5% CO 2. </li></ol> ALIMENTAÇÃO <ol><li> No dia 3 ou 4, as células de alimentação com MEM quente / FBS (decantar todos os meios de comunicação e substituí-la por 100 ml de MEM / FBS). Culturas pode levar 7-10 dias para se tornar confluentes. </li><li> No dia 10/07 alterar a mídia para NBM/B27. </li><li> No dia seguinte, recolher os meios de comunicação. Filtro com 0.22μm </li><li> Faça alíquotas de 40 ml e alimentar a cultura com MEM / FBS. </li><li> Próximos 2 ou 3 dias, a mudança de mídia para NBM/B27 </li><li> No dia seguinte, coletar e repita o procedimento. </li><li> Mantenha coleta de mídia para aprox. Duas semanas. </li></ol>

Os autores não têm nada a declarar.

<table><tbody><tr><td>5-Fluoro-2&amp;rsquo;-desoxiuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Vibraslicer</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio Dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Glicose D (+)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Meio Neurobasal (NBM)</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2-amino-5-fosfonopentanoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>Albumina Bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio, solução 1N</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Bacto</td><td>Difco Laboratories</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS 03126</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa estéril de 0,2 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>DDA02025S0</td><td></td></tr><tr><td>Cobrimentos de vidro, No1, 12 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-00012</td><td></td></tr><tr><td>Meio Mínimo Essencial (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11090-081</td><td>com sais de Earle&amp;rsquo;s, sem L-glutamina, necessário para o cultivo de culturas não neuronais</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>para cultivo não neuronal</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td>necessário para culturas não neuronais</td></tr><tr><td>Frascos de cultura tecidual Nunclon &quot;Triple Flask&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-25</td><td>Usar para culturas não neuronais. Esses frascos são muito convenientes para produzir &quot;meio Neurobasal/B27 condicionado&quot;, mas qualquer outro frasco ou placa de cultura tecidual pode ser usado como alternativa.</td></tr><tr><td>Placas de imagem com fundo de vidro &quot;Imaging dishes&quot;</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>Placas de cultura de 35 mm com fundo de vidro, ideais para imagem de Cálcio ou Sódio quando se utiliza um sistema de imagem invertido. Porém, são caras!</td></tr></tbody></table>

preparação de dissociated rato culturas neuron cortical

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Este vídeo irá guiá-lo através do processo de geração de culturas cortical neuronal de embriões tarde e cérebro de camundongos pós-natal precoce. Essas culturas podem ser usados ​​para uma variedade de aplicações, incluindo imunocitoquímica, bioquímica, eletrofisiologia, imageamento de cálcio e sódio, proteína e / ou RNA isolamento. Estas culturas também fornecer uma plataforma para estudar o desenvolvimento neuronal de animais transgênicos que carregam uma mutação genética tarde embrionárias ou pós-natal letal. O procedimento é relativamente simples, requer alguma experiência na técnica de cultura de tecidos e não deve demorar mais do que 2-3 horas, se você estiver devidamente preparado. Uma separação cuidadosa da casca cortical do trato fibras tálamo-cortical vai reduzir o número de gravidezes indesejadas células não-neuronais. Para aumentar a produção de células neuronais triturar os pedaços do tecido cortical delicadamente após a etapa de incubação enzimática. Isto é imperativo, uma vez que evita lesões desnecessárias para as células e prematura morte celular neuronal. Uma vez que estas culturas são mantidos na ausência de células alimentadoras glia, eles também oferecem uma vantagem adicional de culturas em crescimento enriquecido em neurônios.

Este vídeo mostra um procedimento para a geração de culturas de neurônios a partir de embrião tarde e córtex do rato pós-natal precoce. Essas culturas podem ser usados ​​para imunocitoquímica, bioquímica, eletrofisiologia, cálcio e sódio de imagem e fornecer uma plataforma para estudar o desenvolvimento neuronal de animais transgênicos que carregam uma mutação genética pós-natal letal.

Preparação de Dissociated rato Culturas Neuron Cortical

Este vídeo irá orientá-lo através do processo de geração de culturas de neurônios corticais a partir do cérebro de camundongos em estágio embrionário tardio e pós-natal precoce. Estas culturas...

Olá, meu nome é Hilgenberg. Trabalho aqui na universidade na Califórnia, em Irvine, no Departamento de Anatomia e Neurobiologia. Hoje vou falar com vocês sobre como preparamos culturas corticais de camundongos.Esses são camundongos do dia pós-natal dos quais preparamos esses neurônios. E normalmente utilizamos esses cultivos para eletrofisiologia ou para preparações de proteínas ou RNA. Utilizamos a mesma preparação de cultivo para imageamento de cálcio ou de sódio.A vantagem desses cultivos é que eles são, na verdade, uma adaptação do protocolo do banqueiro, mas cultivamos essas culturas na ausência de células alimentadoras gliais, o que os torna muito mais convenientes, e os cultivos geralmente são mais ricos em neurônios do que em células gliais. Então, vamos começar e eu vou mostrar como preparamos esses neurônios. Muito bem, agora chegamos ao ponto em que podemos remover o cérebro e começar a realizar a dissecção propriamente dita.Mas antes é importante mencionar que as lamínulas nas quais você deseja semear essas células precisam ser revestidas. E costumávamos fazer isso, normalmente durante a noite, à temperatura ambiente, com uma concentração de polilisina de 0,1 miligrama por mililitro. No dia seguinte, removemos a polilisina e lavamos as lamínulas três vezes consecutivas.Dependendo da aplicação, você utiliza placas grandes ou pequenas, ou pode usar lamínulas de vidro. Muito bem, esta é a configuração típica para a cabine, e expliquei brevemente quais soluções você precisa ter prontas, bem como quais instrumentos são úteis para o isolamento ou a dissecação do cérebro e, em seguida, o corte propriamente dito do cérebro. O que temos aqui é a solução de dissecação que está fria.Então, normalmente fica sobre gelo. Temos um fatiador de vibração que precisamos usar para seccionar os cérebros. Tenho um recipiente contendo solução de dissecção na qual o cérebro é montado e então fatiado.E tenho várias ferramentas que preciso para a remoção do cérebro. Tenho uma placa de sonda. É uma sonda de 4% que uso para segurar o cérebro no lugar.Precisamos de uma seringa, alguns filtros estéreis, placas de papel Rotman e placas de Petri de vários tamanhos. E esta é minha ferramenta para pipetar camundongos. Também tenho pipetas de vidro puxadas aqui.Essas são capilares de vidro que utilizo como ferramentas de dissecação, bem como para pegar os fragmentos cerebrais e, basicamente, manipulá-los repetidamente. Assim, nossa solução enzimática contém a solução de dissecação. Há L-cisteína nela para ativar a pepsina, bem como hidróxido de sódio 0,1 N para equilibrar o pH.Uma vez que você adicione a pepina, a solução fica um pouco opaca e precisa clarear antes que possamos utilizá-la para digerir o tecido enzimaticamente. E agora estamos basicamente prontos para iniciar o procedimento. O Fibro Slicer foi preparado.Inseri uma lâmina que secciona meu cérebro e também coloquei o recipiente abaixo, que contém o tampão e sustenta o cérebro. E agora estou pronto para fixar o bloco de ágar na minha placa de suporte, que também sustentará o cérebro. Este ágar já está curado, é um ágar a 4%, e agora vou cortar diretamente em uma região como esta.E nas laterais, basicamente, basta recortar um parafuso helicoidal retangular. Em seguida, estou usando uma espátula para remover esta peça do bloco do parafuso helicoidal. Agora, vou colar este parafuso helicoidal na minha placa de suporte com o lado plano do parafuso helicoidal voltado para a frente.Então, este é o suporte ao qual o cérebro está sendo colado e que o mantém fixo por meio deste parafuso sem-fim. Assim, quando realizamos o corte nesta orientação, o cérebro não se move para trás. Agora estamos prontos para remover o cérebro.Normalmente usamos um camundongo P zero ou P um. Muito bem, esta é a cabeça do camundongo decapitada e vou remover rapidamente o crânio. Primeiro, vou cortar a faixa muscular que está aqui e do outro lado.Em seguida, eu entro com a minha tesoura. E tenho muito cuidado para que o lado interno da tesoura não danifique o cérebro. E estou cortando ao redor do crânio em ambos os lados.E agora podemos simplesmente pegar a cartilagem e vou usar minha pequena ULA para remover o cérebro assim. Esse cérebro então vai para minha placa de Petri, que preenchi com a solução de corte e que tem um papel de filtro Watman no fundo. E o que gostaria de fazer agora é cortar a base do cérebro para obter uma área plana e firme, onde poderei montar o cérebro sobre meu suporte.Então, vou colocar uma gota bem pequena de cola na minha placa de suporte. Vou pegar meu cérebro agora com a espátula, usando minhas pinças curvas para me ajudar nesta tarefa. O que quero fazer é basicamente remover o excesso de líquido proveniente da solução de dissecação e, em seguida, montar o cérebro contra o meu suporte de auga.Agora estamos prontos para transferir o cérebro para o banho de tampão. Então, estou adicionando solução de dissecação a esse pequeno recipiente e vou adicionar o suporte que segura o cérebro. Ele está sendo montado com o cérebro voltado para a lâmina.Tudo bem, agora o cérebro está montado e vou usar o fatiador de fibras para localizar o início do cérebro, movendo-o em direção à lâmina. Acabei de cortar um pouco do olfativo. Agora estou movendo minha lâmina cerca de 600 micrômetros para baixo e realizando outro corte, que deve atravessar exatamente a córtex.Aí vai o córtex e ele sobe para a, para a lâmina. E estou movendo minha lâmina mais 600 micrômetros para baixo e estou cortando a segunda seção. É importante que isso seja feito continuamente, sem interrupção, de forma suave e uniforme.E quando você retirar a lâmina, pare o cortador de fibras. Agora vou usar uma pipeta de vidro que utilizei de maneira incorreta. Na verdade, uso a extremidade traseira e vou mover esta seção cortical para cima aqui e transferi-la para uma placa de Petri limpa.Avanço pelo cérebro, sempre 600 micrômetros, até coletar cerca de cinco a seis fatias para um camundongo P zero ou P um. E continuo até chegar ao final do córtex. Agora estamos prontos para isolar o córtex do restante do cérebro.Está bem, então estou usando essas pipetas de vidro, que são pipetas de vidro puxadas, tão afiadas quanto instrumentos de dissecação. E geralmente começo com a primeira seção que obtive, que é a menor e na qual o bulbo olfatório precisa ser removido. Também estou tentando remover as meninges dessa preparação.Mais uma vez, removendo o olfativo desta parte, descascando-o das meninges. Às vezes, há partes que não conseguem ser separadas com tanta facilidade, então apenas prossiga e deixe essas partes para trás, mantendo as partes boas. Eu sempre me movo em direção a uma extremidade e vou avançar por uma seção após a outra.É importante que você se livre das meninges e também, quando observar essas secções, às vezes convém virá-las para poder ver melhor onde está o feixe de fibras que contém a maioria das células não neuronais que você realmente não deseja nesta preparação. Ok, nesta secção é possível ver claramente esse feixe de fibras abaixo da camada cortical. Então, insiro a agulha exatamente entre o ponto onde termina a camada cortical e estou indicando o feixe de fibras que possui a maioria das células não neuronais que estamos tentando evitar nesta preparação.Então, estou cortando ao longo desta linha, tentando deixar os feixes de fibras para trás. Esta é a etapa em que você pica o tecido em pequenos cubos. Muito bem, agora estou esterilizando minha solução enzimática através de um filtro de 0,2 mícron acoplado a uma seringa.E acrescento isso diretamente sobre os meus pedaços corticais, assim como este. Certifique-se de que há líquido suficiente envolvendo todos os pedaços corticais, e esses pedaços são então colocados em uma incubadora a 37 graus por 30 minutos, o que deve relaxar o tecido consideravelmente. Então, já se passaram 30 minutos desde que esses pedaços corticais foram colocados para incubação na incubadora.Enquanto isso, aqueci um meio basal neurol com suplemento B 27, no qual essas células acabarão sendo colocadas. Também preparei algumas soluções aqui. A primeira é a solução de dissecação.Então é uma solução de dissecação simples. Em seguida, eles são transferidos para uma solução com alto teor de inibidor de tripsina que contém BSA como agente sequestrante e um PV para bloquear o componente do receptor NMDA. E então passam por três lavagens com BSA e PV em baixa concentração de inibidor de tripsina. Vou remover agora esses fragmentos da solução de propano e transferi-los para um tubo cônico contendo solução de dissecação DS.Esses agregados simplesmente descerão pela ação da gravidade e pode levar um ou dois minutos até que todos se depositem na parte cônica do tubo. Em seguida, eu os levantarei novamente e os transferirei para a solução que contém o inibidor de tripsina em alta concentração. Novamente, devemos aguardar até que esses agregados se depositem no fundo do tubo.Há mais uma lavagem com uma solução de alto inibidor de tripsina e, em seguida, esses agregados são lavados em inibidor de tripsina baixo. Após a minha última lavagem e com o inibidor de enzima baixo, vou transferir as células para o meio neurobasal pré-aquecido e começar a dissociar mecanicamente as células, pipetando-as para cima e para baixo em uma capilar de vidro com diâmetro decrescente. Vou pipetar as células agora e os agregados de tecido.Mas antes de fazê-lo, vou remover todos os detritos visíveis aqui. Há, por exemplo, proteína e DNA que vazam das células e formam essa massa semelhante a algodão, uma substância que adere aos agregados de tecido. Você deseja remover isso primeiro porque entope a ponta da pipeta e você acaba forçando o tecido através de um diâmetro menor.Em seguida, vou quebrar alguns desses capilares de vidro para obter uma abertura do tamanho adequado para movimentar minhas células para dentro e para fora da abertura. Esta é uma boa pipeta. Nesta, é possível ver que ela é bem redonda e não possui bordas afiadas.Vou inserir isso no meu dispositivo de pipetagem para camundongos. Há um filtro de 0,2 mícron entre eles e agora vou mover os tecidos para dentro e para fora do meu capilar de vidro. Assim, o primeiro processo deve ocorrer de forma bastante suave, porque os agregados de tecido não são muito maiores que a abertura da pipeta.Tudo o que você deseja fazer é soltar o tecido. Em seguida, eu entro com uma ponteira de pipeta ligeiramente menor. Gostaria de ter uma ponteira de pipeta redonda e bem limpa.Isso parece bom. E novamente, todos os agregados são movidos para dentro e para fora do tubo de uma só vez. Assim, o tecido agora está muito macio e solto, de modo que, se você suspender novamente esses agregados no meio, as células basicamente se soltarão.Agora vou transferir todas as minhas células dissociadas para um novo tubo cônico de 15 mililitros e vou refrigerá-las talvez mais duas ou três vezes, pipetando suavemente para cima e para baixo para dissociar células que ainda estejam em aglomerados maiores. Em seguida, devemos esperar um ou dois minutos para que os fragmentos maiores que ainda estão na solução sedimentem. Além disso, você pode ter fragmentos de vidro provenientes das capilares de vidro que quebrou, os quais devem sedimentar no fundo.Em seguida, podemos usar alíquotas deste material para semear em lamínulas ou placas previamente recobertas com lisina. Estou semeadas 80 microlitros sobre esta lamínula de vidro que foi previamente recoberta com polilisina, formando uma bolha agradável. As células eventualmente sedimentarão e aderirão à lamínula de vidro.Após cerca de uma hora, as células terão sedimentado e vou adicionar, bem suavemente, mais meio a toda a placa. Pode-se dar uma leve agitação, assim. Em seguida, essas células são colocadas no incubador a 37 graus e, amanhã, serão alimentadas com meio condicionado.Certo, estas são as células corticais. Elas têm um pouco menos de um dia de vida. Foram semeadas ontem e você pode observar que há muitos neurônios, todos com numerosos prolongamentos neurais, além de algum debris celular.Essas são as células que não sobreviveram. E essas serão removidas nas próximas alimentações. As células mortas são as células pequenas e redondas com membranas onduladas.Acabei de mostrar como preparar essas culturas corticais dissociadas. É importante lembrar que, ao remover a camada cortical das fatias cerebrais, você deve separá-la das fibras corticais do corpo trapezoidal, pois ela contém muitas células não neuronais. Além disso, ao triturar as células, não exagere, pois isso basicamente elimina a maioria das células isoladas que você gerou até agora.Portanto, seja cuidadoso com as fatias de tecido e você terá uma cultura excelente. Boa sorte em seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

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