Preparação de Dissociated rato Culturas Neuron Cortical

Olá, meu nome é Hilgenberg. Eu trabalho aqui na universidade da Califórnia em Irvine, no Departamento de Anatomia Neurobiologia. Hoje vou falar com vocês sobre como preparamos culturas corticais de camundongos.

Estes são camundongos diurnos pós-natais dos quais preparamos esses neurônios. E normalmente usamos essas culturas para eletrofisiologia, para preparações de proteínas ou RNA. Usamos a mesma preparação de cultura para imagens de cálcio ou sódio.

O bom dessas culturas é realmente uma adaptação do protocolo do banqueiro, mas cultivamos essas culturas na ausência de células gliais alimentadoras, o que torna muito mais conveniente e as culturas geralmente são mais ricas em neurônios do que as células gliais. Então, vamos começar e mostrarei como preparamos esses neurônios. Tudo bem, agora estamos no ponto em que podemos remover o cérebro e começar a fazer a dissecação real.

Mas antes é importante mencionar que as lamínulas nas quais você deseja revestir essas células precisam ser revestidas. E costumávamos fazer isso, geralmente fazemos isso durante a noite em temperatura ambiente a uma concentração de polilisina de 0,1 miligrama por mil. E no dia seguinte chegamos e removemos a polilisina e lavamos as tiras de cobertura três vezes consecutivas.

Dependendo da aplicação, você usa pratos grandes ou pequenos, ou pode usar lamínulas de vidro. Tudo bem, então esta é a configuração típica para o capô e eu expliquei brevemente quais soluções você precisa ter prontas e também quais instrumentos são úteis para o isolamento do cérebro e, em seguida, o seccionamento real do cérebro. O que temos aqui é a solução de dissecação que está fria.

Então, geralmente é, está no gelo. Temos um cortador do Viber que precisamos para seccionar os cérebros. Eu tenho um barco que contém uma solução de dissecação na qual o cérebro está sendo montado e depois fatiado.

E eu tenho várias ferramentas que preciso para a remoção do cérebro. Eu tenho uma placa de trado. É 4% de broca que eu uso para manter o cérebro no lugar.

Precisamos de uma seringa, alguns filtros estéreis, pratos de papel Rotman, pratos de Petri de vários tamanhos. E esta é a minha ferramenta de bater no tubo do mouse. Eu também puxei pipetas de vidro aqui.

Esses são capilares de vidro que eu uso como ferramentas de dissecação, bem como para pegar os pedaços do cérebro e basicamente iterá-los. Portanto, nossa solução enzimática contém solução de dissecação. Há L cisteína para ativar o pepane, bem como hidróxido de sódio normal 0,1 para equilibrar o pH.

Depois de adicionar o pepane, a solução fica um pouco opaca e precisa ser limpa antes que possamos realmente usá-la para digerir enzimaticamente o tecido. E agora estamos basicamente prontos para iniciar o procedimento. O fibro Slicer foi preparado.

Inseri uma lâmina que secciona meu cérebro e também enfiei o vaso embaixo que contém o amortecedor e sustenta o cérebro. E estou pronto para montar o bloco AGA na minha placa de suporte que também apoiará o cérebro. Então, este aga curou, é um aga de 4% e eu vou cortar uma área como essa.

E nas laterais, basicamente, basta cortar uma broca retangular. Então eu estou usando uma espátula e estou apenas tirando esse pedaço do bloco do sem-fim. E agora vou colar essa broca na minha placa de suporte com o lado plano da broca voltado para a frente.

Portanto, esse é o suporte ao qual o cérebro está sendo colado e, em seguida, é mantido no lugar por essa broca. Então, quando fazemos o corte dessa maneira, o cérebro não se move para trás. Agora estamos prontos para remover o cérebro.

Normalmente usamos um mouse P zero ou um P um. Tudo bem, então esta é a cabeça do rato decapitada e eu vou remover rapidamente a escultura. Primeiro vou cortar a faixa muscular que está bem aqui e do outro lado.

E então eu vou entrar com minha tesoura. E tenho muito cuidado para que o lado interno da tesoura não danifique o cérebro. E estou cortando o crânio em ambos os lados.

E agora podemos basear apenas pegar a cartilagem e eu vou usar meu pequeno ULA e estou removendo o cérebro assim. Então, esse cérebro vai para a minha placa de Petri que eu preenchi com a solução da seção e tem um papel de filtro watman no fundo. E o que eu gostaria de fazer agora é cortar a base do cérebro para que eu tenha uma boa área plana sólida para montar o cérebro no meu ombro.

Então, vou colocar uma gota muito pequena de loucura na minha placa de suporte. Vou pegar meu cérebro agora com a espátula e estou usando minha pinça curva para me ajudar com isso. E o que eu quero fazer é basicamente deixar cair um sangue do excesso de líquido que tenho da solução de dissecação e vou montar o cérebro contra o suporte da minha broca.

Agora estamos prontos para transferir o cérebro para o banho de buffer. Então, estou adicionando solução de dissecção a esse pequeno vaso e vou adicionar o suporte que segura o cérebro. Está sendo montado com o cérebro voltado para a lâmina.

Tudo bem, então o cérebro agora está montado e eu vou usar o cortador de fibro e estou tentando encontrar o início do cérebro, movendo o cérebro em direção à lâmina. E eu apenas cortei um pouco do olfativo. Agora estou movendo minha lâmina cerca de 600 micrômetros para baixo e estou fazendo outro corte, que deve passar direto pelo córtex.

Lá se vai o córtex e ele sobe para a lâmina. E estou movendo minha lâmina mais 600 micrômetros para baixo e estou cortando a segunda seção. É importante que isso seja feito continuamente, sem interrupção e agradável e suave.

E quando você retira a lâmina, você para o cortador de fibra. Agora vou usar uma pipeta de vidro que usei da maneira errada. Na verdade, eu uso o back-end e vou mover essa seção cortical para cá e transferi-la para uma placa de Petri limpa.

Eu prossigo pelo cérebro, sempre 600 micrômetros até coletar cerca de cinco a seis fatias para um camundongo P zero ou P um. E até eu chegar ao final do córtex. E estamos prontos agora para isolar o córtex do resto do cérebro.

Tudo bem, então estou usando essas pipetas de vidro que são pipetas de vidro puxadas tão afiadas quanto ferramentas de dissecação. E geralmente começo com a primeira seção que recebi, que é a menor e a olfativa que temos que remover. E também estou tentando remover as meninges dessa preparação.

Novamente, retirando o olfativo dessa peça, descascando, descascando das meninges. Às vezes você tem peças que não consegue separar tão facilmente, então siga em frente e deixe para trás as peças boas. Eu sempre me movo para uma extremidade e vou trabalhar em uma seção após a outra.

É importante que você se livre das meninges e também quando você, quando olha para essas seções, às vezes você quer ir e virá-las para que você possa ver melhor onde está o trato de fibras que contém a maioria das células não neuronais que você realmente não quer nesta preparação. Ok, nesta seção você pode ver claramente esse trato de fibras sob a camada cortical. Então, eu apunhalo bem entre onde a camada cortical termina e estou apontando o trato de fibras que contém a maioria das células neuro não neuronais que estamos tentando evitar nesta preparação.

Então, estou cortando nessa linha, tentando deixar os tratos de fibra para trás. Esta é a etapa em que você pica o tecido em pequenos cubos. Tudo bem, estou, estou esterilizando minha solução enzimática agora através de um filtro de 0,2 mícron conectado a uma seringa.

E eu adiciono isso diretamente nas minhas, minhas peças corticais assim. Certifique-se de que haja líquido suficiente que envolva todas as peças corticais e essas peças corticais vão para uma incubadora de 37 graus por 30 minutos, o que deve soltar o tecido consideravelmente. Então, já se passaram 30 minutos que essas peças corticais foram incubadas na incubadora.

Nesse ínterim, aqueci alguns meios neurobasais com suplemento B 27 em que essas células eventualmente acabam. Também preparei algumas soluções aqui. O primeiro é a solução de dissecação.

Portanto, é uma solução de dissecação simples. Em seguida, eles são transferidos para uma solução de alto inibidor de tripsina que contém BSA como sequestrante e um PV para bloquear o componente do receptor NMDA. E então eles passam por três lavagens de baixo inibidor de tripsina BSA e A PV. Vou remover esses pedaços agora da solução de propano e transferi-los para um tubo cônico contendo solução de dissecação DS.

Esses aglomerados apenas viajam para baixo por gravidade e pode levar um ou dois minutos antes que todos se acomodem na parte cônica do tubo. E então eu vou pegá-los novamente e transferi-los para a solução que contém o inibidor de tripsina alto. E, novamente, queremos esperar até que esses aglomerados se acomodem no fundo do tubo.

Há mais uma lavagem através de uma solução de inibidor de tripsina com alto teor de tripsina e, em seguida, esses aglomerados são lavados com inibidor de tripsina com baixo teor de tripsina. Após minha última lavagem e o inibidor de baixa enzima, vou transferir as células em meu meio neurobasal pré-aquecido e estou começando a dissociar mecanicamente as células tri-las para cima e para baixo em um capilar de vidro com tamanho de furo decrescente. Eu vou T as células agora e os aglomerados de tecido.

Mas antes de fazer isso, removerei todos os detritos visíveis aqui. Há, por exemplo, proteína e DNA que vazam das células que formam essa bola de algodão, como coisas que ficam penduradas nos aglomerados de tecido. Você quer removê-lo primeiro porque ele obstrui a ponta da pipeta e você está forçando o tecido a passar por dois diâmetros menores.

E então eu vou quebrar alguns desses capilares de vidro para obter a abertura do tamanho certo para mover minhas células para dentro e para fora da abertura. Esta é uma boa pipeta. Este você pode ver que é bonito e redondo e não tem bordas afiadas.

Vou enfiar isso no meu rebatedor de cachimbo de mouse. Há um filtro de 0,2 mícron no meio e agora vou mover os tecidos para dentro e para fora do meu capilar de vidro. Portanto, o primeiro processo deve ocorrer sem problemas, porque os aglomerados de tecido não são muito maiores do que a abertura da pipeta.

Tudo o que você quer fazer é soltar o tecido. E então eu vou entrar com uma ponta de pipeta um pouco menor. Eu gostaria de ter uma ponta de pipeta redonda limpa e bonita.

Isso parece bom. E, novamente, todos os aglomerados são movidos para dentro e para fora do cano de uma só vez. Portanto, o tecido agora está muito macio e solto que, se você suspender esses aglomerados na mídia, as células basicamente cairão.

Agora vou transferir todas as minhas células dissociadas para um novo tubo cônico de 15 mililitros mililitros e refrigerá-las talvez mais duas ou três vezes, suavemente para cima e para baixo para quebrar as células que ainda estão nesses aglomerados maiores. E então queremos esperar um ou dois minutos para que as grandes peças que ainda estão lá se acalmem. Além disso, você pode ter pedaços de vidro de seus capilares de vidro que você quebrou e que devem se depositar no fundo.

E então podemos usar alíquotas disso para colocar lamínulas ou pratos totalmente revestidos. E estou colocando 80 microlitros nesta lamínula de vidro que foi previamente revestida com polilisina e forma uma bela bolha. As células acabarão se acalmando e aderindo à lamínula de vidro.

Então, depois de cerca de uma hora, as células se acomodaram e eu vou adicionar muito gentilmente um pouco mais de mídia a todo o prato. Pode dar-lhe um redemoinho suave assim. E então essas células vão para a incubadora a 37 graus e amanhã vou alimentá-las com meios condicionados.

Tudo bem, porém, essas são as células corticais. Eles têm apenas um pouco menos de um dia de idade. Eles foram plaqueados ontem e você pode ver que há muitos neurônios, todos têm muitos neurônios pulmonares, e também há alguns detritos celulares lá.

Essas são as células que não sobreviveram. E estes vão desaparecer nas próximas mamadas. As células mortas são as células redondas muito pequenas com as membranas eriçadas.

Acabei de mostrar como preparar essas culturas corticais dissociadas. É importante lembrar que, ao remover a casca cortical das fatias do cérebro, você as separa da passagem de fibra cortical da sala do polegar, pois contém muitas células não neuronais. Além disso, quando você valoriza as células, não acabou, pois isso basicamente mata a maioria das células isoladas que você gerou até agora.

Portanto, vá devagar com as fatias de tecido e você terá uma bela cultura. Boa sorte em seus experimentos.