Name: Mudando a Penetrância em Zebrafish com mutações esquléticas letais por testes na progênie (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a modificar a penetrância de mutações esqueléticas letais em zebrafish através de cruzamento seletivo com testes de progênie. Este método permite gerar linhagens de alta e baixa penetrância para análise genética.

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Gostaríamos de agradecer a Chuck Kimmel para orientação, John Dowd para ajudar a desenvolver esta estratégia de reprodução, Macie Walker por seu trabalho em aperfeiçoar a mancha esquelética e Charline Walker e Bonnie Ullmann para conselhos úteis zebrafish. Este trabalho foi financiado pelo DE024190 K99/R00 para JTN.

todos os experimentos descritos neste protocolo foram concluídos em conformidade e cumprimento da Universidade do Colorado e a Universidade de Oregon institucional Animal cuidado e uso de comitês (IACUC).
 1. preparando o estoque desmarcado começando <ol><li>identificar heterozigotos portadores do alelo mutante de interesse pela barbatana clip- 11 e um estoque de animais completo-irmão de genotipagem por um método de escolha, tais como KASP 12 , 13 , 14. Este protocolo foi realizado com a estirpe de mef2ca b1086 de zebrafish.</li>
	<li>Genotipagem KASP 
	Nota: Primers específicos de alelo para KASP são projetados pela empresa que fornece os reagentes (ver Tabela de materiais). Para obter a concentração adequada 6-carboxila-X-rodamina (ROX) corante para a máquina específica de PCR em tempo real visite o site da empresa.
	<ol><li>Lugar o tecido de cauda de peixe-zebra em 50 µ l de tampão de lise (10 mM tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,3% tensoativo não-iônico, 0,3% octilfenil-polietileno glicol). Adicione 10 µ l de 10 mg/mL Proteinase K por alvéolo de um prato PCR de 96 poços e resumida em um termociclador a 55 ° C, durante 2-5 h, seguido por uma etapa de inactivação de 94 ° C 20 min. Refrigerar o produto de lise após digestão. Nota: produtos de Lise podem ser usados com sucesso por vários meses após o preparo. Quando o tecido era lysed usando 50mm NaOH, as reações de KASP foram infrutíferas. Estes achados sugerem que o método de NaOH de preparação de DNA genômico não é compatível com KASP.</li>
		<li>Quantificar o DNA genômico, usando um espectrofotômetro. Diluir o modelo de DNA genômico usando água de grau de biologia molecular, de modo que cada reação contém aproximadamente 20-30 ng. 
		Nota: Quantificar 4 ou 5 amostras, piscina-los e, em seguida, preparar diluições para todas as amostras com base na média. Quando usando esse protocolo para tecido adulto cauda, uma diluição de 1: 100, muitas vezes é suficiente. A quantificação precisa da concentração de DNA não é necessária.</li>
		<li>Add 0,14 µ l do primer KASP misturar e 5 µ l do mestre KASP misturar por amostra no gelo em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e misture bem antes de centrifugação brevemente para coletar conteúdo na parte inferior do tubo. 
		Nota: KASP mestre mix é calor e luz sensível, manter estoque no gelo e evitar a luz direta.</li>
		<li>Pipeta 5 µ l de primer/mestre misturar a solução para os poços de uma placa de 96 poços óptico PCR apropriado para a máquina PCR em tempo real sendo usada.</li>
		<li>Pipeta 5 µ l de diluído (aproximadamente 5-7 ng/μL) amostras de DNA modelo em cada bem e Aspire com uma pipeta para misturar.</li>
		<li>Adicionar 5 µ l de água livre de nuclease 3 poços para servir como controles não-modelo (NTC) e adicionar 5 µ l de diluídos confirmado homozigoto tipo selvagem, heterozigoto e homozigoto modelo de DNA mutante para controlos positivos.</li>
		<li>Coloque um selo do filme opticamente clara sobre a placa, garantindo que o filme é totalmente fechado sobre cada bem.</li>
		<li>Brevemente centrifugar a placa a 600 x g para coletar o conteúdo na parte inferior e remover bolhas de mistura. 
		Nota: Manter a placa no gelo e escudo de luz até que esteja pronto para prosseguir.</li>
		<li>Usar o programa ciclismo mostrado na tabela 1 para realizar a principal reação KASP.</li>
		<li>Ver os o gráfico de dispersão resultante produzido por computador a análise. Uma reação de sucesso mostrará 4 grupos distintos de pontos sobre a trama ( Figura 3): três agrupamentos correspondente ao genótipo e um agrupamento dos NTCs perto da origem da amostra. Os controles positivos devem segregar com o agrupamento de amostras adequadas.</li>
		<li>Se o programa de computador não reconhece o enredo agrupamentos como correspondente de genótipos específicos, adicionais de ciclismo de moda podem ser necessário (tabela 2). Repita o programa adicional até que o computador reconhece e agrupamentos apertados pelo genótipo.</li>
		<li>Exportar os resultados da genotipagem para um arquivo de planilha para facilitar a utilização e a análise.</li>
	</ol></li> <li>Os animais heterozigotos identificados juntos no sistema de água principal da casa.</li></ol>
 2. a primeira rodada de progênie marcando <ol><li>Cruz Pairwise heterozigotos irmão <ol><li>depois que os animais recuperar-se do clip de barbatana, configurar inter-cruzamentos emparelhados. Usar divisores para garantir que os embriões são síncronos 16.</li>
		<li>Recolher os embriões e manter os pares parentais isolados em gaiolas de criação.</li>
		<li>Monitorar adultos isolados para que peixes agressivos podem ser separados ou fornecidos com tampa (de peixe desfiado redes de trabalho muito bem). Peixes devem ser alimentados e sua água mudou seguindo orientações IACUC enquanto na água estática.</li>
	</ol></li> <li>Embrião criação <ol><li>palco e elevar os embriões de zebrafish para larvas sob condições padrão 17.</li>
		<li>Recolher animais fenotipicamente selvagem-tipo, usando uma pipeta de vidro no dia 5 ou 6 quando a bexiga natatória é inflada em 75% da embreagem. Coloque fenotípicos tipos selvagens no berçário gravação de que os pais rendeu-lhes. 
		Nota: Com alelos mutantes que são recessiva letal, o que é verdadeira de muitos mutantes esqueléticos, homozigotos mutantes não conseguem forma natatórias 18 , 19. Portanto, fenotípicos tipos selvagens podem ser discernidos facilmente de seus irmãos mutantes baseados no inflado natatórias.</li>
	</ol></li> <li>Alcian Blue/alizarina Red cartilagem e osso coloração <ol><li>anestesiar as larvas que não inflar seus natatórias usando 0,17 g/L tricaina-S em embriões. Colete animais em tubos de 1,5 mL microcentrifuga com um vidro largo-furo pipeta Pasteur. Adicionar a não mais de 100 larvas por tubo.</li>
		<li>Remover água de embrião de cada tubo e corrigir animais em 1 mL de 2% paraformaldeído em PBS 1x por tubo. 
		Atenção: PFA aquosa é combustível e irá causar irritação cutânea e ocular grave. Usar equipamento de protecção adequado como luvas e óculos de proteção e lave bem as mãos após o uso.</li>
		<li>Rock para 1h; fixação mais prejudica a coloração de osso. Verificar os tubos regularmente durante esta e todas as etapas subsequentes de balanço para não garantir que nenhuma larva tem tornar-se preso ao lado ou aglutinadas no fundo do tubo.</li>
		<li>Retire o fixador de tubos utilizando uma pipeta de vidro, adicione 1 mL de etanol a 50% e o rock de 10 min.</li>
		<li>Preparar fresco coloração solução adicionando 20 µ l de 0,5% de vermelho de alizarina por 1 mL de Alcian premix (0,04% Alcian Blue/10 mM MgCl 2 / 80% de etanol). Retire 50% de etanol, adicionar 1 mL de solução para cada tubo e pedra de coloração durante a noite. Larvas podem permanecer na mancha por até 5 dias.</li>
		<li>Remover a mancha solução dos tubos e adicionar 1 mL de etanol/10 mM MgCl 2 solução de 80% a cada tubo. Agitar os tubos pelo menos 1 h; enxaguar a noite pode produzir uma mancha mais clara de Alcian Blue.</li>
		<li>Remover o 80% etanol/10 mM MgCl 2 solução dos tubos e adicionar 1 mL de etanol a 50%; rock para 5 min.</li>
		<li>Remover a solução de etanol 50% dos tubos e adicionar 1 mL de etanol a 25% e rock 5 min.</li>
		<li>Remover a solução de etanol 50% dos tubos e adicionar 1 mL recém-preparada 3% H 2 O 2 /0.5% solução de branqueamento KOH. Deixar as tampas abertas e deixe os tubos fique um rack de microtubo por cerca de 10 min ou até uma coloração marrom fraca pode ser vista na parte superior da solução. 
		Nota: Uma camada de forma bolhas no topo da solução. Cuidado de sincronismo é necessário neste passo, tão mais branqueamento resultará em uma mancha de dupla pobre.</li>
		<li>Remover a solução de branqueamento e adicionar 1 mL de glycerol/0.1% 25% KOH; rock para 10 min a 1 h.</li>
		<li>Remover a solução KOH glycerol/0.1% 25% dos tubos, adicionar 1 mL de solução KOH glycerol/0.1% de 50% para cada tubo, rocha por 10 minutos durante a noite.</li>
		<li>Remover a solução KOH glycerol/0.1% de 50% dos tubos e novamente adicionar solução KOH glycerol/0.1% de 50% para cada tubo. Balançando a noite irá ajudar a remover as bolhas de ar que podem se acumular dentro de larvas. Loja manchado esqueléticas preparações a 4 ° C, quando não está sendo usado.</li>
	</ol></li> <li>Fenótipo marcando <ol><li>Pontuação manchado mutante prole para a penetrância do fenótipo selecionado. Em Nichols et al 1 mutantes foram marcados por qualquer ocorrência de osso ectópico. 
		Nota: Como os pais de zebrafish estão na água estática e a mancha de vermelho de alizarina pode desaparecer com o tempo, é importante marcar esqueletos dentro de alguns dias de completar a preparação esquelética.</li>
		<li>Penetrância é a proporção de um genótipo que tem um fenótipo. Calcular a porcentagem penetrância pela seguinte fórmula: % penetrância = (mutantes com fenótipo) / (número total de mutantes) × 100</li></ol></li></ol> 3. Seleção família <ol><li>escolher dois alta penetrância e duas famílias de baixa penetrância para a próxima geração. Além de penetrância, é importante considerar a fecundidade e vigor ao escolher quais famílias para propagar; consulte a discussão para mais detalhes sobre isso.</li>
	<li>Dá um identificador de estoque subcada par parental: família.01,.02, etc</li>
	<li>Casa parentais pares no sistema principal com vários sexo misto &#39; companheiro &#39; peixes. Peixe do companheiro pode ser qualquer linha de zebrafish com características distintivas permanentes, óbvias, tais como a estrutura alterada de pigmentação ou fin. 
	Nota: Enquanto muitos pesquisadores com sucesso mantém apenas casais em um tanque, resultados favoráveis são vistos pela carcaça de pares com vários peixes de companheiro. Nesta etapa opcional permite que casais de animais a ser mantido nas escolas maiores e facilmente recuperada e podem ser repetidamente atravessaram conforme necessário. Pares dos pais podem ser atravessados repetidamente para gerar grandes famílias cheio-irmão; Espere pelo menos uma semana antes de repetir cruzando o mesmo par parental.</li>
	<li>Abater as famílias larvas da etapa 2.2.2. que não foram selecionados para a próxima geração.</li>
	<li>Rotular os tanques contendo as larvas do selvagem-tipo irmão de famílias selecionadas com a penetrância de seus irmãos mutantes e elevar-se até à idade adulta como normal.</li>
	<li>a próxima geração terá pelo menos quatro famílias cheio-irmãos, dois para a linha ascendente e dois para a linha descendente.</li>
	<li>Quando as larvas atingem a maturidade sexual, repetir o protocolo iniciando no primeiro passo com a nova geração.</li>
</ol>

<ol><li>Nichols, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligament+versus+bone+cell+identity+in+the+zebrafish+hyoid+skeleton+is+regulated+by+mef2ca%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca.</a> Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Reprodução seletiva revela sutilezas da função dos genes
Deslocando os fenótipos mutantes para ser mais ou menos grave por reprodução seletiva é uma maneira simples de ganhar novos insights sobre a função do gene. Quando comparado com os métodos padrão de reprodutores selecionados, o protocolo apresentado aqui pode render uma compreensão muito mais completa dos fenótipos mutantes. Especificamente, gerando tensões que são graves, a amplitude total dos fenótipos mutantes pode se...

O peixe-zebra é um sistema poderoso modelo para a compreensão do desenvolvimento esquelético. Com cepas mutantes zebrafish, biólogos podem decifrar a função dos genes durante a skeletogenesis. No entanto, zebrafish esquelético fenótipos mutantes podem apresentar com penetrância variável1,2,3,,4 que pode dificultar as análises genéticas e do desenvolvimento. A finalidade desse método é triplo. Primeiro, gerar zebrafish linhas mutantes que consistentemente produzem fenótipos graves permite a jusante do desenvolvimento estudos como lapso de tempo de gravação transplantação de5 e6. Esses tipos de estudos podem ficar inválidos ao tentar estudar fenótipos que apenas manifestam inconsistentemente. Em segundo lugar, consanguinidade zebrafish cepas pode diminuir a variação do fundo genético, promovendo assim a reprodutibilidade e consistência experimental. Por exemplo, realizando todos os em situ podem reduzir variabilidade confundimento e reforçar conclusões análises de hibridação em uma estirpe seletivamente pura. Em terceiro lugar, gerar tensões graves e suaves irá revelar toda a série fenotípica que pode resultar de uma mutação específica.
À primeira vista, a reprodução seletiva de mutantes letais parece impossível. Como pode uma raça para penetrância quando os animais que são marcados para seleção estão mortos? Felizmente, métodos de reprodução seletiva por seleção de família, especificamente a descendência testes, demonstraram eficácia na pecuária programas para muitos anos7,8. Estes programas são usados principalmente para reprodução seletiva para os traços que só estão presentes em um sexo, como a produção de leite em vacas ou produção de ovos em galinhas. Os machos destas espécies não podem ser marcados diretamente, mas seus descendentes são marcados e um valor é atribuído aos pais. Endividamento a partir desta estratégia, o protocolo aqui apresentado envolve marcando o fixo e manchados mutante prole de um par de zebrafish que são heterozigotos para um gene mutante de interesse. A penetrância de um fenótipo na prole mutantes letais homozigotos é atribuída aos pais quando decidir quais indivíduos irão produzir a próxima geração da linha. Achamos que este método é um meio eficaz de deslocamento penetrância em zebrafish mutantes esquelética letal1.
Similar a outros estudos, este protocolo de reprodução seletiva leva sob critérios de consideração como tamanho da embreagem, sobrevivência da prole, normal desenvolvimento de embriões e uma relação de sexo9. No entanto, esses fatores são considerados no contexto de um fundo mutante com o objetivo de desviar a penetrância mutante. Portanto, este protocolo amplia paradigmas anteriores de reprodução seletiva, oferecendo um método para fortalecer as análises mutantes do desenvolvimento, bem como aumentar a homogeneidade de fundo.
Este protocolo requer genotipagem extensa, por isso é importante desenvolver um protocolo confiável, rápida genotipagem com antecedência. Existem muitos genotipagem protocolos disponíveis10,11, no entanto, encontramos o KASP genotipagem12,13,14 é mais rápido, de custo mais eficiente e mais confiável do que os métodos baseada na clivagem de enzima de restrição de sequências amplificadas10. Portanto, nós incluímos um protocolo KASP neste trabalho. Além disso, podemos focar esqueléticos fenótipos mutantes neste protocolo e incluir um procedimento para Alcian Blue/alizarina Red coloração modificada de anteriores protocolos15.
O método descrito aqui é uma estratégia simples para comutação penetrância mutante letal para cima ou para baixo. Enquanto este protocolo incide sobre fenótipos mutantes esqueléticos, acreditamos que vai ser uma estratégia útil para a criação de todas as linhas de zebrafish mutante. De fato, a utilidade desta estratégia de reprodução provável estende-se além do zebrafish. Prevemos que este protocolo pode ser modificado para deslocar penetrância em uma ampla gama de organismos. Penetrância letal de movimento através do teste de progênie pode ajudar a impulsionar o progresso de qualquer geneticista do desenvolvimento.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldeído, peletizado, sólido</td><td>Ted Pella Co.</td><td>18501</td><td>Pelleted PFA é uma alternativa mais segura ao cloreto de magnésio PFA em pó</td></tr><tr><td>, sólido</td><td>Acros Organics</td><td>223210010</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, aquoso</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>190 prova de etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue, sólido</td><td>Anatech Ltd.</td><td>867</td><td>Deve ser de Anatech</td></tr><tr><td>Alizarin Red, sólido</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol, líquido</td><td>Fisher</td><td>BP229 1</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio, líquido</td><td>Fisher</td><td>BP263500</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio,&nbsp; sólido</td><td>Fisher</td><td>P250 500</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Máquina de PCR em tempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de Reação Óptica Rápida MicroAmp de 96 poços com Código de Barras (0,1 mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Vedação Microseal 'B'</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>KASP Master Mix, Alta ROX</td><td>LGC</td><td>KBS-1016-022</td><td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td></tr><tr><td>KASP By Design Primer Mix</td><td>LGC</td><td>KBS-2100-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl, sólido</td><td>Fisher</td><td>BP153 500</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de potássio, sólido</td><td>Fisher</td><td>BP366 500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, líquido</td><td>Fisher</td><td>BP337 100</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fisher</td><td>BP1700 100</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termociclador</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Gota Controlada Pasteur Pipetas</td><td>Fisher</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>para quantificação de DNA</td></tr></tbody></table>

deslocando o zebrafish letal esquelético mutante penetrância por teste de progênie

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Zebrafish fenótipos mutantes são frequentemente incompleta penetrante, manifestando-se apenas em alguns mutantes. Fenótipos interessantes que aparecem de forma inconsistente podem ser difícil de estudar e podem levar a confundir os resultados. O protocolo descrito aqui é um paradigma de reprodução simples para aumentar e diminuir penetrância em mutantes esquelético zebrafish letal. Porque os mutantes letais não podem ser seletivamente criados diretamente, a estratégia de reprodução seletiva clássico de teste de progênie é empregada. Esse método também inclui protocolos para Kompetitive alelo específico do PCR (KASP) genotipagem zebrafish e coloração zebrafish larval de cartilagem e osso. Aplicar a estratégia de criação descrita aqui pode aumentar a penetrância de um fenótipo esquelético interessante, permitindo que mais resultados reprodutíveis em aplicações a jusante. Além disso, diminuindo a penetrância mutante através desta estratégia de reprodução seletiva pode revelar os processos de desenvolvimento que requerem mais crucialmente a função do gene mutado. Enquanto o esqueleto é especificamente considerado aqui, propomos que esta metodologia será útil para todas as linhas mutantes zebrafish.

Este protocolo é uma técnica de maneio a longo prazo útil para a compreensão do zebrafish esquelético os mutantes (Figura 1). Reprodução seletiva através do teste de progênie deve produzir uma mudança em geral penetrância descendente e ascendente em poucas gerações (Figura 2). Em nosso trabalho anterior, duas rodadas de reprodução seletiva dirigimos a penetrância média para baixo de 17% para 3%1. Da mesma ...

O objetivo do presente protocolo é alterar a penetrância de letais esqueléticos fenótipos mutantes no zebrafish por reprodução seletiva. Letais mutantes não podem ser cultivados até a idade adulta e se criados, portanto este protocolo descreve um método de controle e selecionando penetrância através de várias gerações por testes de progênie.

Deslocando o Zebrafish letal esquelético mutante penetrância por teste de progênie

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

O objetivo geral dessa estratégia de cruzamento é manipular a penetrância do mutante para cima ou para baixo. Esse método de seleção permite uma compreensão mais completa dos fenótipos mutantes. Ao gerar linhagens mutantes com alta e baixa penetrância, toda a série fenotípica de uma mutação pode ser compreendida.A maioria das mutações em escamas de peixe-zebra são recessivas e letais, de modo que mutantes homozigóticos morrem antes de poderem ser cruzados diretamente. Portanto, empregamos a estratégia clássica de cruzamento seletivo por teste de prole, que demonstramos aqui. Tivemos a ideia para este método ao tentar registrar, em lapso de tempo, o desenvolvimento de células ósseas ectópicas.Frustrantemente, células ósseas extras apareciam frequentemente nele, então decidimos alterar os penetrantes mutantes por meio de cruzamento seletivo. Embora realizemos este método em escala de peixe-zebra com uma linhagem mutante, ele também pode ser aplicado a outros fenótipos mutantes de peixe-zebra e, provavelmente, a outros organismos. Após preparar o estoque inicial de peixes-zebra não selecionados de acordo com o protocolo descrito, realize a genotipagem KASP da seguinte forma.Coloque o tecido da cauda de peixe-zebra em 50 microlitros de tampão de lise nas cavidades de uma placa de 96 poços. Adicione 10 microlitros de proteinase K a 10 miligramas por mililitro por poço e incube as amostras de tecido em um termociclador a 55 graus Celsius por duas a cinco horas. Em seguida, realize uma etapa de inativação de 20 minutos a 94 graus Celsius.Refrigere o produto da lise após a digestão. Utilize um espectrofotômetro para quantificar o DNA genômico. Em seguida, com água grau biologia molecular, dilua o molde genômico de modo que cada reação contenha aproximadamente 20 a 30 nanogramas.Adicione 0,14 microlitros da mistura de primers KASP e cinco microlitros da mistura mestra KASP por amostra em gelo, em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e misture bem. Em seguida, centrifugue brevemente para recolher o conteúdo no fundo do tubo. Pipete cinco microlitros da solução da mistura mestra de primers nos poços de uma placa PCR óptica de 96 poços apropriada para o equipamento de PCR em tempo real utilizado.Em seguida, pipete cinco microlitros das amostras diluídas de molde de DNA em cada poço e aspire com uma pipeta para misturar. Coloque um selo de filme opticamente transparente sobre a placa, garantindo que o filme esteja completamente selado em cada poço. Centrifugue brevemente a placa a 600 x G para recolher o conteúdo no fundo e remover bolhas da mistura.Após realizar a reação principal de KASP, visualize o gráfico de dispersão resultante produzido pelo computador de análise. Mantenha os animais heterozigotos identificados juntos no sistema principal de água. Após a recuperação dos animais do corte da nadadeira, realize cruzamentos intercruzados aos pares, utilizando divisores para garantir que os embriões estejam sincronizados.Colete os embriões e mantenha os pares parentais isolados em gaiolas de reprodução. Monitore os adultos isolados para que peixes agressivos possam ser separados ou recebam abrigo. Para criar os embriões no quinto ou sexto dia, quando as bexigas natatórias estiverem infladas em 75% de uma postura, utilize uma pipeta de vidro para coletar animais fenotipicamente selvagens.Coloque os fenótipos selvagens no berçário, registrando quais pais os geraram. Após anestesiar larvas que não inflam suas bexigas natatórias de acordo com o protocolo descrito no texto, use uma pipeta de vidro Pasteur de grande diâmetro para coletar os animais em tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros. Remova a água dos embriões de cada tubo e substitua por um mililitro de paraformaldeído 2% em PBS 1x.Balançar os tubos durante uma hora para fixar os animais. Acompanhar os tubos regularmente durante este e todos os demais passos de agitação para garantir que nenhuma larva tenha aderido à parede ou se aglomerado no fundo do tubo. Utilizar uma pipeta de vidro para remover o fixador dos tubos.Em seguida, adicione um mililitro de etanol a 50%. Agite as amostras por mais 10 minutos. Prepare uma solução de coloração fresca adicionando 20 microlitros de alizarina vermelha a 0,5% por cada mililitro da mistura prévia de Alcian.Remova o etanol a 50% e adicione um mililitro de solução corante a cada tubo. Em seguida, agite os tubos durante a noite. Alguns dias após o clareamento dos embriões de acordo com o protocolo descrito, analise a prole mutante corada quanto aos indivíduos penetrantes.Neste exemplo, pontuamos qualquer ocorrência de um tema ósseo. Para a próxima geração, escolha duas famílias com alta penetrância e duas com baixa penetrância. Atribua a cada par parental um identificador de subestoque, por exemplo, família 4.01, 02, e assim por diante.Também é útil indicar o número da geração endogâmica em todas as etiquetas. Mantenha os pares parentais no sistema principal com vários peixes companheiros de sexos mistos. Os peixes companheiros podem ser de qualquer linhagem de peixe-zebra com características distintas permanentes e evidentes, como pigmentação alterada ou estrutura das barbatanas.Rotule os tanques contendo as larvas irmãs do tipo selvagem das famílias selecionadas com os penetrantes dos irmãos mutantes e crie os peixes até a idade adulta conforme o normal. A seleção por teste de progênie deve gerar uma mudança na penetrância geral, tanto para baixo quanto para cima, em poucas gerações. Nestes exemplos, aplicado ao mutante mef2ca b1086, foram selecionados penetrantes altos ou baixos de um osso temático entre o opérculo e o raio braquióstego em mutantes homozigotos letais.Em um procedimento de eletroforese bem-sucedido, o programa de computador deve reconhecer os agrupamentos por tipo das amostras correspondentes ao tipo de gene, e as amostras de controle negativo (NTC) devem localizar-se próximas à origem do gráfico após a realização de ciclos suficientes. Como demonstrado aqui, uma coloração bem-sucedida com azul de Alcian e vermelho de alizarina apresentará elementos de osso e cartilagem intensamente corados, sem transparência ou tonalidade fraca. As bordas dos elementos cartilaginosos devem parecer nítidas e os condrócitos individuais serão discerníveis.O azul de alciana muito concentrado não permitiu a visualização clara de outros tecidos, tornando a análise impossível. A implementação desta técnica a partir da manutenção de linhagens de peixe-zebra provavelmente alterará a penetrância em algumas gerações. Após este procedimento, outros métodos, como hibridização NC2 e estudos de imagens com lapso de tempo, podem gerar resultados mais consistentes.Utilizamos esta técnica para explorar a herdabilidade da variação de fenótipos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar seletivamente suas linhagens mutantes para alterar a penetrância, mesmo que a mutação seja letal.

shifting-zebrafish-lethal-skeletal-mutant-penetrance-progeny

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Aqui, apresentamos uma abordagem sistemática para o desenvolvimento fisiologicamente relevante, sensível e...

In Vivo Modelagem do Morbid Genoma Humano utilizando Danio rerio

O peixe-zebra é agora uma ferramenta estabelecida e poderosa para modelar distrofias musculares, miopatias congênitas e doenças neuromusculares relacionadas. A birrefringência e o comportamento de fuga evocado pelo toque são dois ensaios não invasivos comuns usados para determinar o grau de desorganização muscular e comprometimento locomotor de embriões de peixe-zebra durante o desenvolvimento inicial.

Análise de defeitos musculares esqueléticos em larvas de peixe-zebra por birrefringência e ensaios de resposta de fuga evocada por toque

O peixe-zebra é um poderoso sistema modelo para biologia do desenvolvimento e pesquisa de doenças humanas devido à sua semelhança genética com vertebrados superiores. Este protocolo descreve uma metodologia para criar embriões de peixe-zebra haplóides que podem ser utilizados para estratégias de triagem direta para identificar mutações recessivas em genes essenciais para a embriogênese inicial.

Produção de Haplóide embriões Zebrafish por<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilização

Zebrafish têm sido usados como organismos modelo genético confiável na investigação biomédica, especialmente com o advento das tecnologias de edição de gene. Quando os fenótipos larvas são esperados, identificação de DNA de extração e genótipo pode ser desafiador. Aqui, descrevemos um procedimento eficiente de genotipagem para larvas de peixe-zebra, por cauda de recorte, tão cedo quanto pós-fertilização 72-h.

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Edição de Base Eficiente sem PAM para Modelagem de Zebrafish de Doenças Genéticas Humanas com zSpRY-ABE8e

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RASopatias são síndromes genéticas multissistêmicas causadas pela hiperativação da via RAS-MAPK. Variantes potencialmente patogênicas que aguardam validação surgem continuamente, enquanto evidências pré-clínicas fracas limitam a terapia. Aqui, descrevemos nosso protocolo in vivo para testar e validar os níveis de ativação de ERK associados à RASopatia e sua modulação farmacológica durante a embriogênese por imagens FRET ao vivo em peixe-zebra Teen-reporter.

Um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos iniciais da síndrome de Noonan do peixe-zebra por meio de microscopia FRET ao vivo e imunofluorescência

Aqui, descrevemos um protocolo para gerar mutante materno que acopla uma linha knock-in zpc:cas9 estável com a entrega mediada por Tol2 de de expressão de sgRNA.

Geração de mutantes maternos usando zpc:cas9 knock-in zebrafish

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Análises Morfométricas de Forma: A Caixa de Ferramentas de Software de Análise para Quantificação de Formas Craniofaciais em Peixe-Zebra

Aprenda a modificar a penetrância de mutações esqueléticas letais em zebrafish através de cruzamento seletivo com testes de progênie. Este método permite gerar linhagens de alta e baixa penetrância para análise genética.

Deslocando o Zebrafish letal esquelético mutante penetrância por teste de progênie

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