Avaliação da senescência induzida por lesão e na Vivo reprogramação no músculo esquelético

O objetivo geral deste protocolo é avaliar tanto a senescência in vivo quanto a reprogramação no músculo esquelético após lesão tecidual. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da medicina regenerativa, como como aumentar a plasticidade celular para promover a regeneração muscular. A principal vantagem desta técnica é fornecer um método confiável para detectar e quantificar células senescentes no ambiente residente.

A senescência celular foi recentemente implicada na reparação e regeneração tecidual. Compreender os mecanismos pelos quais a senescência contribui para a reparação e regeneração tecidual certamente terá um impacto na medicina regenerativa. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao investigar o impacto potencial do dano tecidual na reprogramação in vivo no músculo esquelético.

Para iniciar este procedimento, fixe as lâminas de amostras de músculo em paraformaldeído 1% e glutaraldeído 0,2% em PBS por quatro minutos. Em seguida, lave as lâminas com PBS duas vezes, por 10 minutos cada vez. Depois, lave as lâminas com PBS, pH 5,5, por 30 minutos.

Em seguida, incubar as seções com a solução de X-gal no escuro a 37 graus Celsius por um mínimo de 24 horas. Depois disso, lavar as lâminas com PBS três vezes, cada vez por 10 minutos. Então, pós-fixar as lâminas com PBS contendo 1% de paraformaldeído por 30 minutos.

Por fim, lave as lâminas com PBS três vezes. Em seguida, contra-estaine com eosina 0,2% imergindo as lâminas na solução de eosina por um minuto. Depois, enxágue-as brevemente com água destilada.

Monte as lâminas com meio de montagem aquoso não fluorescente. Fixe as lâminas com PBS contendo paraformaldeído 4% por 10 minutos. Lave-as com PBS duas vezes, por 10 minutos cada vez.

Posteriormente, adicione a solução de permeabilização e incube por cinco minutos. Em seguida, lave as lâminas com PBS duas vezes, por cinco minutos cada vez. Na última lavagem, adicione 200 microlitros de PBS, contendo 0,25% de BSA, diretamente sobre as lâminas por cinco minutos.

Incube os lâminas com o anticorpo primário anti-Nanog a 1,25 microgramas por mililitro durante a noite a 4 graus Celsius em PBS contendo 5% de FBS. Lave os lâminas com PBS duas vezes, por 10 minutos cada. Na última lavagem, utilize 200 microlitros de PBS contendo 0,25% de BSA por cinco minutos.

Posteriormente, incube as lâminas com 100 microlitros de anticorpo secundário RAB-HRP de um kit pronto para uso durante 45 minutos. Em seguida, lave as lâminas com PBS três vezes, cada vez por cinco minutos, para remover o anticorpo secundário. Depois disso, dilua o DAB no tampão de substrato, fornecido pelo kit pronto para uso.

Agite vigorosamente. Adicione 100 microlitros de solução de DAB diretamente sobre cada lâmina e incube por no máximo 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, remova a solução de DAB lavando as lâminas com água.

Contracolorir as lâminas com solução de vermelho rápido por dois minutos. Em seguida, lavar as lâminas com água novamente, brevemente. Após isso, desidratá-las com etanol a 95% por cinco minutos, seguido por etanol a 100% duas vezes, cada vez por cinco minutos.

Em seguida, monte as lâminas com meio de montagem de endurecimento rápido. Observe as lâminas ao microscópio em campo claro com aumento de 20x para evitar fundo. Neste procedimento, examine as lâminas e selecione as duas seções de melhor qualidade em cada lâmina, com a maior distância possível entre elas, com base na integridade do tecido, na qualidade da coloração e na contracoloração.

Conte as células positivas para SA-Beta-Gal nessas duas seções e calcule o valor médio. Em seguida, determine a classificação do tamanho do pixel mediante a seleção manual das células positivas para SA-Beta-Gal menores e maiores. Na interface do ImageJ, clique em Analisar, Ferramentas, Gerenciador de ROI, Analisar, Definir Medida.

Em seguida, selecione Área. Utilize a ferramenta de seleção e contorne a célula positiva para SA-Beta-Gal menor e a maior, e adicione-as ao Gerenciador de ROI clicando em Adicionar. Depois disso, meça os tamanhos utilizando o botão Medir e salve os valores para uso posterior.

Em seguida, ajuste o parâmetro de limiar para garantir que todas as células positivas visíveis sejam selecionadas. Converta a imagem para escala de cinza clicando em Imagem, Tipo e depois 8 bits. Posteriormente, vá até Imagem, Ajustar e Limiar.

Mova o segundo cursor até que todas as células positivas para SA-Beta-Gal estejam cobertas em vermelho, então clique em Aplicar. Analise as partículas clicando em Analisar, Analisar Partículas, seguido de Tamanho e aplique o valor definido anteriormente. Insira Circularidade, 0,00-1,00, e clique em OK. Um resumo de todas as partículas contadas será exibido no Gerenciador de ROI.

Agora, transfira todas as partículas selecionadas para a imagem original. Ajuste a seleção manualmente para garantir uma quantificação precisa. Adicione células positivas ou remova células falsamente positivas.

Por fim, meça a área delimitando a seção usando a ferramenta de seleção. Clique em Gerenciador de ROI, Adicionar, depois em Medir. Sob o microscópio, conte manualmente as células positivas para Nanog no campo claro com aumento de 20x.

É apresentada aqui uma representação esquemática para avaliar a reprogramação in vivo e o nível de senescência após lesão muscular. Abaixo estão imagens representativas da coloração por SA-Beta-Gal e Nanog em cortes congelados de músculo esquelético lesionado. Essas imagens mostram a coloração por SA-Beta-Gal, contra-colorada com eosina, e a coloração de Nanog, contra-colorada com vermelho rápido.

Os músculos não lesados são mostrados na parte superior, enquanto os músculos lesados são mostrados na parte inferior. Este gráfico mostra a quantificação e a correlação de células positivas para SA-Beta-Gal e células positivas para Nanog em seções consecutivas aos 10 dias após a lesão. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de sempre incluir um controle negativo para garantir a especificidade da coloração.

Após este procedimento, todos os métodos, como imunofluorescência e a escolha de diferentes marcadores de senescência, podem ser realizados com diversas linhagens celulares para responder perguntas adicionais, como a identidade celular das células senescentes. Após cada avanço, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de senescência ou de reparo e regeneração tecidual explorarem como a senescência celular pode promover plasticidade celular para facilitar o reparo e a regeneração tecidual em mamíferos. Assim, após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar tanto células senescentes quanto células reprogramadas in vivo.