Name: Quantificação de abundância e carregamento níveis de RNAs de transferência em Escherichia coli (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Aprenda a quantificar níveis de carregamento de RNAs de transferência em Escherichia coli usando células spike-in para normalização. Este método permite comparar abundância de tRNA entre diferentes estados de crescimento celular.

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Os autores agradecer Marit Warrer excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho dinamarquês para pesquisa independente | Ciências naturais [1323-00343B] e a Fundação de pesquisa nacional dinamarquesa [DNRF120].

1. preparação de culturas bacterianas.
<ol><li>Crescer todas as culturas em Erlenmeyers com uma relação de volume de cultura/frasco no máximo 1/6. Em uma instalação experimental típica, crescem as culturas a 37,0 ° C e agitando a 160 rpm em morpholinepropanesulfonic ácido (MOPS) mínimo médio 18 suplementado com a fonte de carbono preferencial, por exemplo glicose 0,2%, pelo menos 10 gerações consecutivas antes da colheita do RNA.</li>
	<li>o dia antes da colheita de RNA, diluir uma cultura Superdimensonada da estirpe desejada em meio mínimo ESPANADORES de tal forma que vai chegar a desejada OD 436 no momento desejado no dia seguinte. Calcular o volume de cultura Superdimensonada usar para inoculação pela fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq1.jpg" /> Nota: aqui, OD novo denota o desejado OD 436 após a incubação, V nova denota o volume da cultura diluído, OD velho denota o OD 436 da cultura Superdimensonada diluída de, G denota o número de gerações a cultura vai crescer, desde o tempo de diluição (t 1) que o tempo que é necessário no dia seguinte (t 2) e pode ser calculada como: tempo de diferença (em min) entre t 1 e t 2 dividido pelo tempo de geração (em min). Para garantir o crescimento de estado estacionário, no momento da amostragem, G deve ser &#8805; 10; V velho denota o volume da cultura out-adulto que deve ser transferido para o meio fresco. Esta equação é uma aproximação que não leva em conta para qualquer fase de retardo; um fenômeno que frequentemente observado após a diluição de uma cultura de out-crescida na mídia fresca.
	<ol><li>Condições de crescimento irá variar dependendo da finalidade do experimento, mas para limitar a variação de célula para célula em níveis de tRNA e aumentar a reprodutibilidade dos resultados, (recomendado) crescem as culturas para firmar o estado antes da amostragem 19.</li></ol></li></ol> 2. Preparação de pico-em células Nota: A cepa de Escherichia coli MAS1074, que expressa o gene selC codificação tRNA selC sob o controle de um isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)- promotor inducible é usado como a tensão de pico-no.
<ol><li>Dilua uma cultura Superdimensonada de MAS1074 para um OD 436 de 0,05 em MOPS mínimo suplementado com 100 µ g/mL ampicilina e 0,2% de glicose. Crescer a cultura a 37 ° C, agitando a 160 rpm. 
	Nota: Veja a discussão para o uso de uma estirpe de referência alternativo.</li>
	<li>Em OD 436 ~ 0.1, adicionar IPTG para uma concentração final de 1 mM para induzir a expressão de tRNA selC. Crescer a cultura para OD 436 ~0.5 (~ 3-4 h de crescimento) e mover o frasco de cultura para um banho de gelo. Manter a cultura de pico-na célula no gelo até que todas as amostras para a purificação de RNA foram colhidas.</li>
</ol> 3. Colheita das amostras experimentais.
<ol><li>Pre-quente (37 ° C), um tampado Erlenmeyer de 100 mL (ou similar) contendo 4 mL 10% (p/v) o ácido tricloroacético (TCA) para cada amostra, colocando-o em um banho de água aquecida. 
	Nota: cuidado, TCA decompõe-se em cima de aquecimento, produzindo fumos tóxicos e corrosivos, incluindo cloreto de hidrogênio e clorofórmio. A solução em água é um ácido forte; Ele reage violentamente com bases e é corrosivo para muitos metais. Devem ser tomadas precauções adequada quando usando esse líquido.</li>
	<li>Imediatamente antes da colheita da pilha, medir e registrar o OD 436 da cultura.</li>
	<li>Para colher as células, transferir 4 mL da cultura para um frasco previamente aquecido contendo TCA.</li>
	<li>Misturar a amostra agitando o balão com a mão para s. 5 mistura com o TCA imediatamente desativa actividades enzimáticas tudo e, assim, preserva os níveis de carga dos tRNAs. 
	Nota: Se várias amostras devem ser recolhidos, manter a amostras colhidas no TCA no gelo até que todas as amostras foram coletadas.</li>
</ol> 4. Adição de pico-em células Nota: preparação de pico-em células é descrita na etapa 2.
<ol><li>Quando todos amostras para preparação do RNA foram coletado, adicionar 5% pico-em células (baseadas no OD) para cada amostra. 
	Nota: O volume de pico-na célula cultura necessária é calculado pela fórmula: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq2.jpg" /> onde V pico denota o volume da cultura de pilha de pico-no necessário, V exp denota o volume da cultura de células experimentais colhidos (sem TCA), OD exp denota o OD 436 da cultura de pilha experimental no momento da colheita no TCA. OD spike denota o OD 436 da cultura pico-na célula. Se múltiplas amostras são colhidas em diferentes ODs, o volume de pico em células adicionado deve ser ajustado de acordo com a fórmula acima para cada amostra.</li>
	<li>Para quantificar a contribuição da espiga-em células para as espécies de RNA de interesse, preparar uma amostra contendo somente spike-em células misturando 4ml spike-em células com 4 mL TCA. Preparar RNA a partir desta amostra da mesma forma como para as outras amostras.</li>
	<li>, Opcionalmente, tomar outro frasco contendo apenas a amostra experimental, sem pico-em células e incluí-lo para quantificar a contribuição da amostra experimental para o tRNA selC níveis; os níveis endógenos de tRNA selC em Escherichia coli K-12 são insignificante baixo.</li>
</ol> 5. Preparação do RNA Nota: protocolo de preparação do RNA o descrito aqui é essencialmente descrito por Vieira et al. 1; Para evitar o deacylation do aminoacylated os tRNAs durante a purificação é importante manter as amostras em pH ácido e a 0 ° C ao longo do curso da purificação. Use tubos/frascos estéreis limpo para manter as amostras e as soluções e preparar todas as soluções com ultrapura (18,2 MΩ·cm resistividade) água.
<ol><li>Pour 8 mL de cada amostra para um tubo de centrifugação refrigerada de gelo. Centrifugar as amostras por 10 min a 9.500 x g a 4 ° C. completamente remover sobrenadante e ressuspender em 0,3 mL frio 0,3 M de acetato de sódio, pH 4,5 e 10 mM de EDTA.</li>
	<li>Transferir cada amostra para um tubo de microcentrifugadora frio 1,5 mL e adicionar fenol 0,3 mL solução equilibrada com a mesma reserva. 
	Nota: cuidado, fenol produz gases tóxicos e é altamente corrosivo para a pele.</li>
	<li>Vortex cada amostra 10 x 15 s pelo menos 1 min entre cada vórtice. Num Vortex manter as amostras em 0 ° C. usar as pausas frequentes para assegurar que as amostras de mantenham-se frio.</li>
	<li>Amostras de centrifugar por 15 min a 20.000 x g a 4 ° C. transferência a fase água (fase superior) para Nova microcentrifuga de 1,5 mL de tubos. Adicionar 0,3 mL frio fenol e vórtice 4 x 15 s como antes.</li>
	<li>Centrifugação por 10min a 20.000 x g a 4 ° C. transferência a fase de água de novo, frio 1,5 mL microcentrifuge tubos contendo 2,5 vezes o volume de etanol a 96% (~ 750 µ l). Precipitar o RNA incubando os tubos por 1h a-20 ° C, ou durante a noite a -80 ° C.</li>
	<li>Amostras de centrifugação por 30 min a 20.000 x g a 4 ° C. descartar o sobrenadante e cuidadosamente, adicionar 1 mL de etanol a 70% frio sem perturbar a pelota do RNA. Inverta suavemente uma vez para lavar o interior dos tubos com etanol. 
	Nota: O sedimento pode ser difícil ver neste passo.</li>
	<li>Centrifugação por 10min a 20.000 x g a 4 ° C. completamente remover o sobrenadante e deixe secar naturalmente a pelota até não sobrar nenhuma etanol. Resuspenda o pellet vortexing vigorosamente em 20 µ l 10mm frio de sódio acetato pH 4.5 e 1 mM EDTA. 
	Nota: Não seque em demasiado a pelota como ele se tornará difícil ressuspender.</li>
	<li>, Opcionalmente, avaliar a concentração de RNA medindo a absorbância em 260 nm.</li>
	<li>, Opcionalmente, avaliar a qualidade do RNA purificado através de de eletroforese de gel de agarose 20.</li>
	<li>Amostras de loja a -80 ° C. 
	Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol> < classe p= "jove_title" &gt; 6. Preparação da amostra de controle quimicamente deacylated Nota: para distinguir a banda de aminoacylated tRNA de sua contraparte deacylated na Northern blot, um quimicamente deacylated alíquota é preparado pelo tratamento alcalino. Para a maioria dos fins, é suficiente para deacylate uma única amostra para cada borrão do Norte.
Amostra de <ol><li>thaw o RNA no gelo. Transfira uma alíquota de 4 µ l da amostra do RNA para um tubo novo. Adicione pH de Tris-HCl µ l 46 9.0. Incubar durante 2 h a 37 ° C.</li>
	<li>Adicionar 15 µ l de acetato de sódio 0,3 M, pH 4,5 e posteriormente Adicionar 125 µ l de etanol a 96%. Precipitar o RNA a-20 ° C durante 1 h.</li>
	<li>Centrífuga por 30 min a 20.000 x g a 4 ° C. completamente remover o sobrenadante e ressuspender em 4 µ l 10mm frio de sódio acetato pH 4,5 e 1 mM EDTA. 
	Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, se a amostra é armazenada a -80 ° C.</li>
</ol> 7. Gel eletroforese e mancha do Norte <ol><li>Mix 4 µ l de amostra (não tratada ou quimicamente deacylated) com amortecedor do carregamento 6 µ l (0,1 M de acetato de sódio (pH 5.0), 8m ureia, 0,05% de azul de bromofenol e 0.05% xileno cianol). 
	Nota: Lembre-se de incluir a amostra contendo apenas spike-em células, o quimicamente deacylated amostra (e a amostra sem espiga-em células, se um estava preparado).</li>
	<li>Carregar as amostras em 0,4 mm espessura 6,5% gel de poliacrilamida (acrylam 19:1 - ide:bisacrylamide) que contém ureia 8 M em tampão de acetato de sódio 0,1 M (pH 5.0). Usar géis longa de 60 cm para a adequada separação de espécies de tRNA.</li>
	<li>Separado do RNA por eletroforese em gel de 10 V/cm a 4 ° C, até o azul de bromofenol atinge o fundo do gel (~ 20 h).</li>
	Tintura de <li>a área da tintura xileno cianol e 20 cm para baixo para o azul de bromofenol é usada para a mancha (a distância entre os dois corantes deve ser 25-30 cm). Separe as placas de vidro de dois, com cuidado para que o gel permanece em um deles. Um pedaço de papel de filtro fino é cortado para o tamanho da área de mancha desejada e colocado em cima da parte do gel que será usado para a mancha. As peças do gel que não são cobertas por papel de filtro são cortadas e descartadas. Use o filtro de papel para levantar cuidadosamente o pedaço de gel de longe a placa de vidro. 
	Nota: O gel grande é muito frágil para segurar com cuidado.</li>
	<li>Uma membrana de nylon positivamente carregado (por exemplo, membrana Hybond N +) é colocada no topo do gel e é electroblotted a 20 V para 90 min com 40 mM Tris-Acetato (pH 8.1), 2 mM EDTA como buffer de transferência.</li>
	<li>Crosslink o RNA para a membrana usando luz UV (0.12 J/cm 2). 
	Nota: A membrana agora pode ser armazenada à temperatura ambiente e o protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol> 8. Projeto e verificação de sondas Nota: cuidado de projeto e verificação das sondas de borrão do Norte é crucial para obter resultados fiáveis e evitar indesejável Cruz-hibridação com outras espécies de RNA.
<ol><li>Uso curtos oligonucleotides sintéticos como sondas. Desenha a sequência de sonda, de forma que é complementar à parte mais original da sequência do tRNA de interesse - muitas vezes é o loop anticodão. 
	Nota: Uma lista de sequências de tRNA previsto de vários organismos pode ser encontrada no tRNA Genomic Database (GtRNAdb) 21.</li>
	<li>Ajuste o comprimento da sequência para obter uma previsão de fusão temperatura de 55-65 ° C.</li>
	<li>BLAST (básico Local Alignment Search Tool) o escolhido sequenciar contra a sequência do genoma da cepa bacteriana utilizada no experimento, para verificar se a sequência é exclusiva para o tRNA selecionados, conforme descrito em 22. 
	Nota: A tabela 1 lista sonda sugeridas sequências de vários tRNAs diferentes de e. coli K12. Se a sonda é específica para o tRNA de interesse, apenas duas bandas são visíveis na Northern blot (carregado e descarregado tRNA) e somente uma faixa é visível na pista com a amostra deacylated (tRNA descarregado). Se mais de duas bandas estão presentes, ou se mais validação da especificidade da sonda é desejada, ver discussão.</li>
</ol> 9. Hibridação do borrão do Norte Nota: nas etapas a seguir, a membrana é sequencialmente hibridizada com sondas complementares para os tRNAs específico desejado, incluindo uma sonda específica para a referência de tRNA selC.
<ol><li>Colocar a membrana em um tubo de hibridização e adicionar 6 mL de solução de hibridação (0.9 M NaCl, 0,05 M NaH 2 PO 4 (pH 7,7), 5 mM EDTA, 0,5% (p/v) SDS, 100 mg/mL de distorcido e desnaturado DNA de esperma de arenque e 5 x Denhardt &#39; s solução (100 x Denhardt &#39; solução s = 2% albumina de soro bovino, 2% e 2% polivinilpirrolidona 40 Ficoll)).</li>
	<li>Pre-cruzar a membrana no buffer para 1h rodar a sonda de 42 ° C. Adicionar 30 pmol radioativo oligo-DNA 5 &#39; - final - rotulado com 32 P (preparado como descrito por Sambrook et al. 23) Nota: cuidado, as emissões de alta energia beta de 32 P podem apresentar uma pele substancial e risco de dose de olho. Precaução adequada deve ser tomada quando usar 32 P. Radioactive resíduos deve ser eliminado de acordo com os protocolos de segurança institucionais adequadas.</li>
	<li>Incubar a sonda com a membrana de giro durante a noite no 42 ° C. remover a sonda com uma pipeta descartável 10ml. 
	Nota: Se armazenado em um freezer a sonda pode ser reutilizada.</li>
	<li>No tubo de hibridização, lave a membrana logo em 50 mL de 0,3 M NaCl, citrato de sódio de 30 mM, SDS 0,1% (p/v) à temperatura ambiente. 
	Nota: Esta primeira lavagem contém muito desvinculado da sonda e devem ser tratada como altamente radioactivos.</li>
	<li>Repeat passo 9.4 uma vez e, em seguida, move a membrana para um recipiente de plástico liso ou bandeja incluindo uma tampa. Cobrir a membrana com a solução de lavagem (0,3 M NaCl, 30mm citrato de sódio, 0,1% (p/v) SDS) e ele incube durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Alterar a solução de lavagem e continue a lavar até um sinal / ruído satisfatório foi obtido (geralmente 3-4 alterações de solução de lavagem). Use um tubo de Geiger-Müller para detectar como o barulho de relação sinal muda medindo a radiação de uma área vazia da membrana e compará-lo com a área onde a sonda tem hibridizado especificamente para tRNA.</li>
	<li>a fim de ser capaz de retirar a sonda da membrana após a exposição, certifique-se que (importante) a membrana não secar antes do processo de descascamento. Coloca a membrana em um saco plástico fino ou envoltório firmemente usando plástico enrole e selá-lo para ser hermético por soldadura ou fita. Coloque a membrana selada em uma tela de phosphorimaging. 
	Nota: O tempo de exposição exigido na tela de phosphorimaging é determinada pela atividade específica da sonda, a quantidade de RNA sondou for e a eficiência de hibridização da sonda e pode variam muito; de alguns minutos a vários dias. Com a experiência, a intensidade da radiação detectada na membrana com o tubo de Geiger-Müller dá uma indicação boa parte do tempo de exposição necessário. Para a quantificação confiável, é importante que a tela não é superexposta.</li>
	<li>Scan phosphorimaging tela usando um scanner a laser e salve o arquivo em &#34; .gel &#34; formato. 
	Nota: Um sinal elevado à relação de ruído é necessário para a quantificação confiável. Sondagem para um tRNA deve resultar em duas bandas; aminoacylated contendo um tRNA (migração mais lenta) e deacylated contendo um tRNA (migração mais rápida). Consulte a Figura 2.</li>
</ol> 10. Descascamento da membrana Nota: antes da membrana pode ser vasculhados a procura de um outro tRNA, a sonda anterior primeiro deve ser removida pelo descascamento da membrana.
<ol><li>Calor suficiente descascamento buffer (15 mM NaCl, 1,5 mM citrato de sódio, 0,1% (p/v) SDS) para cobrir a membrana e despeje-o sobre a membrana. -Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita o passo 10.1 até nenhuma radiação pode ser detectado com um tubo de Geiger-Müller; a membrana pode agora ser re-hibridizada seguindo as etapas descritas na seção 9.</li>
</ol> 11. Quantificar o tRNA e níveis de carregamento software de <ol><li>carregar o arquivo .gel para a imagem (consulte a Tabela de materiais). Desenhar uma linha vertical ao longo de cada uma das pistas amostra de tal forma que abrange a maioria da largura da faixa, mas exclui as bordas das bandas onde o sinal pode ser desigual, como mostrado na Figura 3A.</li>
	<li>Visualize conta de cada raia clicando &#34; análise &#34;-&#62; &#34; criar gráfico &#34;. Definir manualmente os dois picos que representa a carga e o tRNA descarregado de cada raia, conforme mostrado na Figura 3B.</li>
	<li>Obter a contagem de cada pico clicando &#34; análise &#34;-&#62; &#34; relatório de área &#34; e gravar a área sob cada um dos dois picos.</li>
	<li>Quando o blot tem sido vasculhados a procura de tRNA selC e pelo menos um tRNA de interesse, normalizar os níveis do tRNA de interesse para tRNA selC.
	<ol><li>Calcular a proporção de tRNA provenientes da espiga-em células em cada pista e subtrair o total de sinal em lane usando a equação: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq3.jpg" /> Nota: aqui, Amostra de tRNA = o sinal obtido de uma única faixa de uma membrana sondada para o tRNA desejado; Amostra selC = o sinal obtido a partir da mesma pista da mesma membrana vasculhados a procura de tRNA selC; Ref tRNA = o sinal obtido a partir da pista contendo RNA só espiga-na célula da mesma membrana sondada para o tRNA desejado; Ref selC = o sinal obtido a partir da pista contendo RNA só espiga-na célula da mesma membrana vasculhados a procura de tRNA selC.</li>
		<li>Para normalizar, divida o valor corrigido do tRNA de cada raia pelo sinal selC tRNA do pista mesmo. 
		Nota: A contribuição para o sinal da selC tRNA de células amostradas é negligenciável (consulte a Figura 2, lane rotulado &#34;-selC &#34;).</li>
	</ol></li> <li>Calcular o tRNA carregamento de nível para cada pista dividindo-se o sinal do pico representando tRNA carregada com a soma do sinal de dois picos (carregada + descarregado).</li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve como simultaneamente, medir o nível de carga de específico de e. coli tRNAs e comparar os níveis relativos dos tRNAs em amostras diferentes. Os pontos críticos do protocolo são 1) para manipular as amostras de tal forma que os níveis de carga celular tRNA são retidos, 2) para normalizar as quantidades de tRNA de tal forma que níveis de tRNA relativo em amostras diferentes podem ser comparados confiantemente e 3) para garantir a sp ecificity dos testes selecionados para os tRNAs de interes...

A seguir, apresentamos um método para quantificar os tRNAs específicas e níveis de medição de sua carga pela mancha do Norte. O método é baseado em uma técnica desenvolvida por Vieira et al . 1. colheita de células em ácido tricloroacético (TCA) e mantendo as amostras a 0 ° C em toda a purificação de RNA, a ligação éster entre o tRNA e o aminoácido é conservada2,3,4. TRNAs Aminoacylated distingue suas contrapartes nonacylated por eletroforese em gel e mancha do Norte, devido a uma diminuição da mobilidade do aminoacylated tRNA no gel, causado por aminoácido covalentemente ligados5. Além disso, apresentamos um protocolo para normalizar as quantidades de tRNA por adição de pico-em células superexpressão do usados raramente tRNAselC 4.
os tRNAs são algumas das moléculas mais abundantes na célula bacteriana e uma parte absolutamente vital da maquinaria de tradução. os tRNAs vincular aminoácidos e transferi-los para os traduzir ribossomas. A ligação dos aminoácidos para tRNAs (aminoacylation ou carregamento) é facilitada pela aminoacil sintetases de tRNA. A abundância relativa de diferentes tRNAs carregada é importante para garantir a fidelidade da síntese de proteínas, porque sub-representação do cognato acusado que tRNA para um codão de determinado RNA mensageiro (mRNA) aumenta a probabilidade de que um tRNA perto-cognato serão erroneamente entrega seu aminoácido à cadeia de polipeptídeo crescente no Ribossoma6. A importância do tRNA carregada é refletida na extensa resposta da célula de e. coli para uma severa queda nos níveis de carregamento de um tRNA; a resposta rigorosa. Durante a resposta rigorosa a síntese dos tRNAs, RNAs ribossomal e maioria dos mRNAs é abaixada em favor de transcrição de mRNAs específicos associados a sobrevivência de biossíntese e estresse de aminoácido, e a taxa de crescimento das células é reduzida drasticamente7 . Além disso, o recente trabalho de nos revelou que a Escherichia coli ativamente degrada a maioria dos seus tRNA em resposta ao estresse que limitam a tradução4,8, sugerindo que o ajuste dos níveis de tRNA pode ser importante para lidar com tais tensões. Assim, medições correctas de abundâncias de tRNA e níveis de carregamento será uma ferramenta importante para compreender plenamente a respostas bacterianas do stress.
Escherichia coli é comumente usado para expressar a proteína recombinante e devido às diferenças no uso do códon entre espécies, expressão de qualidade inferior é um problema muitas vezes enfrentado9. Isto pode ser contornado pela expressão de tRNAs adicionais necessários para traduzir o mRNA recombinante10. Medições do tRNA níveis em tais cepas de carregamento poderiam orientar os esforços de solução de problemas e ajudar a aperfeiçoar a expressão de proteínas.
Este método também permite a detecção de "mischarging"; um aminoacylated da molécula de tRNA com um aminoácido não-cognato. Aminoacylation por aminoácidos diferentes pode causar um tRNA migrar com velocidades ligeiramente diferentes através de géis de poliacrilamida1,11. Em alguns casos, o método também pode ser usado para distinguir padrões diferentes de modificação em idênticas tRNAs3.
Outro estabelecido procedimento bioquímico para a investigação do tRNA níveis de carregamento é periodato de oxidação. O método baseia-se na observação de que a aminoacylated-tRNA é protegido de periodato de oxidação e tRNA descarregado não é. Depois periodato tratamento de oxidação a recarga do tRNA é usada para estimar os níveis de carga do RNA colhido. No entanto, a recarga de vários tRNAs foi mostrado para ser afetado pelo tratamento proporcionando alguma imprecisão12. O método apresentado aqui medidas de carregamento diretamente do RNA purificado, excluindo assim qualquer preconceitos de reações químicas ou enzimáticas. Uma limitação deste método é que apenas uma espécie de tRNA é detectado em um momento, então, embora a mesma Northern blot pode ser descascado e reprobed de vários tRNAs, é demorado e um tanto trabalhoso coletar dados sobre muitos tRNAs.
Uma maneira confiável de normalizar as amostras para o outro é vital em estudos onde o objetivo é comparar os níveis relativos de uma molécula através de amostras diferentes. Aqui apresentamos um procedimento de normalização para o RNA, onde uma pequena alíquota de células de Escherichia coli superexpressão do tRNA raroselC é adicionada como um pico em que todas as amostras experimentais antes da purificação de RNA. Este método é útil não só ao examinar os tRNAs mas para quantificação relativa de qualquer espécie de RNA quando a instalação experimental é tal que nenhum RNA endógena pode ser confiável para ser apresenta na mesma concentração celular em todas as amostras. Por exemplo, o nível de um "housekeeping" como RNA ribossómico (ARNR) muitas vezes é usado como uma referência endógena para comparar as quantidades relativas de outro RNA entre diferentes amostras de13. Mas isso é de pouca utilidade se a concentração celular do RNA referência varia entre amostras, como pode ser o caso para o RNA ribossômico se amostragem ocorre durante um esforço resposta15,16,17 ou durante entrada em fase estacionária17. A adição de pico-em células com as amostras experimentais antes da purificação de RNA fornece uma forma sólida e precisa de normalização independente da instalação do amostragem. Outra forma de padronização é a adição de um ou mais pico-em RNAs para as amostras experimentais após a purificação de RNA. No entanto, este método não leva em conta diferenças eventuais na recuperação de RNA entre as amostras.
Usando células de Escherichia coli que overexpress a referência de RNA como spike-em células (ver Figura 1) em um experimento em e. coli tem a desvantagem de que resulta além de uma pequena quantidade de exógenos Escherichia coli total RNA para a amostras. Podemos corrigir para este acréscimo através da análise de uma amostra contendo somente spike-em células em paralelo com as amostras experimentais (ver o norte borre na pista Figura 2, , rotulada "selC"). O protocolo apresentado é desenvolvido para Escherichia coli K-12, mas é provável que seja aplicável para a maioria das espécies bacterianas.

<table><tbody><tr><td>Uréia</td><td>Merck</td><td>57-13-6</td><td>Pureza >99%</td></tr> <tr><td>Poliacrilamida</td><td>Serva</td><td>79-06-7</td><td></td></tr><tr><td>Bis (N, N'-Metileno-bis-acrilamida)</td> <td>BIO-RAD</td><td>161-0201</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético (TCA)</td> <td>Sigma</td><td>76-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Merck</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetato</td><td></td><td></td><td></td>de</tr> <tr><td>Sódio e Glicose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td><td></td><td></td><td></td>clorídrico</tr><tr><td>Cloreto</td><td></td><td></td><td></td>de Sódio</tr><tr><td>NaH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma</td> 100403-24-5 BSA Polivinilpirrolidona Ficoll P32 do esperma do arenque do SDS do citrato <td></td><td></td><td></td>de sódio</tr><tr><td></td><td></td><td></td> &gamma;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA oligos (sondas)</td> <td>TAG Copenhagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybond N+ membrana</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroblotter</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>Forno</td> de Hidretização de Espectrofotômetro <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Geiger-M&uuml;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td>tubo ller</tr><tr><td>Tela de imagem de fósforo</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr>Tubo <td></td><td></td><td></td><td>de hibridização</td></tr><tr><td>Frascos</td><td></td><td></td><td></td>de cultura</tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml Tubos</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td>de<td>centrífuga de 20 ml</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação de abundância e carregamento níveis de rnas de transferência em escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

RNA de transferência (tRNA) é uma parte essencial da maquinaria translacional em qualquer organismo. os tRNAs bind e transferir os aminoácidos para o ribossoma traduzir. Os níveis relativos de tRNAs diferentes e a relação de aminoacylated tRNA para total tRNA, conhecido como o nível de carga, são fatores importantes na determinação da precisão e velocidade de tradução. Portanto, a abundância e níveis de carga dos tRNAs são variáveis importantes para medir quando estudar a síntese de proteínas, por exemplo, sob diferentes condições de estresse. Aqui, descrevemos um método para a colheita de tRNA e medição diretamente tanto a abundância relativa e o nível de carregamento absoluto de espécies específicas de tRNA em Escherichia coli. O tRNA é colhida de forma que o laço lábil entre o tRNA e o aminoácido é preservado. O RNA é então submetido a electroforese do gel e do Norte, mancha, que resulta em separação entre os tRNAs carregado e descarregado. Os níveis de tRNAs específico em amostras diferentes podem ser comparados devido à adição de pico-em células para normalização. Antes da purificação de RNA, adicionar 5% de células de Escherichia coli que overproduce o tRNA raroselC para cada amostra. A quantidade de espécies de interesse em uma amostra de tRNA então é normalizada para a quantidade de tRNAselC na mesma amostra. Adição de pico-em células antes da purificação de RNA tem a vantagem sobre a adição de purificado spike-em RNAs que é também responsável por eventuais diferenças de eficiência de lise celular entre as amostras.

Usar o procedimento descrito aqui, a abundância e cobrando os níveis dos três tRNAs foram medidos em Escherichia coli K-12 antes e durante a fome de aminoácidos.
O auxotroph de arginina estirpe NF9154 (thr leu sua argH thi mtl supE44) foi cultivada pelo menos dez gerações em MOPS mínimo suplementado com 0,4% de glicerol, 50 treonina µ g/mL, leucina, arginina e histidina 5 µ g/mL a 37 ° C...

Aqui nós apresentamos um método para medir diretamente o RNA de transferência, níveis de carga de purificado Escherichia coli RNA, bem como uma maneira de comparar os níveis relativos do RNA de transferência, ou qualquer outro RNA curto, entre diferentes amostras baseadas na adição de pico-no células expressando um gene de referência.

Quantificação de abundância e carregamento níveis de RNAs de transferência em Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

O objetivo geral deste experimento é quantificar a abundância e os níveis de carga de RNAs de transferência em Escherichia coli. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia celular, como como os níveis de carga de tRNA mudam em diferentes estados de crescimento. A principal vantagem deste método é que os níveis de RNA podem ser comparados quantitativamente mesmo entre estados de crescimento que alteram drasticamente a composição do RNA nas células.Comece este experimento cultivando culturas experimentais e de E.coli de acordo com o protocolo de texto. Aumente a cultura spike-in a 37 graus Celsius, enquanto agita a 160 RPM. Quando a cultura spike-in atingir um OD436 de cerca de 0,1, induza a expressão da célula C do tRNA adicionando IPTG.Cultive a cultura até atingir um OD436 de cerca de 0,5. Em seguida, mova a cultura para o gelo até que todas as amostras tenham sido colhidas. Depois disso, pré-aqueça um frasco de cultura com tampa de 100 mililitros contendo quatro mililitros de 10% de TCA para cada amostra em banho-maria a 37 graus Celsius.Meça e registre o OD436 das culturas experimentais diretamente antes da colheita das células. Em seguida, transfira quatro mililitros de cultura para um frasco contendo TCA pré-aquecido. Misture a amostra manualmente, girando o frasco por cinco segundos, o que desativará imediatamente todas as atividades enzimáticas, preservando os níveis de carga dos tRNAs.Quando todas as amostras tiverem sido coletadas, adicione 5% de células de pico a cada amostra. Preparar também uma amostra de controlo constituída apenas por células spike-in, conforme descrito no protocolo de texto. Para iniciar a extração de RNA, despeje oito mililitros de cada amostra, incluindo controles, em um tubo de centrífuga resfriado a gelo.Centrifugue as amostras a 9.500 x G a quatro graus Celsius por 10 minutos. Depois de remover completamente o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 0,3 mililitros de acetato de sódio frio, contendo 10 mililimolares de EDTA. Transfira cada amostra para um tubo de microcentrífuga frio de 1,5 mililitro e adicione 0,3 mililitros de fenol equilibrado com o tampão, usado para ressuspender o pellet.Em seguida, vórtice cada amostra 10 vezes por 15 segundos de cada vez. Com pelo menos um minuto a zero grau Celsius entre cada vórtice, para manter as amostras frias. Em seguida, centrifugar as amostras a 20 000 x G a quatro graus Celsius durante 15 minutos.Transfira a face superior ou de água para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 0,3 mililitros de fenol frio à face da água e vortex as amostras quatro vezes 15 segundos cada, conforme descrito anteriormente. Em seguida, centrifugar as amostras a 20 000 x G a quatro graus Celsius durante 10 minutos.Transfira a face da água para um novo tubo de microcentrífuga frio de 1,5 mililitro e adicione 2,5 volumes de etanol frio a 96%. Em seguida, incube os tubos a 20 graus Celsius por uma hora para precipitar o RNA. Centrifugar as amostras a 20 000 x G a quatro graus Celsius durante 30 minutos.Depois de remover o sobrenadante, adicione cuidadosamente um mililitro de etanol frio a 70% ao pellet de RNA, tomando cuidado para não perturbá-lo. Inverta o tubo suavemente uma vez, para lavá-lo com etanol. Finalmente, centrifugue a 20.000 x G a quatro graus Celsius por 10 minutos.Remova o sobrenadante completamente e seque o pellet ao ar até que o etanol seja completamente removido. A 20 microlitros de acetato de sódio frio contendo 1 EDTA milimolar, vórtice vigorosamente para ressuspender o pellet. Para iniciar a eletroforese, misture quatro microlitros de cada amostra com seis microlitros de tampão de carga.Carregue as amostras, incluindo os controles, em um gel de poliacrilamida 6,5 de 0,4 milímetro de espessura contendo oito molares ureais e 0,1 molar tampão acetato de sódio. Em seguida, separe o RNA executando a eletroforese a 10 volts por centímetro de gel a quatro graus Celsius por aproximadamente 20 horas até que o corante azul de bromofenol atinja o fundo do gel. Separe cuidadosamente as duas placas de vidro para que o gel permaneça em uma delas.Use a área de gel do corante xileno cianol e 20 centímetros para baixo em direção ao corante bromofenol para borrar. Corte um pedaço fino de papel de filtro no tamanho da área de mata-borrão desejada. Coloque o papel de filtro em cima da parte do gel que será usada para o borrão.Corte e descarte as partes do gel não cobertas com papel de filtro. Em seguida, use o papel de filtro para retirar cuidadosamente o gel da placa de vidro. Coloque uma membrana de náilon carregada positivamente em cima do gel e limpe-a em tampão de transferência a 20 volts por 90 minutos.Termine reticulando o RNA com a membrana usando luz ultravioleta. Em seguida, coloque a membrana reticulada em um tubo de hibridização e adicione seis mililitros de solução de hibridização. Gire o tubo a 42 graus Celsius por uma hora para pré-hibridizar a membrana.Em seguida, adicione a sonda de oligo DNA radioativo molar de 30 picos, cinco primos e marcados com P32. Gire para incubar a membrana com a sonda a 42 graus Celsius durante a noite. Após a incubação, use uma pipeta descartável de 10 mililitros para remover a sonda.Em seguida, lave rapidamente a membrana duas vezes no tubo de hibridização, em 15 mililitros de solução de lavagem em temperatura ambiente. Mova a membrana para um recipiente de plástico plano, cubra-o com a solução de lavagem e feche a tampa. Incube a membrana em um agitador em temperatura ambiente por 30 minutos.Troque a solução e continue lavando até obter uma relação sinal-ruído satisfatória. Use um tubo geiger muller para obter a relação sinal-ruído, comparando a radiação da área onde a sonda hibridizou com o tRNA, com a radiação de uma área vazia. Depois disso, enrole a membrana firmemente em filme plástico e feche-a hermeticamente por soldagem.Coloque esta membrana em uma tela de fosforografia. Após um tempo de exposição adequado, escaneie a tela usando um scanner a laser e salve o arquivo em formato de gel. Em seguida, carregue o gel file no software de imagem.Desenhe uma linha vertical ao longo de cada uma das faixas de amostra para que ela abranja a maior parte da largura da pista, excluindo as bordas das faixas onde o sinal pode ser irregular. Para visualizar as contagens de cada raia, clique em análise e, em seguida, crie um gráfico. Defina manualmente os dois picos que representam o tRNA carregado e o não carregado de cada pista.Depois disso, clique em análise e, em seguida, relatório de área para obter contagens de cada pico. Finalmente, registre a área sob cada um dos dois picos. Calcule os níveis de tRNA conforme descrito no protocolo de texto.Este método foi usado para medir a abundância de vários tRNAs e E.Coli nf915 antes e durante nossa fome de arginina. No gráfico norte hibridizado com diferentes sondas de tRNA, há uma separação clara entre as bandas que representam o tRNA de carga e as bandas que representam o tRNA não carregado. O perfil de radiação ao longo de cada faixa foi obtido a partir das manchas do norte usando um software de imagem.O sinal de radiação de cada pista foi quantificado isolando-se cada uma do blot. Um gráfico que representa a quantificação do sinal de uma única pista mostra dois picos. O pico esquerdo vem do tRNA aminoacilado e o direito do tRNA desacilado.A área sob cada pico é exportada para análise posterior. A quantificação das bandas do northern blot mostra que a abundância relativa de todas as espécies de tRNA testadas diminuiu rápida e significativamente durante a falta de aminoácidos. Por outro lado, os níveis de carga de tRNA da arginina aceitando tRNA caíram rapidamente após a remoção da arginina e aumentaram ligeiramente durante o período de fome.No entanto, os níveis de carga dos outros tRNAs aumentaram ligeiramente após a fome e depois diminuíram para níveis quase pré-fome. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar o RNA de forma que a carga e a abundância de tRNA possam ser quantificadas e como usar células spike-in para normalização. Ao longo deste procedimento, é importante lembrar de manter o RNA frio e ácido para evitar a hidrólise do RNA.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Nós descrevemos um método para análise de microarray para determinar os níveis aminoacylation relação de todos os tRNAs...

Análise do genoma de Aminoacylation (carregamento) Níveis de tRNA Usando Microarrays

Fonte: Stenum, T. S., et al. Quantificação da abundância e dos níveis de carga dos RNAs de transferência em Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra o uso da eletroforese em gel e do blot do norte para detectar e comparar os níveis de carga dos RNAs de transferência em E. coli , separando formas aminoaciladas e desaciladas.

Eletroforese em gel e Northern Blotting para detectar níveis de carga de tRNA em E. coli

Estudos de biomoléculas in vivo são cruciais para a compreensão da função molecular em um contexto biológico. Aqui descrevemos um novo método que permite a internalização de biomoléculas fluorescentes, como DNA ou proteínas, em microrganismos vivos. A análise de dados in vivo registrados por microscopia de fluorescência também é apresentada e discutida.

Internalização e Observação de Fluorescent Biomoléculas em microorganismos vivos via Eletroporação

Aqui, o poder de uma inserção aleatória de um elemento de DNA não-codificante, mediada por transposon foi usado para resolver a sua posição ideal cromossômica.

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Este manuscrito descreve um método para a rotulagem individual RNA mensageiro (mRNA) transcrições com fluorescente-etiquetadas sondas de DNA, para uso em único-molécula fluorescência em situ (smFISH) as experiências de hibridação em e. coli. smFISH é um método de visualização que permite a deteção simultânea, localização e quantificação de simples moléculas de mRNA em células individuais fixas.

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Neste método, nós quantificamos a afinidade obrigatória de proteínas de ligação do RNA (rbps) aos locais de ligação cognato e non-cognato usando um simples, vivo, ensaio do repórter em pilhas bacterianas. O ensaio é baseado na repressão de um gene repórter.

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Este protocolo descreve uma aplicação de fluorescência de molécula única na hibridização situ (smFISH) para medir a cinética in vivo da síntese e degradação do mRNA.

Sondando cinética mRNA no espaço e no tempo em Escherichia coli usando fluorescência de molécula única de duas cores na hibridização situ

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Purificação de Afinidade MS2 juntamente com sequenciamento de RNA em bactérias gram-positivas

O sequenciamento de RNA de quantificação absoluta (AQRNA-seq) é uma tecnologia desenvolvida para quantificar a paisagem de todos os pequenos RNAs em misturas biológicas. Aqui, as etapas de preparação da biblioteca e processamento de dados do AQRNA-seq são demonstradas, quantificando as mudanças no pool de RNA de transferência (tRNA) em Mycobacterium bovis BCG durante a dormência induzida por fome.

AQRNA-seq para quantificar RNAs pequenos

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Colonização com Escherichia coli de Murine pks+ Escherichia coli sob condições não inflamatórias

Aprenda a quantificar níveis de carregamento de RNAs de transferência em Escherichia coli usando células spike-in para normalização. Este método permite comparar abundância de tRNA entre diferentes estados de crescimento celular.

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