Name: Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a usar microirradiação a laser para induzir danos simples e complexos no DNA e estudar sinalização celular e recrutamento de fatores de reparo em células vivas.

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Agradecemos o Dr. Akira Yasui na Universidade de Tohoku, Japão para o plasmídeo de expressão de GFP-NTH1 e Dr. Eros Lazzerini Denchi no Scripps Research Institute, La Jolla, Califórnia para o TRF2-YFP e EGFP-53BP11220-1711 plasmídeo de expressão. Este trabalho foi financiado pelo escritório da força aérea de investigação científica (FA9550-04-1-0101) e o Instituto de Laser Beckman Foundation Inc. (para M.W.B), a Ford Foundation Fellowship da Academia Nacional de Ciências (para B.A.S) e NSF MCB-1615701 e CRCC CRR-17-426665 (para K. Y.).

Os autores não têm nada para divulgar.

As vantagens do uso do laser microirradiation para pesquisa DDR são:
1. é viável para induzir diferentes tipos e quantidades de DNA danos de quebras simples ao complexo dano do ADN, e para detectar fatores diferentes reparo no DNA danificar sites ajustando os parâmetros de irradiação do laser. Também é possível causar danos várias vezes no mesmo núcleo celular a fim de avaliar os efeitos de trans (conforme Figura 3).
2. importa...

Na Vivo Sinalização de dano do ADN não é bem compreendido. In vivo, o DNA é complexed com histonas e outros fatores para fibras de cromatina de forma. Regulamento da estrutura da cromatina é de suma importância para o metabolismo do DNA. Por exemplo, a variante de histona H2AX é fosforilada por ataxia-telangiectasia mutado (ATM) e outras cinases seguintes da dobro-Costa quebra indução (DSB) e é importante para a amplificação de sinal DSB danos, bem como fornecendo um site encaixe para outro fatores. Propagação de escolha de caminho de sinalização e reparação de danos aparecem criticamente ser influenciada pela estrutura da cromatina local em danos locais1. Um número de cromatina remodelação fatores acompanhantes de histona e histona modificando as enzimas na verdade são recrutados para danificar sites e são importante para o reparo de DNA eficiente, destacando a importância do Regulamento de cromatina no DDR e reparar2 , 3 , 4. Além disso, site de danos de cluster ou reposicionamento foi observada em levedura e drosófila5,6,7,8, uma reminiscência do relocalization dos loci de gene na compartimento de fracoes associado gene Regulamento9,10. Estudos recentes no rato e células humanas também revelaram a mobilização dos sites DSB, que influências reparar fidelidade e caminho escolha11,12. Isto levanta a possibilidade que DDR/reparação pode também ser intimamente ligada à arquitetura nuclear, organização de ordem superior da cromatina e cromossomo dinâmica no núcleo celular. Assim, é fundamental para desenvolver métodos de alta resolução para estudar DDR e processos no contexto do ambiente endógeno nuclear em uma célula viva de reparação a fim de compreender as consequências de curto e longo prazo de dano do ADN.
Papel crítico de PAR polimerase (PARP) para medir a extensão e o tipo de dano e regulamenta o Assembly de proteína no local do dano PARP1 é um sensor de ADN nick rapidamente ativado por dano do ADN que desempenha um papel crítico no reparo de ADN13. PARP1 foi pensado originalmente para funcionar em conjunto com o x-ray reparação Cruz complementando 1 (XRCC1) para facilitar o reparo de excisão de base (BER), mas estudos recentes revelam seu papel em outras vias de reparo do DNA, incluindo ORL reparação14. Ativado PARP1 usos nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) como um substrato para ADP-ribosylate várias proteínas alvo, incluindo ele mesmo. Esta enzima e outros membros da família têm atraído muita atenção nos últimos anos como inibidores da PARP surgiram drogas terapêuticas tão promissoras para cancros. Embora inibidores da PARP inicialmente foram encontrados para ser eficaz no gene do cancro da mama (BRCA)-uma mutação de células de câncer de mama, existe agora uma pletora de evidências para seus efeitos em terapias de combinação e mono - juntamente com DNA prejudicial agentes/irradiação contra um amplo espectro de cancros com mutações, que não se limitando a BRCA15,16,17,18,19,20.
A nível molecular, ativação de PARP mostrou desempenham um papel crítico na organização da estrutura da cromatina local em sites de danos. Recrutamento de PAR-dependente de enzimas de modificação de cromatina facilita a reparação de ORL e ditames reparar escolhas de caminho, sugerindo o papel de andaimes importantes de modificação do PAR em locais de dano. 13,21,22,23,24,25,26,,27,28,29, 30,31 recentemente Demonstramos a exclusão da proteína p53-1 (53BP1) de dano sites por PAR 32, fornecendo uma explicação alternativa para dependentes de 53BP1 hyperactivation de endjoining não-homóloga ( NHEJ) por PARP inibidor e destacando a importância do PARP em ORL reparação via escolha33,34. PARP1 também diretamente PARylates e afeta a atividade da DNA vários reparos fatores14.
Usando o Laser Microirradiation como uma ferramenta para estudar a DDR/reparação na Vivo Microirradiation do laser para produzir alterações sub mícron em cromossomos individuais foi primeiro descrita em 196935 e revisado em detalhes em 198136. Várias décadas mais tarde, microirradiation do laser foi mostrado para induzir dano de DNA em uma região submicrometer definido no núcleo celular e foi provado para ser uma técnica valiosa para o estudo de recrutamento ou modificações de vários fatores de lesões do ADN em vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. este método permite a detecção desses factores que não formam distintos focos induzida por irradiação (IRIF) em danos sites39,42. Também é possível examinar a spatiotemporal dinâmica de alterações estruturais da cromatina em sítios de dano e no resto do núcleo. Comparamos com cuidado os DDRs induzidas por sistemas diferentes de laser e poderes para avaliar a relação entre o tipo de dano do ADN e o microirradiation condições32,,43,44, de entrada 45. Os padrões de recrutamento aberrante de 53BP1 e oligospermia repetir fator obrigatório 2 (TRF2) foram observados nos estudos anteriores de dano do laser, que forneceram a base para a recorrente preocupação com a natureza "não-fisiológica" de dano induzido por laser46 ,,47,,48,49. Nós achamos que estas aparentes discrepâncias agora poderiam ser explicadas pelo diferencial PARP sinalizando que mede a quantidade e a complexidade do dano induzido32. Nós confirmamos que: 1) do laser-microirradiated células (mesmo após irradiação de entrada-potência alta) são presos em interfase, de uma forma de controle-dependente de ponto de verificação de danos e permanecem viáveis (pelo menos até 48 h)32,,50; e 2) reparação fator recrutamento/modificações fielmente recapitular aqueles observados com tratamento com agentes prejudiciais de DNA convencionais e indução de ORL por endonucleases32,39,42, 44,50,,51,52. Estes resultados suportam fortemente a relevância fisiológica de estudar a resposta celular induzida por danos de laser.

<table><tbody><tr><td>Ti: Laser de femtossegundo pulsado NIR de safira Mira-900</td><td>Coherent Inc.</td><td>Microscópio invertido Mira 900</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Objetiva Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>63X/1.4 NA</td><td>Zeiss</td><td>APOCHROMAT Ph3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Platina de Rotação Compacta&nbsp;</td>Controlador de Temperatura <td>Newport Corp</td><td>PR50PP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Warner</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema</td><td>de Aquecimento Ibidi&nbsp;</td>Sistema de Incubação de Gás <td>10918</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ibidi;</td>Medidor de Energia e Potência a Laser <td>11920</td><td></td></tr><tr><td>(RoHS)</td><td>Campo</td><td>CoerenteMaxII-TOP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Câmera Digital CCD ORCA-R2</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 META Microscópios de Varredura a Laser</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X/1.3 NA Zeiss Plan APO</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm Pratos em Grade&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD-D</td><td></td></tr><tr><td>PtK2 células epiteliais renais</td><td>ATCC</td><td>CCL 56&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Células HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Meio Independente de CO2&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>MEM Avançado&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12492-013</td><td>suplementado com L-Glutamina, 4% de</td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td> FBS <td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Timidina&nbsp;</td><td>&nbsp; SIGMA</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>serum free media&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Opti-MEM I Meio de Soro Reduzido)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cycolbutance dímero de pirimidina (CPD) (camundongo)</td><td>Kamiya Biomedical Company</td><td>MC-062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-XRCC1 (camundongo)</td> <td>Gene Tex Inc</td><td>GTX72311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-53BP1 (coelho)</td> <td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-22760</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CtIP (coelho)</td> <td>Abcam</td><td>ab70163</td><td></td></tr><tr><td>Polímeros anti-PAR (camundongo)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-SA216-0100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR (coelho)</td><td>Trevigen</td><td>4336-BPC-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRF2 (mouse)</td><td>Novus Biological&nbsp;</td><td>NB100-56506</td><td></td></tr><tr><td>Anti 6-4PP (mouse)</td><td>Kamiya Biomedical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad21 (Coelho)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (para detecção de coesina)</td>gerado no laboratório <td></td><td></td><td>Yokomori (KY)</td></tr><tr><td>Anti-Rad51 (Coelho)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8349</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ku70 (mouse)</td><td>&nbsp; Novus Biologicals</td><td>NB100-102</td><td></td></tr><tr><td>8-oxiguanina&nbsp;</td><td>Trevigen, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-PARP1&nbsp; (Coelho)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>gerado no laboratório</td><td></td> KY <td>ref 43</td></tr><tr><td>&nbsp; Anti-hCAPG (Coelho)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (para detecção de condensina)</td><td>gerado em laboratório</td><td></td> KY <td>ref 42</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>&nbsp; Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>HiPerFect siRNA Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>GFP-SMC1 linha celular estável&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>gerado no laboratório</td><td></td> KY <td>ref 49&nbsp;</td></tr><tr><td>Linha celular estável GFP-NEIL2</td><td>gerada em laboratório</td><td></td> KY <td>ref 54</td></tr><tr><td>Linha celular estável GFP-NTH1</td><td>gerada em laboratório</td><td></td> KY <td>ref 32</td></tr><tr><td>Plasmídeo GFP-SMC1</td><td>gerado em laboratório</td><td></td><td></td>KY</tr><tr><td>Plasmídeo GFP-Ku</td><td>gerado em laboratório</td><td></td><td></td>KY</tr><tr><td>Anti-MDC1 (coelho)</td><td>&nbsp; Novus Biologicals</td><td>NB100&ndash; 395</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gH2AX (coelho)</td><td>&nbsp; Millipore</td><td>07&ndash; 164</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-53BP1(1220-1711) Linha celular estável PtK2</td><td>gerada em Berns lab</td><td></td><td>ref 32</td></tr><tr><td>TRF2-YFP PtK2 linha celular estável</td><td>gerada em Berns lab</td><td></td><td>ref 32</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>inibidor de PARG</td><td>Trevigen</td><td>4680-096-03</td><td></td></tr><tr><td>DNA&ndash; Inibidor de PKcs&nbsp; NU7026&nbsp;</td><td>Inibidor</td> de ATM Sigma <td>N1537</td><td></td></tr><tr><td>KU55933</td><td>&nbsp; Calbiochem</td><td>118500</td><td></td></tr><tr><td>Olaparib&nbsp;</td><td>Apexbio Technology</td><td>A4154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído&nbsp;</td><td>MICROSCOPIA ELETRÔNICA SCIENC MS</td><td>100503-916 (EA)</td><td></td></tr><tr><td>Quantidade Um Software de Análise 1-D Versão 4.6.9</td><td>Bio-Rad</td><td>SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC&nbsp;</td><td>Programa de análise de imagens</td></tr><tr><td>Excel</td><td>programa de</td><td>planilha</td>microsoft <td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>detergente</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate-buffered sally (DPBS) 10X sem cálcio e magnésio</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200166</td><td>diluir para 1X&nbsp;</td></tr></tbody></table>

laser microirradiation para estudar na vivo respostas celulares ao dano de dna simples e complexos

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Danos ao DNA induz respostas específicas de sinalização e reparação na célula, que é crítico para a proteção da integridade do genoma. Microirradiation do laser tornou-se uma valiosa ferramenta experimental para investigar o DNA danos resposta (DDR) na vivo. Permite análise de célula única de alta resolução em tempo real da dinâmica macromolecular em resposta ao dano induzida por laser, confinado a uma região de submicrometer no núcleo celular. No entanto, várias condições do laser têm sido utilizadas sem apreciação das diferenças nos tipos de danos induzidos. Como resultado, a natureza do dano é muitas vezes não bem caracterizado ou controlada, causando inconsistências aparentes nos perfis de recrutamento ou modificação. Temos demonstrado que as condições de irradiação diferentes (ou seja, diferentes comprimentos de onda bem como diferentes poderes de entrada (radiâncias) do laser femtosecond (fs) infravermelho próximo (NIR)) induziram assemblies distintos DDR e reparação de proteína. Isto reflete o tipo de dano do ADN produzido. Este protocolo descreve como titulação da potência do laser permite a indução de diferentes quantidades e complexidades de dano do ADN, que pode ser facilmente controlado por detecção de danos de base e reticulação, diferencial poli (ADP-ribose) (PAR), sinalização, e reparação de percurso específico fator módulos (assemblies) em locais de dano. Uma vez que as condições de danos são determinadas, é possível investigar os efeitos de dano diferente complexidade e sinalização diferencial danos, bem como depleção do feitor montante em qualquer fator de interesse.

Usando células PtK2 estàvel expressando EGFP-53BP11220-1711 ou TRF2-YFP, titulação de entrada de alimentação do laser foi realizada para determinar a condição ideal para o seu recrutamento (Figura 1)32.
Em locais de dano do laser de potência entrada alta, o agrupamento significativo de CPD (dano de reticulação normalmente gerado pelo dano de ultravioleta (UV)) bem como GFP-NTH1 DNA glycosylase que especificamente reconhece dano b...

O objetivo do presente protocolo é descrever como usar o microirradiation do laser para induzir diferentes tipos de danos no DNA, incluindo relativamente simples quebras e danos complexos, para estudar o DNA danos reparação e sinalização fator montagem em locais de dano in vivo .

Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

O objetivo geral deste protocolo é descrever como utilizar a microirradiação a laser para induzir diferentes tipos de danos ao DNA, incluindo quebras simples de fita e danos complexos, com o fim de estudar a sinalização de danos ao DNA e o recrutamento de fatores de reparo in vivo. Nas décadas de 1960 e 1970, focalizamos um feixe de laser através de um microscópio, que vocês podem ver atrás de mim, e conseguimos danificar uma pequena região de um cromossomo. A célula se dividiu, sobreviveu, e não conseguíamos entender o porquê.Bem, 40 anos depois, estamos agora usando este método para estudar seletivamente o reparo do DNA, e é isso que você vai ver hoje. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de reparo do DNA, como o reconhecimento e o processamento do dano ao DNA e como o sinal de dano se propaga na célula. A microirradiação com laser permite a análise em tempo real, com alta resolução e em nível de célula única, da dinâmica de macromoléculas em resposta a danos no DNA, confinados a uma região de alguns micrômetros dentro do núcleo celular.No entanto, várias condições de laser foram utilizadas sem consideração pelas diferenças nos tipos de dano induzido

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Genetics

Genética

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