Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

O objetivo geral da imagem de lapso de tempo multifóton é capturar imagens tridimensionais em tempo real de alta resolução de populações de células migratórias. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia do desenvolvimento, como mapear as vias de migração de diferentes populações de células. A principal vantagem dessa técnica em relação à microscopia confocal tradicional é que os lasers multifótons têm penetração mais profunda no tecido e menor fototoxicidade.

Isso aumenta a usabilidade em tecidos mais espessos e permite períodos mais longos de aquisição de imagens. Para preparar a coleta de embriões entre 15:00 e 21:00, monte tanques de reprodução e encha-os com osmose reversa, ou água RO.

Transfira até três fêmeas e três machos para lados opostos do tanque dividido. Na manhã seguinte, remova a divisória logo após as luzes acenderem no viveiro. Deixe o acasalamento sem perturbações por 20 minutos ou até que um número suficiente de embriões seja produzido.

Os embriões estarão no fundo do tanque de reprodução. Quando os ovos forem observados, levante o tanque interno com fenda junto com os peixes e coloque-os rapidamente em um tanque externo limpo e sólido cheio de água RO. Use uma tela de coleta de ovos para coletar os ovos do tanque externo e transfira os ovos para placas de Petri contendo 30 mililitros de meio embrionário 1X.

Incube os ovos coletados a 28,5 graus Celsius. Para embriões transgênicos, 24 horas após a fertilização ou HPF, remova os óvulos mortos e avalie o estágio de desenvolvimento dos embriões. Usando uma pinça, remova os córions de três a quatro embriões que expressam GFP.

Sob um microscópio estereoscópico de fluorescência de dissecação com um filtro de excitação passa-banda padrão de 460 a 490 nanômetros, rastreie embriões positivos para GFP. Transfira esses embriões para uma placa de Petri separada contendo 30 mililitros de meio embrionário 1X fresco. Após 20 HPF, coloque os embriões GFP positivos selecionados e descorionados em solução de 0,003% PTU para inibir a pigmentação.

Evite iniciar o tratamento mais cedo, pois pode ter efeitos adversos na crista neural e no desenvolvimento neuroepitelial. Adicione 0,4 gramas de pó de agarose LowMelt a 20mL de 1x meio embrionário. Aqueça a mistura por um a dois minutos ou até que a solução esteja límpida e todas as partículas estejam dissolvidas.

Alíquota de aproximadamente 1 mL da solução de agarose em tubos de centrífuga frescos de 1,5 mL para armazenamento. Para configurar a câmara de banho aberta, coloque uma pequena quantidade de graxa de alto vácuo na base da câmara de banho aberta. Coloque uma lamínula de vidro circular na base e aparafuse a parte superior da câmara de banho aberta na base até que esteja apertada.

Pipete aproximadamente 500-700 microlitros de solução de agarose a 2% na câmara de banho aberta até que a base esteja aproximadamente 3/4s cheia. Aguarde 30 segundos para permitir que a agarose esfrie um pouco sem polimerizar completamente e, posteriormente, transfira um único embrião para o centro da base. Sob um microscópio estéreo fluorescente, use uma ponta de micropipeta de 10 microlitros para orientar o embrião e posicione-o perto do fundo da agarose para que ele não flutue quando o meio embrionário for adicionado.

Um passo crítico é certificar-se de que o embrião está posicionado corretamente na Agarose. Nesses experimentos, orientamos o embrião lateralmente, mas o embrião também pode ser posicionado para se concentrar nas áreas dorsal e ventral. Monitore e reposicione o embrião até que a agarose se fixe.

Em seguida, use uma pipeta de transferência para encher totalmente a câmara aberta montada com meio embrionário de lapso de tempo. Depois de colocar todo o conjunto no palco do microscópio, de acordo com o protocolo de texto, use a objetiva de cinco vezes para localizar o embrião. Em seguida, eleve manualmente a platina para a posição mais alta e use o foco fino para posicionar o embrião no meio da faixa do microscópio.

Abaixe manualmente o stage e altere a objetiva de cinco tempos para a objetiva de imersão em água de 25 vezes. Levante cuidadosamente o palco para trazer o embrião de volta ao foco. No software, clique no modo XYTZ para obter várias imagens em intervalos de tempo ou T no plano XY sobre uma profundidade de Z.Use a epifluorescência ou campo claro view para encontrar a profundidade de foco na área de interesse que demarcará a pilha z.

Para esses experimentos, a borda lateral do olho é o início da pilha z. Quando focado aqui, no software, clique no botão Iniciar. Depois de focar na linha média do embrião, que é o final da pilha z, clique no botão final.

Uma etapa crítica é garantir que a etapa Z englobe a área de interesse. No nosso caso, queremos capturar a largura do olho das bordas laterais para as mediais. Clique no menu para ajustar o tempo de aquisição e a frequência de imagem.

Para uma recuperação adequada do flúor4 e sobrevivência do embrião, permita uma proporção de pelo menos um para três entre a aquisição da pilha z quando a energia do laser estiver ligada e o tempo de recuperação quando a energia do laser estiver desligada. Com o tempo apropriado para a recuperação do embrião, defina o tempo entre as pilhas z na janela designada. Em seguida, defina o período total de tempo para o experimento na janela apropriada.

Agora, ative a configuração de imagem ao vivo para fazer os ajustes finais nas configurações do laser. Ajuste as barras deslizantes de transmissão, ganho e deslocamento do laser dentro do software para otimizar a imagem de fluorescência. Além disso, ajuste a orientação do embrião conforme necessário, dependendo da duração do experimento, crescimento antecipado do embrião, etc.

Certifique-se de que a área de interesse permaneça dentro do quadro durante o experimento. Durante a aquisição de lapso de tempo, desligue a fonte de luz de epifluorescência, cubra o stage com a caixa de segurança do laser que é adequada para proteção contra a luz de fundo e pressione iniciar. Acesse a câmara de banho aberta através das portas deslizantes da caixa de segurança do laser para reabastecê-la com meio embrião de lapso de tempo a cada 8-12 horas.

Após a aquisição da imagem, abra os arquivos no software de processamento de imagem, realce a série de imagens correta. No software, escolha o menu do processo, clique em deconvolução 3D e aplique para desconvolução de cada pilha z. Importe arquivos tif individuais para o software de processamento de vídeo, selecione todos os arquivos tif e arraste-os para o editor de vídeo.

Ajuste a duração de cada imagem no vídeo para 0,1 segundos. Por fim, exporte o vídeo como um arquivo mov ou mp4. Vistos aqui por imagens de fluorescência multifóton estão os padrões de migração das células da crista neural craniana que dão origem às estruturas faciais cranianas e ao segmento anterior do olho nas linhagens transgênicas sox10: EGFP e foxd3: GFP.

Sox 10 células da crista neural positivas entre 12 e 30 hpf migram da borda do tubo neural para a região craniano-facial. As células do prosencéfalo e do mesencéfalo migram dorsal e ventralmente para o olho em desenvolvimento para povoar a mesencina periocular. Como indicado aqui, as células sox10 positivas formam o processo nasal frontal.

As células da crista neural do rombencéfalo migram ventralmente e dão origem aos arcos faríngeos. A imagem de lapso de tempo de células da crista neural foxd3 positivas entre 30 e 60 hpf mostra que essas células migraram entre a taça óptica e o ectoderma de superfície e através da fissura ocular marcada pela seta e coalesceram ao redor da lente marcada pelo asterisco formando o estroma da íris. Uma vez dominada, essa técnica do início ao fim pode ser feita em quatro dias se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de escolher embriões com grande quantidade de fluorescência. Configurar o software inicialmente pode ser um desafio, mas uma vez que os parâmetros são determinados, as alterações adicionais geralmente são mínimas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a microscopia de lapso de tempo multifóton para obter imagens de células migratórias no embrião.