Name: Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprenda a usar imagem de lapso de tempo multiphoton para visualizar em tempo real a migração das células da crista neural em embriões de peixe-zebra. Esta técnica oferece alta resolução e menor fototoxicidade.

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Os autores graças a Thomas Schilling para gentilmente gifting o peixe Tg (sox10:eGFP) e Mary Halloran para gentilmente gifting peixe Tg(foxd3:GFP) .

O protocolo aqui descrito foi realizado de acordo com as diretrizes para o tratamento humano de animais de laboratório estabelecidas pelo Comitê de Uso e Cuidados com Animais da Universidade de Michigan (UCUCA).
1. Coleta de embriões para imagens com lapso de tempo
<ol>
	<li>Entre 15h e 21h, coloque o peixe-zebra transgênico Tg(sox10:EGFP) ou Tg(foxd3:GFP) macho e fêmea adulto em um tanque de reprodução dividido para acasalamento em pares. 
	NOTA: Os peixes Tg (sox10: EGFP) e Tg (foxd3: GFP), presentes gentis de Thomas Schilling e Mary Halloran, respectivamente, foram cruzados para o fundo Casper (roy -/-, nácar -/-) para diminuir a autofluorescência e interferência na pigmentação.
	<ol>
		<li>Monte o tanque de reprodução (tanque interno com fenda + tanque externo sólido) e encha-o com água do sistema de osmose reversa (RO).</li>
		<li>Transfira até 3 fêmeas e 3 machos para lados opostos do tanque separados por uma divisória; até 6 peixes podem ser criados em pares em um único tanque de reprodução.</li>
		<li>Na manhã seguinte, retire a divisória logo após as luzes se acenderem no biotério. 
		NOTA: No presente estudo, as luzes estão acesas em um ciclo de luz de 14 horas (aceso às 9h) e escuro de 10 horas (desligado às 23h).</li>
		<li>Permita o acasalamento sem perturbações por 20 minutos ou até que um número suficiente de embriões seja produzido; os embriões estarão no fundo do tanque de reprodução. Quando os ovos forem observados, levante o tanque interno com fenda junto com os peixes e coloque-os rapidamente (peixes e tanque interno) em um tanque externo sólido e limpo cheio de água RO.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prepare o meio embrionário 1X padrão adicionando o seguinte por 1 L de água RO: 0,287 g (4,9 mM) NaCl, 0,127 g (0,17 mM) KCl, 0,048 g (0,33 mM) CaCl2,2H 2O, 0,04 g (0,33 mM) MgSO4 (anidro). Mexa a solução até que os sais estejam completamente dissolvidos.
	<ol>
		<li>Adicione 100 μL de azul de metileno a 0,1% como fungicida. Adicione 0,25 g de bicarbonato de sódio para ajustar o pH para 7,75. Armazene o meio em temperatura ambiente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Colete os ovos do tanque externo usando uma tela de coleta de ovos e transfira os ovos para placas de Petri (~ 50 embriões por prato) contendo 30 mL de meio embrionário 1X. Incubar os ovos recolhidos a 28,5 °C.</li>
	<li>Preparação de embriões
	<ol>
		<li>Embriões Tg(sox10:EGFP).
		<ol>
			<li>Para embriões Tg(sox10:EGFP), 12 h pós-fertilização (hpf), remova os óvulos mortos e avalie o estágio de desenvolvimento dos embriões. Rastreie embriões positivos para GFP usando um estereomicroscópio fluorescente de dissecação com um filtro de excitação passa-banda padrão de 460-490 nm. Usando uma pinça, remova os córions de 3-4 embriões que expressam GFP e transfira esses embriões para uma placa de Petri separada contendo 30 mL de meio embrionário 1X fresco.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Embriões Tg(foxd3:GFP). 
		<ol>
			<li>Para embriões Tg(foxd3:GFP), a 22-24 hpf, remova os ovos mortos e avalie o estágio de desenvolvimento dos embriões. Rastreie embriões positivos usando um estereomicroscópio fluorescente de dissecação com um filtro de excitação passa-banda padrão de 460-490 nm. Usando uma pinça, remova os córions de 3-4 embriões que expressam GFP.</li>
			<li>Prepare a solução estoque de feniltioureia (PTU) 1000X dissolvendo 0,75 g (3%) de PTU em 25 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Alíquota e armazene a solução estoque a 4 ° C. Adicione 30 μL de solução estoque de PTU 1000X (3%) a 30 mL de meio embrionário 1X para gerar solução de PTU a 0,003%.</li>
			<li>Coloque os embriões GFP-positivos rastreados e descorionados em solução de PTU a 0,003% para inibir a pigmentação. Não inicie o tratamento dos embriões com PTU antes de 20 hpf, pois o tratamento precoce (a <20 hpf) pode ter efeitos adversos na crista neural e no desenvolvimento neuroepitelial. 28</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Antes de conduzir o experimento de lapso de tempo, monitore os embriões por meio de imagens ao vivo usando um estereomicroscópio padrão em intervalos de 12 a 24 horas em comparações pareadas por idade como controle da variação de temperatura.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Montagem de embrião para imagens de lapso de tempo
<ol>
	<li>Preparação de meios embrionários com lapso de tempo
	<ol>
		<li>Prepare a solução padrão de estoque de tricaína a 0,4% adicionando 0,004 g de tricaína a 100 mL de água RO. Alíquota (~ 1 mL) da solução de estoque em tubos de centrífuga novos de 1,5 mL e armazene a -20 ° C.</li>
		<li>Prepare o meio embrionário de lapso de tempo (50 mL de meio embrionário 1X, tricaína 0,016%) adicionando 2 mL de solução de tricaína a 0,4% a 48 mL de meio embrionário 1X. Se estiver usando embriões >22 hpf, adicione também 50 μL de solução estoque de PTU a 3% (concentração final de 003% PTU) ao meio embrionário.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparação de agarose de baixo ponto de fusão a 2%
	<ol>
		<li>Adicione 0,4 g de pó de agarose de baixo ponto de fusão a 20 mL de meio embrionário 1X. Aqueça por 1-2 min ou até que a solução esteja clara e todas as partículas sejam dissolvidas. 
		NOTA: Aumentar a porcentagem do gel de agarose diminui a porosidade da matriz, o que pode impedir fisicamente o crescimento e o desenvolvimento do embrião. Portanto, a solução de agarose pode ser reduzida para 1,5% para minimizar esses efeitos. No entanto, quando o feixe de excitação é mantido estacionário durante a microscopia de varredura a laser, pode ocorrer maior aquecimento, aumentando rapidamente em uma relação logarítmica com o tempo. Neste protocolo, o aquecimento devido à absorção de fluoróforo é altamente localizado na região focal. Assim, na região de interesse, a temperatura pode aumentar para um valor alto o suficiente (≥ 30 ° C) para derreter soluções de agarose feitas em porcentagens inferiores a 1,5, expondo diretamente o embrião ao laser ou permitindo condições nas quais o embrião flutua para fora do plano focal. Por esse motivo, o uso de soluções de agarose inferiores a 1,5% não é recomendado.</li>
		<li>Alíquota (~ 1 mL) a solução de agarose em tubos de centrífuga frescos de 1,5 mL para armazenamento. Armazene o excesso de solução de agarose na forma líquida em um bloco de calor (60-70 ° C) por 2-3 semanas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montando o embrião
	<ol>
		<li>Para configurar a câmara de banho aberta, coloque uma pequena quantidade de graxa de alto vácuo na base da câmara de banho aberta. Coloque uma lamínula de vidro circular na base e aparafuse a parte superior da câmara de banho aberta na base até ficar firme (Figura 1A, B).</li>
		<li>Pipeta (~ 500-700 μL) de solução de agarose a 2% (60-70 ° C) na câmara de banho aberta até que a base esteja ~ 3/4 cheia ( Figura 1C). Observe que, uma vez que a solução de agarose esteja na câmara de banho aberta na bancada do laboratório, a temperatura da solução diminui aproximadamente 1 ° C / s.</li>
		<li>Aguarde 30 s para permitir que a agarose esfrie ligeiramente (~ 30-40 ° C), sem polimerizar completamente e, posteriormente, transfira um único embrião para o centro da base ( Figura 1D, E).</li>
		<li>Sob um estereomicroscópio fluorescente, posicione o embrião usando uma ponta de micropipeta de 1-10 μL, certificando-se de que o embrião seja colocado próximo ao fundo da agarose, pois o embrião pode flutuar quando coberto com meio embrionário se for colocado muito próximo à superfície da agarose. 
		NOTA: Nos vídeos apresentados (Vídeos 1-3), os embriões são orientados lateralmente, mas dependendo da área de interesse, os embriões podem ser orientados ventralmente ou dorsalmente.</li>
		<li>Monitore e reposicione o embrião até que a agarose endureça. Uma vez que a agarose tenha endurecido, use uma pipeta de transferência para preencher a câmara aberta montada inteiramente com meios embrionários de lapso de tempo (Figura 1F).</li>
		<li>Coloque a câmara de banho aberta na plataforma de troca rápida, que se encaixa no stage adaptador ( Figura 1G). Coloque toda a configuração (embrião, câmara de banho aberta, plataforma de troca rápida e adaptador de platina) na platina do microscópio imediatamente acima do condensador (Figura 1H).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Configuração do microscópio para imagens de lapso de tempo
<ol>
	<li>Determinando as configurações do laser
	<ol>
		<li>Determinando o comprimento de onda do laser a ser usado. Use um comprimento de onda que seja duas vezes o comprimento de onda de excitação do fluoróforo de interesse (por exemplo, comprimento de onda entre 880 e 940 nm para GFP). 
		NOTA: No presente estudo, a configuração do comprimento de onda para GFP foi entre 880 e 940 nm. Quanto maior o comprimento de onda, menor a potência de saída do laser.</li>
		<li>Determine a transmissão do laser. Uma alta porcentagem de transmissão a laser matará o embrião, use o nível mais baixo de transmissão (recomendado). Para estudos de lapso de tempo de 24 a 48 h, como aqui apresentados, mantenha a transmissão abaixo de 5%.</li>
		<li>Determine os sistemas de detecção de microscópio e certifique-se de que os filtros corretos para o fluoróforo estejam instalados. 
		NOTA: Para microscópios multifótons, existem vários sistemas de detecção com várias sensibilidades para a fluorescência emitida. Em geral, um sistema de detecção interno tem menos sensibilidade do que um sistema de detecção externo. Para linhagens transgênicas com altos níveis de expressão de GFP, o sistema de detecção interna é adequado. Para linhas transgênicas com baixos níveis de expressão de GFP ou com outros fluoróforos (por exemplo, proteína fluorescente vermelha), um sistema de detecção externo pode ser necessário para manter a porcentagem de transmissão do laser em um nível razoável. Independentemente do sistema de detecção usado, os filtros corretos para o fluoróforo devem estar instalados.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ajustando as configurações do software no microscópio multifóton
	<ol>
		<li>Usando a objetiva 5X, localize o embrião. Eleve manualmente a platina para a posição mais alta e use o foco fino para posicionar o embrião no meio da faixa do microscópio.</li>
		<li>Abaixe manualmente o stage e altere a objetiva de 5X para a objetiva de imersão em água de 25X (abertura numérica NA, 0.95). Levante cuidadosamente o palco para trazer o embrião de volta ao foco.</li>
		<li>No software, clique no modo "xyzt" para obter várias imagens em intervalos de tempo (t) no plano x-y sobre uma profundidade de "z". Use a visualização de epifluorescência ou campo claro para encontrar a profundidade de foco na área de interesse, que demarcará a pilha Z.
		<ol>
			<li>No software, clique no botão "iniciar"; para esses experimentos, a borda lateral do olho foi o início da pilha Z. Clique no botão "final"; a linha média do embrião era o final do Z-stack. 
			NOTA: O tamanho do passo foi de 0,3-0,6 μm e houve um total de ~ 200 passos para um tamanho de pilha z de 60 a 120 μm).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Clique no menu para ajustar o tempo de aquisição e a frequência da imagem. Para o sistema atual, ~ 200 etapas requerem aproximadamente 5 minutos para cada aquisição de pilha z. Para uma recuperação adequada do fluoróforo e sobrevivência do embrião, permita uma proporção de pelo menos 1:3 entre a aquisição do z-stack (laser ligado) e o tempo de recuperação (laser desligado). 
		NOTA: Por exemplo, z-stacks são adquiridos a cada 20 min com 5 min de aquisição z-stack e 15 min de recuperação. Para este protocolo, z-stacks maiores podem ser obtidos, mas aumentariam adequadamente o tempo entre as aquisições de z-stack, resultando em menos imagens ao longo do curso de lapso de tempo.
		<ol>
			<li>Com o tempo apropriado para a recuperação do embrião, defina o tempo entre as pilhas z na janela designada. Defina o período total de tempo para o experimento na janela apropriada.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ajustes finais de software, laser e embrião.
		<ol>
			<li>Ative a configuração de imagem ao vivo para fazer os ajustes finais nas configurações do laser. Ajuste a transmissão do laser (consulte 3.1.2), as barras deslizantes de ganho e deslocamento dentro do software para otimizar a imagem fluorescente. Além disso, ajuste a orientação do embrião, conforme necessário, dependendo da duração do experimento, crescimento antecipado do embrião, etc. Certifique-se de que a área de interesse permaneça dentro do quadro durante o experimento.</li>
			<li>Desligue a fonte de luz epifluorescente, pois ela não é mais necessária durante a aquisição de lapso de tempo. Cubra o palco com a caixa de segurança do laser ( Figura 1I). Ao usar o sistema de detecção interno, a caixa de segurança do laser é adequada para proteção contra a luz de fundo. Pressione "start". 
			NOTA: No entanto, com sistemas de detecção externa mais sensíveis, a caixa de segurança do laser não bloqueia luz de fundo suficiente e tampas adicionais são necessárias para evitar a interrupção da aquisição da imagem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Durante a aquisição de lapso de tempo
<ol>
	<li>Reabasteça a câmara de banho aberta com meios embrionários de lapso de tempo a cada 8-12 h (pelo menos 2 vezes por dia) durante a aquisição de lapso de tempo através das portas deslizantes na caixa de segurança do laser (Figura 1I).</li>
	<li>Antes de abrir as portas da caixa de segurança do laser, certifique-se de que o microscópio não esteja adquirindo uma imagem ativamente. 
	NOTA: O uso de aquecedores e sistemas de circulação de meios não é necessário para experimentos de imagem com lapso de tempo com duração de 24 a 48 h. De fato, as temperaturas dos aquecedores em linha e em linha são difíceis de controlar e, durante a aquisição da imagem, o embrião exibe uma taxa de desenvolvimento adequada em uma faixa de temperatura de 25 a 28 ° C. Além disso, os sistemas de meios circulantes tendem a transbordar e potencialmente danificar o equipamento. Assim, todos os embriões são rotineiramente estadiados após a aquisição.</li>
</ol>
5. Processamento pós-aquisição
<ol>
	<li>No software, clique no menu "arquivo" e escolha "salvar".</li>
	<li>Abra o arquivo no software de processamento de imagem (consulte a Tabela de Materiais). Realce a série de imagens correta. No software, escolha o menu "Processo". Clique em Deconvolução 3D e "Aplicar" para desconvoluir cada z-stack. 
	NOTA: O arquivo é grande; portanto, esta etapa pode levar muitas horas.</li>
	<li>No software, no menu "Processo", clique em "projeção máxima". Clique em "Aplicar" para iniciar a projeção máxima para gerar 1 imagem por pilha z. Exporte cada arquivo máximo projetado (1 imagem por pilha z) como um tiff.</li>
	<li>Importe arquivos tiff individuais para o software de processamento de vídeo. Selecione todos os arquivos tiff e arraste-os para o editor de vídeo. Ajuste a duração de cada imagem no vídeo para 0,1 s. Exporte o vídeo como arquivo mov ou mp4.</li>
</ol>

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</ol>

Este trabalho foi apoiado financeiramente através de subsídios do Instituto Nacional do olho dos National Institutes of Health (K08EY022912-01) e núcleo de pesquisa de visão (P30 EY007003).

Fóton multi imagem de lapso de tempo permite o rastreamento em vivo de populações de células migratórias e transitória. Esta técnica poderosa pode ser usada para estudar processos embrionários em tempo real, e no presente estudo, os resultados deste método aprimorado o conhecimento atual da migração de células da crista neural e do desenvolvimento. Estudos de imagiologia lapso de tempo anteriores normalmente utilizam laser confocal, microscopia eletrônica de varredura. 29 , <su...

Doenças congênitas do olho podem causar cegueira de infância e são muitas vezes devido a anomalias da crista neural cranial. Células da crista neural são transitórias células-tronco que surgem a partir do tubo neural e formam numerosos tecidos por todo o corpo. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 as células da crista Neural, derivadas do prosencéfalo e o mesencéfalo, originar o osso e cartilagem da há regiões frontais e a íris, córnea, malha trabecular e esclera no segmento anterior do olho. 4 , 6 , 7 , Células da crista Neural 8 do rombencéfalo forma que arcos da faringe, mandíbula e trato de saída cardíaca. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 estudos evidenciaram as contribuições da crista neural para ocular e periocular desenvolvimento, enfatizando a importância destas células no desenvolvimento do olho de vertebrados. Com efeito, migração de células da crista neural e diferenciação levar à anomalias craniofaciais e oculares como observado na síndrome de Axenfeld-Rieger e síndrome de Plus de Peters. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 assim, uma compreensão abrangente da migração, proliferação e diferenciação dessas células da crista neural irá fornecer insights sobre as complexidades subjacentes doenças oculares congênitas.
O peixe-zebra é um organismo modelo poderoso para estudar o desenvolvimento ocular, como as estruturas do olho zebrafish são semelhantes aos seus homólogos dos mamíferos, e muitos genes são conservados evolutivamente entre zebrafish e mamíferos. 18 , 19 , 20 além disso, zebrafish embriões são transparentes e ovíparos, facilitando a visualização do desenvolvimento do olho em tempo real.
Expansão no trabalho anteriormente publicado,6,7,20 o padrão migratório de células da crista neural foi descrita usando multi fóton fluorescência de lapso de tempo de imagem em linhas de zebrafish transgênicos rotuladas com proteína verde fluorescente (GFP) sob o controle transcricional do SRY (região sexo-determinando Y)-caixa 10 (sox10) ou D3 Forkhead Box regiões reguladoras do gene (foxd3). 21 , 22 , 23 , 24. lapso de tempo imagem multi fóton fluorescência é uma técnica poderosa que combina as avançadas técnicas de ópticas do laser, microscopia com longo comprimento de onda multi fóton fluorescência de excitação para capturar imagens de alta resolução, tridimensionais de espécimes marcados com fluorophores. 25 , 26 , 27 o uso do fóton multi laser tem vantagens distintas sobre microscopia confocal padrão, incluindo o tecido maior penetração e diminuição da fluoróforo branqueamento.
Usando este método, duas populações distintas de células da crista neural variando em tempo de migração e os caminhos migratórios foram discriminadas, ou seja positiva foxd3 crista neural células do mesênquima periocular e olho em desenvolvimento e crista neural de positivo sox10 células da mesênquima craniofacial. Com este método, é introduzida uma abordagem para visualizar a migração de migração ocular e craniofaciais crista neural no zebrafish, tornando-se fácil observar regulamentado crista neural migração em tempo real durante o desenvolvimento.
Este protocolo fornece informações para gerar vídeos de lapso de tempo durante o desenvolvimento precoce de olho no Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) zebrafish transgênico, por exemplo. Este protocolo pode ser mais aplicado para a visualização de alta resolução, tridimensional, em tempo real do desenvolvimento precoce de qualquer estrutura ocular e craniofacial, derivada de células da crista neural no zebrafish. Além disso, este método ainda pode ser aplicado para a visualização do desenvolvimento de outros tecidos e órgãos no zebrafish e outros modelos animais.

<table><tbody><tr><td>Tanques de Reprodução com Divisórias</td> Conjunto de Tanques <td>de Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>Cruzamento (1,0 litros) Policarbonato Transparente com Tampa e Inserção</td></tr><tr><td>M205 FA Combi-Scope</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td>Microscópio de Estereofluorescência - FusionOptics e TripleBeam</td></tr><tr><td>Cloreto de</td><td>Sódio Millipore (EMD)</td><td>7760-5KG</td><td>Saco de PE duplo. Nº CAS 7647-14-5, Número CE 231-598-3</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Millipore (EMD)</td><td>1049380500</td><td>Cloreto de potássio 99.999 Suprapur. Nº CAS 7447-40-7, número CE 231-211-8.</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio (anidro)</td> <td>Millipore (EMD)</td> <td>MX0075-1</td><td>Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2</td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Millipore (EMD)</td> <td>284-12</td><td>Frasco de vidro; 25 g. Pó, Mancha Biológica Certificada</td></tr><tr><td>Bicarbonato</td><td>de Sódio Millipore (EMD)</td><td>SX0320-1</td><td>Frasco poli; 500 g. Pó, GR ACS. Nº CAS 144-55-8, número CE 205-633-8</td></tr><tr><td>N-feniltioureia</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>>98%. Número CAS 103-85-5, Número CE 203-151-2</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td></td><td>D8418-500ML</td><td>Grau de Biologia Molecular. Número CAS 67-68-5, Número CE 200-664-3</td></tr><tr><td>Tricaína Metanossulfonato</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS222</td><td>Tricaine-S</td></tr><tr><td>Low-Melt Agarose</td><td>ISC Bioexpress</td><td>E-3112-25</td><td>GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, Câmara</td></tr> de <tr><td>Banho Aberta</td> de 25 g <td>Warner Instruments</td><td>RC-40HP</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de Vidro</td> de Alto Perfil <td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Vidro de cobertura circular. Graxa de Alto Vácuo de 25 mm de diâmetro</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5C</td><td>Tubo de 2,0 lb. DOW CORNING CORPORATION 1658832</td></tr><tr><td>Plataforma de troca rápida</td><td>Warner Instruments</td><td>QE-1 Adaptador de</td> platina de <td>35 mm</td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>SA-20LZ-AL</td><td>16,5 x 10 cm</td></tr><tr><td>TC SP5 MP microscópio multifotônico</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser</td><td>SpectraPhysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Safety Box</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)&nbsp; Software</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS 6 Versão 13.0 x64 Software</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMovie Versão 10.1.4 Software</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista neural em embriões de peixe-zebra

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Olho congênito e anomalias craniofaciais refletem as interrupções na crista neural, uma população transiente de migratórias células-tronco que dão origem a numerosos tipos de células por todo o corpo. Noções básicas sobre a biologia da crista neural tem sido limitada, refletindo a falta de modelos tractable geneticamente que podem ser estudados em vivo e em tempo real. Zebrafish é um modelo de desenvolvimento particularmente importante para o estudo de populações de células migratórias, tais como a crista neural. Para examinar a migração da crista neural no olho em desenvolvimento, uma combinação das técnicas de microscopia com comprimento de onda longo multi fóton fluorescência de excitação de laser ópticas foi implementada para capturar vídeos de alta resolução, tridimensionais, em tempo real do olho em desenvolvimento em embriões de zebrafish transgênicos, ou seja, Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP), como sox10 e foxd3 tem sido demonstrados em vários modelos animais para regular a diferenciação de crista neural precoce e provavelmente representam marcadores para as células da crista neural. Fóton multi imagem de lapso de tempo foi usada para discernir o comportamento e os padrões migratórios de duas populações de células da crista neural contribuindo para o desenvolvimento inicial do olho. Este protocolo fornece informações para gerar vídeos de lapso de tempo durante a migração da crista neural zebrafish, como exemplo e pode ser aplicado mais para visualizar o desenvolvimento precoce de muitas estruturas no zebrafish e outros organismos-modelo.

Imagem de Time-Lapse multi fóton fluorescência gerou uma série de vídeos que revelaram os padrões de migração das células craniana crista neural que dão origem às estruturas craniofaciais e segmento anterior do olho no Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) linhas de zebrafish. Por exemplo, sox10células positivas crista neural entre 12 e 30 hpf migram da borda do tubo neural na região craniofacial (Video 1, Figura 2). <s...

Uma combinação das técnicas de microscopia com longo comprimento de onda multi fóton fluorescência de excitação de laser ópticas foi implementada para capturar imagens de alta resolução, tridimensional, em tempo real de migração da crista neural em Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) zebrafish embriões.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

O objetivo geral da imagem multi-fotônica com lapso de tempo é capturar imagens tridimensionais em alta resolução e em tempo real de populações celulares migratórias. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia do desenvolvimento, como o mapeamento das vias de migração de diferentes populações celulares. A principal vantagem desta técnica em relação à microscopia confocal tradicional é que os lasers multi-fotônicos têm maior penetração nos tecidos e menor fototoxicidade.Isso aumenta a usabilidade em tecidos mais espessos e permite períodos mais longos de aquisição de imagens. Para preparar a coleta de embriões entre 15h e 21h, monte tanques de reprodução e preencha-os com água de osmose reversa, ou água OR.Transfira até três fêmeas e três machos para os lados opostos do tanque dividido. Na manhã seguinte, remova o divisor logo após as luzes acenderem no vivário. Permita o acasalamento sem perturbação por 20 minutos ou até que quantidades suficientes de embriões sejam produzidas.Os embriões estarão na parte inferior do tanque de reprodução. Quando os ovos forem observados, levante o tanque interno ranhurado junto com os peixes e coloque-os rapidamente em u

multi-photon-time-lapse-imaging-to-visualize-development-real-time

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este protocolo descreve imagens de neurônios individuais ou de células da crista neural em embriões vivos zebrafish. Este método é usado para examinar comportamentos e localização celular actina microscopia de fluorescência usando lapso de tempo confocal.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

Neste vídeo, técnicas de imagem multicolor de lapso de tempo confocal e ablação de células alvo são fornecidos. Lapso de tempo de imagem é usado para monitorar o comportamento de vários tipos de células de...

Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal

O vídeo atual demonstra um método que tira proveito da combinação de eletroporação e microscopia confocal para realizar imagens ao vivo em células individuais progenitoras neurais no cérebro anterior zebrafish em desenvolvimento.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Fonte: Williams, A. L., et al. Imagem de lapso de tempo multifóton para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de células migratórias da crista neural em embriões de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo mostra um protocolo de imagem de lapso de tempo multifóton para visualizar a migração de células da crista neural em um embrião de peixe-zebra em tempo real com alta resolução.

Visualizando a migração de células da crista neural em um embrião de peixe-zebra usando imagens de lapso de tempo multifóton

Visualização de dados experimental tornou-se um elemento-chave na apresentação de resultados para a comunidade científica. Geração de gravação de lapso de tempo ao vivo de embriões de crescimento contribui para uma melhor apresentação e compreensão dos processos de desenvolvimento complexos. Este protocolo é um guia para marcação celular passo-a-passo através de fotoconversão de proteína Kaede no peixe-zebra.

Visualização de Desenvolvimento Craniofacial nas SOX10: Kaede Transgênicos Zebrafish Linha Usando Time-lapse microscopia confocal

Time-lapse confocal de imagem é uma poderosa técnica útil para caracterizar o desenvolvimento embrionário. Aqui, descrevemos a metodologia e caracterizar morfogênese craniofacial no tipo selvagem, bem como PDGFRA, smad5, e SMO embriões mutantes.

Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal

Aqui, apresentamos um método de montagem versátil que permite a imagem de lapso de tempo de longo prazo do desenvolvimento posterior do corpo de embriões vivos de peixe-zebra sem perturbar o desenvolvimento normal.

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para investigar os mecanismos celulares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo barco-íris em tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento.

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Este protocolo descreve uma abordagem para rotulagem e imagem multidimensional de zebrafish desenvolvimento precoce dos olhos. Descrevemos rotulagem, incorporação e imagens quadridimensionais (4D) usando microscopia confocal de varredura a laser, e considerações para otimizar a aquisição de conjuntos de dados para dissecção de mecanismos de morfogênese de copo óptico.

Imagem 4-Dimensional da Morfogense da Copa Óptica de Zebrafish

Aqui, é fornecido um protocolo para imagens de lapso de tempo de morfogênese ocular usando um microscópio de folha de luz comercialmente disponível e uma estação de trabalho de processamento de imagem para analisar os dados resultantes. Este protocolo detalha os procedimentos para anestesia embrionária, incorporando em baixa temperatura de fusão agarose, suspensão na câmara de imagem, configuração dos parâmetros de imagem e, finalmente, analisando os dados de imagem usando software de análise...

Visualizando Morfogênese Ocular por Microscopia de Folha de Luz usando rx3:GFP Zebrafish Transgênico

Demonstramos um método que aproveita a microscopia confocal de varredura rápida para realizar imagens ao vivo de células da microglia no tectum óptico do peixe-zebra em desenvolvimento, permitindo a análise da dinâmica dessas células in vivo.

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia no embrião de peixe-zebra

Aprenda a usar imagem de lapso de tempo multiphoton para visualizar em tempo real a migração das células da crista neural em embriões de peixe-zebra. Esta técnica oferece alta resolução e menor fototoxicidade.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra (Vídeo) | JoVE Journal

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

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