Name: Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprenda a quantificar quimiotaxia de monócitos in vitro em tempo real e rastrear migração de linfócitos in vivo. Este método permite medições multiplex quantitativas para pesquisa em imunologia.

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Este trabalho foi financiado pelo programa Bernard L. Schwartz para cientistas de médico na Universidade Rockefeller, fundo de desenvolvimento terapêutico de Robertson da Universidade Rockefeller, e o centro de Sackler de Biomedicina e nutrição pesquisa na Universidade de Rockefeller.

todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade Rockefeller &#39; s institucionais Cuidado Animal e Comissão de utilização. Todos os animais estavam alojados em condições específicas isentos de organismos patogénicos.
 1. quimiotaxia In Vitro e <ol><li>cultura THP-1 células 6 em Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 4-(2-hidroxietil) -1- piperazineethanesulfonic ácido (ácido HEPES 25mm) (completar a mídia), mantendo a densidade entre 0,5-1,0 x 10 6 células/mL.</li>
	<li>Cultura de células em um 35 mm prato, etiqueta 3.5 x 10 5 THP-1 células por condição com acetoximetil calceína (calceína-AM; 2,5 µM) ou outra apropriada tintura fluorescente em mídia completa a 37 ° C por 30 min. 
	Nota: Corantes devem ser permeável a membrana celular e compatível com live-célula rotulagem.</li>
	<li>Pré-aquecer um leitor de placas a 37 ° C. 
	Nota: Além do controle de temperatura, funcionalidade de leitura de fundo também é necessária. Consulte a etapa 1.10.2 para uma alternativa para um leitor de placas para quantificação de migração células.</li>
	<li>Enquanto as células estão rotulando, preparar a placa de ensaio e câmara inferior.
	Placa <ol><li>uso de cultura de tecido 24-bem, com uma condição por bem. Realizar cada condição em triplicado.</li>
		<li>Adicionar 750 µ l de Hank &#39; s solução de sal de tampão (HBSS) tamponada com 25mm HEPES e 0,1% albumina de soro bovino (BSA) para a placa de 24. Isto serve como condição o controle basal.
		<ol><li>Uso outro poços para condições de comparador, mantendo sempre o volume total na câmara inferior a 750 µ l. 
			Nota: Neste exemplo, monócitos humanos quimiotático proteína-1 (MCP-1) serve como o controle positivo para quimiotaxia 7.
			<ol><li>Montar a mistura reagente combinando HBSS com 25mm HEPES, BSA (0,1%) e MCP-1 (75 ng/mL). Usar soro bovino adulto (2,7% v / v) com 1-MCP como um controle positivo adicional. 
				Nota: Concentração Chemokine e chemokine dependerá do eixo quimiotático sob estudo. MCP-1 liofilizado é resuspended em água destilada com BSA (0,1%) tornar-se uma solução com uma concentração final de 50 μg/mL. Isto pode ser diluído em água para uma solução de trabalho de 10 μg/mL. Adicionar 5.6 μL desta solução à câmara inferior.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>Após a composição das câmaras de fundo estiver concluída, coloque uma inserção porosa em cada poço, garantindo que as guias do inserto de alinham com os entalhes da placa. 
		Nota: Escolha o tamanho de poro adequado para as inserções. Para monócitos e linfócitos, um tamanho de poro de 3 μm executa bem. Alguns tipos de células e/ou sistemas de chemokine podem exigir uma superfície revestida de matriz para migração ideal. Por exemplo, para medir a quimiotaxia de monócitos THP-1 no sentido de MCP-1, fibronectina ou inserções de colágeno-revestido são recomendadas. Para o leitor de placas para quantificação, a inserção deve ter um revestimento impermeant-luz, como o tereftalato de polietileno, para evitar a deteção de não-migração células na parte superior de câmara 8.</li>
	</ol></li> <li>Após incubação de células por 30 min com calceína-AM, transferir a suspensão de células para um tubo cônico de 15mL. Células de centrifugar a 1.000 x g por 2 min. inspecionam visualmente as células para confirmar a aceitação de calceína-AM ( Figura 1).</li>
	<li>Remover cuidadosamente o sobrenadante usando um aspirador a vácuo. Lave pilhas etiquetadas em soro livre RPMI 1640 suplementado com HEPES 25mm. Centrifugar as células a 1.000 x g por 2 min e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Os eritrócitos em soro livre RPMI 1640 suplementado com HEPES 25mm. Contar as células e ajustar o volume para que as células estão em uma concentração final de 1.0-1.5 x 10 6 células/mL.</li>
	<li>Dispensar 250 μL da suspensão de células para a inserção (câmara superior).</li>
	<li>, Depois de todas as câmaras superiores foram preenchidas, delicadamente levantem a placa e inspecionam a parte inferior para a presença de bolhas de ar que podem interferir com a migração e a deteção. Para remover uma bolha, primeiro tente remover em seguida re-posicionamento da inserção. Se malsucedido, usar uma agulha 27G para perfurar a bolha e, em seguida, coloque novamente a inserção.</li>
	<li>Coloque a placa no leitor de placa previamente aquecido a 37 ° C.
	<ol><li>Leituras de fluorescência Acquire do fundo em intervalos de 1-3 min. Ao usar calceína-AM, defina a fluorescência excitação e emissão de comprimentos de onda em 485 nm e 520 nm, respectivamente. Dependendo do sistema de tipo e chemokine de célula, quimiotaxia ocorre tipicamente mais de 1-4 h ( Figura 2A).</li>
		<li>Como uma alternativa para medições contínuas usando um leitor de placas, imagem dos poços usando um fluorescente microscópio invertido ( Figura 2B) capaz de excitação e detecção de luz em 485 nm e 520 nm, respectivamente. Use uma baixa ampliação para capturar a maioria da parte inferior da inserção. Quantificar as células, processando as imagens com ImageJ ou similares de software 9.</li>
	</ol></li></ol> 2. Transferência adotiva de linfócitos de murino <ol><li>preparação de células de doador <ol><li>Anesthetize semana de 8-12-ratos de doador masculino C57BL/6J velhos com isoflurano anestesia (1-3%), usando um vaporizador. Confirmar a profundidade apropriada da anestesia pelo dedo do pé-pitada.</li>
		<li>Colocar o mouse na posição supina. Fazer uma incisão com um bisturi e localize o baço no espaço peritoneal superior esquerdo. Excisar o baço inteiro e colocar em mídia completa (RPMI suplementado com 10% FBS e 25mm HEPES; 1 mL/baço) no gelo. Eutanásia em animais anestesiados doador por decapitação.</li>
		<li>Moer tecido baço suavemente através de 40 µm de malha de nylon em mídia completa (1 mL /spleen) usando a extremidade de um êmbolo da seringa para fazer uma célula única suspensão e transfira para um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Adicionar 4 volumes de lise de potássio (ACK) cloreto de amônio buffer e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para lisar eritrócitos.</li>
		<li>As células a 1.000 x g por 2 min à temperatura de centrifugação e descartar o sobrenadante. Se hemácias permanecem em pelota, resuspenda em tampão de Lise ACK, incubar durante 5 min à temperatura ambiente, centrifugue células a 1.000 x g por 2 min e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as células em mídia completa em uma concentração de 2-5 x 10 7 células/mL e, em seguida, estique a suspensão de células através de uma malha de nylon de 40 µm para remover os resíduos de células.</li>
		<li>Label 1 x 10 7 rato de células/destinatário com uma tintura fluorescente compatível com células vivas e que será mantida mediante fixação subsequente, tais como 5-chloromethylfluorescein diacetato (concentração final 2 μM) 10 . Incubar a 37 ° C por 30 min. 
		Nota: Para controlar a população de mais de um celular, use outras tinturas fluorescentes com populações de células adicionais. Por exemplo, uma parte das células do doador pode ser rotulada com 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoíla) amino) diversos (concentração final 2 μM) 11.</li>
		<li>Adicionar 4 volumes HBSS suplementado com 25mm HEPES, em seguida, centrifugar a 1.000 x g por 2 min e descarte sobrenadante. Resuspenda o pellet em HBSS suplementado com HEPES 25mm para uma concentração final de 1 x 10 8 células/mL.
		<ol><li>Se usando mais de um corante fluorescente, manter as populações de células separadas até imediatamente antes da injeção.</li>
			<li>Transferir uma pequena alíquota (10 μL) de células de cada cor para uma solução fixador (1 mL) para compensação de citometria de fluxo subsequente.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Transferência de linfócitos <ol><li>anestesiamos a semana de 8-12-velhos camundongos C57BL/6J destinatários machos com isoflurano (1-3%) usando um vaporizador; confirmar a profundidade de anestesia pelo dedo do pé-pitada. Aplicar a pomada veterinária animal &#39; olhos de s para impedir a secagem.</li>
		<li>Brevemente as células do doador vórtice (1 s) e a transferência para a seringa de injeção de 1 mL com 27 G, 0,5 na agulha, combinando populações de células diferencialmente rotulado, se aplicável.
		<ol><li>Transferir uma pequena alíquota (10 μL) de células mistas para uma solução fixador (1 mL) para análises de citometria de fluxo subsequente.</li>
		</ol></li> <li>Colocar animais dadores de bruços. Aplique uma pressão suave caudal a pele dorsal para o olho, fazendo com que o globo ocular para se projetar ligeiramente.</li>
		<li>Direto da agulha medialmente e injetar 100 µ l de suspensão de células de doador retrô-orbitally para cada destinatário do mouse. As células também podem ser injetadas através da veia da cauda.</li>
		<li>, Gradualmente, retirar a agulha de injeção e posicione o mouse sozinho em uma gaiola de recuperação. Monitorar o animal até que ele recuperou a consciência; uma vez totalmente recuperado retorno do animal à habitação social.</li>
	</ol></li> <li>Recolha e análise <ol><li>após 1 h, anestesiar o destinatários ratos com isoflurano anestesia (1-3%) usando um vaporizador; confirmar a profundidade de anestesia pelo dedo do pé-pitada. Colher o baço (ou outro tecido de interesse) (etapa 2.1.2.) de cada destinatário do mouse e coloque em mídia completa (1 mL/destinatário). Eutanásia em animais anestesiados por decapitação. 
		Nota: Maiores intervalos antes da colheita de tecido irão aumentar a acumulação de tecido através de pelo menos 24 h.</li>
		<li>Moer tecido baço suavemente através de 40 µm de malha de nylon em mídia completa usando a extremidade de um êmbolo da seringa para fazer uma célula única suspensão e transferência para tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Adicionar 4 volumes do lysis ACK buffer e incubam 5 min à temperatura ambiente. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 1.000 x g por 2 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Os eritrócitos de coloração, o tampão (tampão fosfato salino suplementado com 1% FBS). Contar as células e ajustar para uma concentração final de 3 x 10 7 células/mL. Transferir 100 µ l de suspensão de células para um 96-poço redondo placa inferior.</li>
		<li>Células mancha para marcadores desejadas (consulte a tabela de materiais) para análise por citometria de fluxo. Adicionar anticorpos conjugados fluoróforo (consulte a tabela de materiais) contra marcadores desejadas e incubar a 4 ° C por 20 min no escuro. Adicione 100 µ l tampão de coloração, centrifugue células a 1.000 x g por 3 min e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Resuspenda o pellet em 200 µ l tampão de coloração, centrifugue células a 1.000 x g por 3 min e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender o sedimento na coloração de 125 µ l de buffer e adquirir amostras usando um citômetro de fluxo, usando os procedimentos padrão. 
		Nota: A tinta verde é animada por um laser de 488 nm e a emissão é detectada com filtros dicroicos 505 e 530/30. O corante laranja é animado por um 561 nm e a emissão é detectado por um filtro dicroico 582/15.
		<ol><li>Uso salvou células de 2.1.8.2 para compensar cada tintura fluorescente. 
			Nota: Usando a compensação baseada no grânulo com fluorophores correspondência a excitação e espectros de emissão das tinturas rotulagem resultará em compensação suboptimal.</li>
			<li>Usar as células de entrada salvas da etapa 2.2.2.1 para determinar com precisão a proporção de diferencialmente rotulado entradas células se usando mais do que uma população rotulada ( Figura 3). Calcular a migração específica de tecido com base na relação de rotulado de células sem rótulo ( Figura 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+chemokine+receptors%3A+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li>
<li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.protocol-online.org/protocols/4464.pdf">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li>
<li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2186747">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li>
<li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li>
<li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li>
<li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking%3A+chemokines+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

Quantificação da migração celular imune pode ser realizada usando simples e rápida os ensaios in vitro e em vivo. Demonstramos a em vitro quimiotaxia de monócitos humanos em resposta a um gradiente de MCP-1 e aumento pelo soro. In vivo, doador murino splenocytes diferencialmente foram rotulados e após transferência adotiva, foram recuperados do destinatários animais.
Usando um leitor de placa tem a vantagem de vários pontos de tempo de amostragem (tão freque...

Imunidade robusta requer a coordenação temporal e espacial complexa de uma miríade de tipos de células, a fim de responder adequadamente a uma lesão, infecção e gerar auto-tolerância. Várias dezenas de receptors do chemokine e seus ligantes correspondentes foram descobertos e caracterizados fornecendo mecanismos moleculares pelos quais células específicas podem ser direcionados em um tecido específico em um tempo específico. Assim, estudar a quimiotaxia e a migração é um componente indispensável de pesquisa de Imunologia. Com efeito, o ensaio descrito em vitro recentemente foi usado como uma ferramenta de triagem para identificar um cofactor quimiotático que acelera a quimiotaxia de células T em direção de quimiocinas, 19 e 21 C C3. A finalidade dos métodos descritos aqui são para permitir avaliações quantitativas de célula imune quimiotaxia em vitro e in vivo.
O ensaio de câmara Boyden (migração celular e invasão) é um método barato, reprodutível e rápido para avaliar a migração de células4,5. No ensaio de padrão, a câmara superior é semeada com células e é separada por uma inserção porosa de uma câmara inferior, na qual as células migram. No momento desejado, células que migraram para a parte inferior da inserção podem ser fixo e manchadas para quantificação por microscopia de luz. No entanto, tais medições restringem a coleta de dados para um único ponto de extremidade, o que impede a coleta de dados dinâmico e podem exigir a otimização extensiva para determinar o ponto ideal de tempo para análise. Aqui, várias adaptações são descritas que permite medições em tempo real, quantitativas e multiplexadas de quimiotaxia em vitro.
Estudos em vivo , é usado um ponto de extremidade funcional, ou seja, o acúmulo específico de células em um compartimento de determinado tecido. Células de doador previamente rotulado são introduzidas animais destinatários através de transferência adotiva. Estas células de doador posteriormente podem ser identificadas por citometria de fluxo após a colheita de tecidos destinatário. Também apresentado é uma estratégia co rotulagem que permite a determinação do tráfico de diferentes tipos de células dentro de um único animal de destinatário. Esse método elimina a variação entre animais da injeção de célula, contas e variabilidade fisiológica de animal para animal.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de cultura de células</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td>Excitação: 485nm, Emissão: 520nm</td></tr><tr><td>Célula placa de cultura</td><td>Corning</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>placa de 24 poços</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroblok Inserção de Fibronectina</td><td>Corning</td><td>CB354597</td><td></td></tr><tr><td>tubo cônico de 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td> de<td>Albumina de Soro Bovino</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Humano MCP-1</td><td>Peprotech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino adulto</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>HBSS com cálcio e magnésio; sem fenol vermelho</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas SpectraMax M2e</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX71 microscópio de fluorescência invertida</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein saúde animal</td><td>11695-6776-2</td><td>Anestesia com isofluorano</td></tr><tr><td>Filtro de células 40um nylon</td><td>Falcon Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Qualidade Biológica</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Laranja CMTMR Corante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>Excitação: 541nm, Emissão: 565nm</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Excitação: 485nm, Emissão: 520nm</td></tr><tr><td>Seringa de 5ml</td><td>Seringa BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>seringa TB de 1 ml</td><td>Seringa BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>linha celular THP-1</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-camundongo CD3 Violeta Brilhante 421</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td>Excitação: 405nm, Emissão: 421nm</td></tr><tr><td>Anticorpo CD19 anti-camundongo Violeta Brilhante 605</td><td>Biolegend</td><td>115540</td><td>Excitação: 405nm, Emissão: 603nm</td></tr><tr><td>Placa inferior redonda de 96 poços</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Citômetro de fluxo</td></tr></tbody></table>

quantificar o humano monocyte chemotaxis in vitro e linfócitos murino tráfico vivo

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quimiotaxia é a migração ao longo de um gradiente químico específico1. Quimiocinas são Quimiotáticos citocinas que promovem o tráfico celular com especificidade anatómica e temporal2. Quimiotaxia é uma função crítica de linfócitos e outras células do sistema imunológico que podem ser quantitativamente avaliada em vitro. Este manuscrito descreve métodos que permitem a avaliação da quimiotaxia, tanto in vitro e em vivo, para tipos de diversas células incluindo linhas celulares e células nativas. O em vitro, formato baseado na placa permite a comparação das várias condições simultaneamente em tempo real e pode ser concluída dentro de 1-4 h. em vitro ensaio condições podem ser manipuladas para introduzir-se como agonistas e antagonistas, bem como diferencia quimiotaxia de chemokinesis, que é o movimento aleatório. Na vivo avaliação do tráfico, de células do sistema imunológico podem ser rotuladas com vários corantes fluorescentes e usadas para transferência adotiva. A rotulagem diferencial de células permite a populações de células mistas a ser introduzido o mesmo animal, assim, diminuindo a variância e reduzindo o número de animais necessários para uma experiência adequadamente alimentada. Migração no tecido linfoide ocorre em menos de 1h, e vários compartimentos de tecido podem ser saboreados. Citometria de fluxo após a colheita de tecidos permite uma análise rápida e quantitativa dos padrões migratórios de vários tipos de células.

Quando usar tintura de calceína-AM, inspeção visual das células confirmará a captação do rótulo (Figura 1). Leituras de fluorescentes automatizadas controlará a migração como trânsito de células na parte inferior da inserção ao longo do tempo. Estes dados mostram claramente uma indução de migração de células para o MCP-1, bem como um aumento da resposta pelo soro (Figura 2A). Dependendo da força do estímulo migratório, há um inte...

Protocolos para avaliação quantitativa da quimiotaxia de linfócitos e migração são ferramentas importantes para pesquisa de Imunologia. Aqui, um protocolo em vitro é descrito que permite em tempo real, multiplexados avaliação da migração celular, bem como um complementares na vivo técnica permitindo rastreamento de células nativas para o baço.

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Os objetivos gerais desses ensaios são quantificar a quimiotaxia de monócitos in vitro em tempo real e acompanhar a migração de linfócitos in vivo. O método in vitro pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de imunologia, como quais são os efeitos dos fatores séricos na quimiotaxia de células imunes. A principal vantagem da técnica in vitro é que ela permite medições quantitativas e multiplex em tempo real.O método in vivo pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de imunologia sobre como tipos específicos de células migram dentro de um animal receptor. A técnica in vivo é particularmente útil para a avaliação quantitativa da migração de múltiplos tipos celulares dentro do mesmo animal. Antes de iniciar o experimento, marque as células THP-1 com um corante fluorescente em uma placa de cultura celular de 35 milímetros em meio completo a 37 graus Celsius por 30 minutos.Enquanto as células estão em incubação, adicione 750 microlitros de HBSS tamponado com 25 milimolares de HEPES e 0,1% de BSA aos poços de fundo de escala e controle positivo de uma placa de 24 poços. Adicione a concentração apropriada de MCP-1 em água suplementada com BSA aos poços experiment

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós descrevemos um protocolo de brightfield microscopia intravital para medir a dinâmica interações neutrófilos-célula endotelial durante o recrutamento de neutrófilos em resposta à fonte de um chemoattractant neutrófilos in vivo. Neutrófilos rastejando intraluminal, a migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular do rato cremaster são visualizados com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e rastreados com ImageJ.

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

Este vídeo demonstra uma investigação experimental da transmigração de linfócitos através de um modelo de endotélio de barreira hematoencefálica (BBB). Uma monocamada de células endoteliais microvasculares do cérebro humano (HBMECs) é gerada in vitro, e células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) contendo linfócitos são adicionadas à monocamada. As células são então incubadas para permitir a transmigração de linfócitos e as células migradas são quantificadas usando citometria de fluxo.

Estudando a transmigração de linfócitos através de uma monocamada de células endoteliais microvasculares

Descreveremos um protocolo para medir transmigração por monócitos em monocamadas endoteliais humanas e sua maturação subsequente em células de espuma. Isso fornece um método versátil para avaliar as propriedades aterogênico de monócitos isoladas de pessoas com doenças diferentes condições e avaliar fatores no sangue que pode melhorar esta propensão.

Quantificação de transmigração de monócitos e formação de célula de espuma de indivíduos com doenças inflamatórias crônicas

Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Aqui, apresentamos um protocolo integrado que mede subpopulação de monócitos tráfico sob fluxo in vitro pelo uso de marcadores de superfície específicas e microscopia de fluorescência confocal. Este protocolo pode ser usado para explorar etapas sequenciais de recrutamento, bem como perfil de outros subtipos de leucócitos usando outros marcadores de superfície específicos.

Estudo simultâneo do recrutamento de monócitos subpopulações sob fluxo In Vitro

Aqui, demonstramos os métodos para a quantificação na vivo de saída de leucócitos de ingênuo, inflamado e pele murino maligna. Realizamos uma Head-to-comparação de dois modelos: transdermal FITC photoconversion de aplicativo e in situ . Além disso, vamos demonstrar a utilidade da photoconversion para controlar a saída de leucócitos de tumores cutâneos.

Quantificar a saída de leucócitos através de vasos linfáticos da pele murino e tumores

O protocolo introduzido aqui permite a caracterização da capacidade pulmonar localizador de linfócitos humanos primários sob condições inflamatórias em vivo. Infiltração pulmonar de enviaram transferidas células imunes humanas em um modelo do rato da inflamação alérgica pode ser fotografada e quantificada por microscopia de fluorescência de luz-folha de tecido pulmonar quimicamente limpo.

Avançado de imagem do pulmão Homing linfócitos humanos em um Experimental em modelo Vivo de inflamação alérgica baseada em microscopia de luz-folha

Aqui nós apresentamos um protocolo para quantificar a atividade Quimiotáticos de monócitos do sangue em modelos do rato, para avaliar os efeitos de intervenções nutritivas, farmacológicas e genéticas no monocyte do sangue e para caracterizar os macrófagos derivados do sangue dos monócitos em modelos de mouse usando o monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-carregado porão membrana-derivado gel plugs.

Quantificação da atividade quimiotática de monócitos in vivo e caracterização de macrófagos derivados de monócitos sanguíneos

Neste protocolo, os linfócitos são colocados na câmara superior de um sistema de transmigração, separados da câmara inferior por uma membrana porosa. A quimiocina é adicionada à câmara inferior, o que induz a migração ativa ao longo de um gradiente de quimiocina. Após 48 h, os linfócitos são contados em ambas as câmaras para quantificar o transmigration.

Avaliação da migração do linfócito em um sistema de transmigração ex vivo

Aqui descrevemos métodos usando microscopia de tempo-lapso, contraste de fase para macrófagos peritoneal residentes em camundongos em um gradiente c5a complementar quimático. Os protocolos podem ser estendidos a outras células imunes.

Imagem em lapso de tempo de Quimioterapia de Macrophage mouse

Este protocolo fornece um método de isolamento primário de células T murinas e microscopia de lapso de tempo da migração de células T sob condições ambientais específicas com análise quantitativa.

Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias

Aprenda a quantificar quimiotaxia de monócitos in vitro em tempo real e rastrear migração de linfócitos in vivo. Este método permite medições multiplex quantitativas para pesquisa em imunologia.

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

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