Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Os objetivos gerais desses ensaios são quantificar a quimiotaxia de monócitos in vitro em tempo real e rastrear a migração de linfócitos in vivo. O método in vitro pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia, como quais são os efeitos dos fatores séricos na quimiotaxia das células imunes. A principal vantagem da técnica in vitro é que ela permite medições quantitativas e multiplex em tempo real.

O método in vivo pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia sobre como tipos específicos de células migram dentro de um animal receptor. A técnica in vivo é particularmente útil para a avaliação quantitativa da migração de vários tipos de células dentro do mesmo animal. Antes de iniciar o experimento, rotule as células THP-1 com um corante fluorescente em uma placa de cultura de células de 35 milímetros em meio completo a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Enquanto as células estão incubando, adicione 750 microlitros de HBSS tamponados com HEPES 25 milimolares e 0,1% BSA ao fundo e aos poços de controle positivo de uma placa de 24 poços. Adicionar a concentração apropriada de MCP-1 em água suplementada com BSA aos poços experimentais e de controle positivo. E coloque inserções porosas em cada poço, tomando cuidado para que as abas das inserções estejam alinhadas com os entalhes da placa.

É fundamental remover quaisquer bolhas dos poços inferiores após a colocação das inserções, pois as bolhas interferem nas medições de fluorescência. No final da incubação, transferir as células marcadas para um tubo cónico de 15 mililitros para a sua recolha por centrifugação. E inspecione visualmente o pellet resultante para confirmar a absorção do corante.

Em seguida, aspire cuidadosamente o sobrenadante a vácuo e lave as células em meio RPMI-1640 sem soro suplementado com HEPES 25 milimolares nas mesmas condições de centrífuga. Ressuspenda o pellet em meio fresco sem soro com HEPES para contagem. E ajuste o volume para uma concentração final de um a 1,5 vezes 10 para as seis células por mililitro.

Adicione 250 microlitros de células à câmara superior de cada poço e coloque a placa em um leitor de placas a 37 graus Celsius. Em seguida, adquira leituras de fluorescência das câmaras inferiores em intervalos de um a três minutos nos comprimentos de onda apropriados de excitação e emissão de fluorescência para o corante. Para preparar as células do doador para sua transferência adotiva, primeiro, colha todo o baço de um camundongo C57 preto de oito a 12 semanas anestesiado em um filtro de malha de náilon de 40 micrômetros em uma placa de cultura de células contendo meio completo em gelo.

Usando a ponta de um êmbolo de seringa, macere suavemente o baço através da tela. Quando uma única suspensão celular for obtida, transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros e adicione quatro volumes de tampão de lise de potássio e cloreto de amônio para esgotar os glóbulos vermelhos. Após cinco minutos à temperatura ambiente, recolher as células por centrifugação e ressuspender o sedimento em meio completo a uma concentração de duas a cinco vezes 10 elevado à sétima célula por mililitro.

Coe as células através de uma nova malha de náilon de 40 micrômetros para remover os detritos celulares. E rotule uma vezes 10 elevado a sete células por camundongo receptor com um corante fluorescente compatível com células vivas que será retido após a fixação subsequente por 30 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação, lavar as células em quatro volumes de HBSS suplementados com HEPES.

E ressuspenda o pellet em HBSS fresco mais HEPES para uma concentração de uma vez 10 elevado a oitavo células por mililitro. Em seguida, faça um vórtice breve das células doadoras e carregue-as em uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 27 de 0,5 polegada. Coloque os camundongos C57 pretos receptores de seis anos anestesiados de oito a 12 semanas de idade na posição prona e aplique uma leve pressão caudal na pele dorsal ao olho do primeiro animal, fazendo com que o globo ocular se projete ligeiramente.

Direcione a agulha medialmente para a injeção retro-orbital de 100 microlitros de células doadoras. Em seguida, retire gradualmente a agulha e coloque o mouse em uma gaiola de recuperação individual com monitoramento até a recuperação total. É fundamental que os animais sejam adequadamente anestesiados e que o procedimento de injeção tenha sido bem praticado para garantir a entrega celular consistente entre os animais e entre os experimentos.

Até 24 horas após a transferência adotiva, colha os baços em um mililitro de meio completo por recipiente. E gere uma suspensão de célula única livre de glóbulos vermelhos, como acabamos de demonstrar. Após a contagem, ajuste a suspensão celular para três vezes 10 elevado à concentração de sete células por mililitro no tampão de coloração.

E transfira 100 microlitros de células para poços individuais de uma placa inferior redonda de 96 poços. Manchar as células para os marcadores de interesse de acordo com os protocolos padrão de análise por citometria de fluxo. Após 20 minutos em gelo protegido da luz, lave as células em 100 microlitros de tampão de coloração e ressuspenda os grânulos em 200 microlitros de tampão de coloração fresco para uma segunda centrifugação.

Em seguida, ressuspenda o pellet em 125 microlitros de tampão de coloração fresco e analise as amostras de células em um citômetro de fluxo de acordo com os protocolos padrão. Leituras fluorescentes automatizadas para rastrear a migração demonstram claramente uma indução de migração celular em direção ao MCP-1 que é aumentada na presença de soro. Dependendo da força do estímulo migratório, há um atraso de pelo menos 15 minutos antes de um aumento no sinal fluorescente que pode atingir o pico e diminuir gradualmente à medida que as células passam para a solução na câmara inferior da parte inferior da inserção a uma taxa mais rápida do que a das células que migram da câmara superior.

Se mais de uma população de células marcadas com fluorescência for transferida adotivamente, é importante quantificar a proporção relativa de populações de células dentro do material de entrada para levar em conta qualquer variação na mistura das populações de células. Por exemplo, neste experimento, a proporção de células fluorescentes verdes e laranja foi de 0,97 para um. O tráfego foi quantificado como o número de células marcadas recuperadas dividido pelo número total de células recuperadas.

Embora haja uma variação considerável no número de células recuperadas entre os animais, para qualquer animal, a proporção de células fluorescentes verdes e laranja é tipicamente aproximadamente igual. Uma vez dominada, a técnica in vitro pode ser concluída em quatro horas, e a técnica in vivo pode ser concluída em seis horas, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar a criação de bolhas nas câmaras experimentais e de buscar consistência durante a injeção retroorbital das células transferidas adotivamente.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de imunologia explorarem a quimiotaxia in vitro e in vivo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como conduzir e monitorar um ensaio de quimiotaxia in vitro em tempo real e isolar linfócitos nativos para sua transferência adotiva e para rastrear sua migração in vivo. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.