Name: Medição de níveis de mRNA ao longo do tempo durante a levedura s. cerevisiae hipóxica resposta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprenda a medir níveis de mRNA ao longo do tempo durante a resposta hipóxica de S. cerevisiae usando RNA-seq. Este método permite analisar a dinâmica da expressão gênica em resposta ao estresse celular.

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Agradecemos o Instituto Lewis-Sigler Integrativa facilidade do núcleo do sequenciamento de genómica da Universidade de Princeton para aconselhamento técnico e para a preparação de biblioteca de RNA e sequenciamento. Este trabalho foi financiado por doações da Universidade Rowan e NIH NIGMS R15GM113187 para M.J.H.

1. indução de hipóxia
<ol><li>Um dia ou mais antes do curso do tempo de hipoxia: preparar a incubadora, célula de filtragem sistema, vácuo, tanque de gasolina, balões, rolhas, tubos de vidro e tubos, como a Tabela de materiais.</li>
	<li>Coloque o tanque de2 N, incubadora, sistema de vácuo e filtragem nas proximidades, para permitir o processamento rápido das células.</li>
	<li>Prepare a mídia YPD líquida estéril (1% de extracto de levedura, peptona de 2%, 2% de glicose) misturando os componentes em um frasco de vidro e autoclave.</li>
	<li>Planeje o layout dos balões na incubadora. Nota: O tanque de2 N, o primeiro balão será uma armadilha de água, o segundo frasco será o último ponto de tempo, o terceiro frasco será o tempo do segundo para o último ponto e assim por diante até o último frasco que é uma armadilha de água final. A Figura 1 mostra a ordem e as conexões entre os frascos.</li>
	<li>O dia antes do curso do tempo, inocule uma colônia de levedura em uma cultura de 5 mL de YPD líquido dentro de um tubo de ensaio estéril. Especificamente, pega uma colônia cheia de uma placa utilizando uma ansa esterilizada. Coloque o stick no líquido YPD e apertar o pau até que a maioria das células em suspensão.</li>
	<li>Gire os tubos a 30 ° C durante a noite (~ 16 h). Nota: Após 16 h, sua células vão atingir saturação (~ 2 x 108 células/mL), indicada por uma cultura muito nublada. Outras cepas podem levar mais tempo para atingir a saturação e devem ser testadas por medir a concentração de células com um espectrofotômetro, conforme indicado no passo 1.9.4.</li>
	<li>No dia do curso de tempo, depois de 16 h de incubação, diluir a cultura saturada 01:50, usando uma pipeta de 5 mL para colocar 4 mL de pernoite cultura em 196 mL de YPD líquido dentro de um frasco estéril 500 mL. Crescer com agitação a ~ 200 rpm por 4 h a 30 ° C. Nota: Após 4 h, a sua cultura vai chegar a uma concentração de registro médio de ~ 1-2 x 107 células/mL.</li>
	<li>Durante a incubação de 4 h, Rotule os frascos (para armadilhas de hipóxia e água) e os 50 mL tubos de colheita. Se a incubadora na etapa 1.7 acima não é usada para o curso de tempo de hipóxia, ligue a outra incubadora e definir a 30 ° C.</li>
	<li>
Antes de submeter as células a hipóxia:
	<ol>
<li>Adicione ~ 50 mL de água para dois dos frascos 250ml estéril que servirão as armadilhas de água.</li>
		<li>Encha 1/3 de um gelo balde com nitrogênio líquido e mergulhe um rack de espuma de poliestireno para segurar tubos de centrífuga de 50 mL.</li>
		<li>Configure o sistema de filtro para a coleta de células. Adicione um disco de filtro estéril para a unidade inferior do sistema de filtração, usando uma pinça estéril, tendo o cuidado de só tocar as bordas do disco filtro. Coloque a unidade de filtro superior na unidade inferior do filtro e prenda com os grampos fornecidos com o sistema. Certifique-se de que as unidades inferior e superior são alinhadas para que haja um selo apertado e nenhum escapamento.</li>
		<li>Medir a concentração de células com um espectrofotômetro. Dilua as células para que eles podem ser medidos na escala linear do espectrofotómetro – OD600 entre ~0.2 - 0.6, dependendo do espectrofotómetro. Nota: Uma unidade de600 OD é ~ 3 x 107 células/mL, dependendo da morfologia celular e Espectrofotômetro. Espera-se uma concentração de 1 ~ 2 x 107 células/mL, correspondente a OD600 de ~0.33 - 0,66.</li>
		<li>
Rapidamente obter a amostra de tempo 0.
		<ol>
<li>Ligue o sistema de filtro à vácuo forte (~ 10 mbar) através de tubos de vácuo e uma armadilha do frasco de 1.000 mL. Ligue o aspirador. Despeje a unidade superior da cultura (normalmente ~ 20 mL) e esperar para o líquido ser puxado através do filtro (~ 10 s, dependendo da força do vácuo).</li>
			<li>Com cuidado, retire o disco do filtro com uma pinça limpa e coloque em um tubo de centrífuga de 50 mL. Imediatamente, coloque o tubo de centrifugação dentro do rack mergulhado em nitrogênio líquido. Importante, não pre-chill os tubos antes de inserir o filtro vão explodir os tubos.</li>
			<li>Depois > 30 s, lugar o tubo em um freezer-80 ° C para posterior extração do RNA. Após cada filtração, limpar e remontar o sistema de filtro. Enxaguar o sistema, puxando a água de 10 s sem um disco de filtro. Finalmente, seque o sistema com uma toalha de papel.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dilua a cultura de 4h em frascos diferentes para os vários pontos de tempo, para que cada balão atinge concentração log médio (~ 1-2 x 107 células/mL) no ponto indicado tempo de hipóxia. Nota: A tabela 1 mostra as diluições que foram usadas para a tensão de haploides selvagem-tipo S288C HAP1+ . É aconselhável testar cada estirpe nestas condições de cultura hipóxica e ajustar de acordo com as diluições.</li>
		<li>Uma vez que as células e mídia é adicionada para frascos, substitua a folha de alumínio cobrindo o balão abrindo com uma rolha contendo dois tubos de vidro inseridos.</li>
		<li>Coloca os frascos na incubadora no layout determinado anteriormente.</li>
		<li>Conecte firmemente o tubo conforme mostrado na Figura 1.</li>
		<li>Verifica que todas as rolhas são firmemente empurradas para as aberturas de balão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>No tempo 0, abra a válvula do regulador. Em seguida, defina o medidor de fluxo de 3 L/min. Nota: Bubbling será observado em ambos os balões de água, indicando o fluxo adequado de gás. Se isso não for o caso, verifique se todas as rolhas são apertadas e tubulação está bem colocada.</li>
	<li>Fechar a incubadora e definir a velocidade de agitação para ~ 200 rpm. Inicie um timer.</li>
	<li>Cada ponto de tempo, antes de configurar o sistema de filtro como descrevo acima na etapa 1.9.3.</li>
	<li>
Em cada ponto de tempo (por exemplo, 5 min, 10 min, etc.), tem duas pessoas processar rapidamente as células da seguinte forma:
	<ol>
<li>Primeira pessoa: Remova o frasco apropriado do suporte e retire o bujão (com tubos de vidro ligados). Nota: Isto não vai quebrar o fluxo de N2 a qualquer dos restantes frascos cultura mas quebrará temporariamente o fluxo para a última armadilha de água.</li>
		<li>Segunda pessoa: Pipetar 1 mL da cultura e dispense em uma cubeta. Reconecte o tubo do frasco de cultura que é agora no fim da linha para a última armadilha de água (um tubo e uma rolha vai ser eliminada durante o processo.). Em seguida, medir a concentração de células na cubeta, conforme descrito acima na etapa 1.9.4.</li>
		<li>Primeira pessoa: Despeje o restante da cultura o sistema de filtragem de vácuo e em seguida, executar a filtragem e congelamento conforme descrito acima na etapa 1.9.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando acabar com todos os pontos de tempo, desligue o gás de2 N. Primeiro fechar o regulador e esperar que a pressão liberar e depois desligar o medidor de fluxo. Finalmente, desmontar o sistema e limpar todos os materiais com água e em seguida etanol 70%.</li>
</ol>2. extração do RNA
<ol><li>Prepare o tampão RLT para purificação de RNA coluna, conforme descrito na Tabela de materiais.</li>
	<li>Preparar uma solução de trabalho de DNase, adicionando 10 µ l da solução estoque de DNase a 70 µ l de tampão RDD por amostra (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Retirar os tubos de 50 mL contendo filtros e células do freezer-80 ° C e colocar no gelo a derreter (~ 15 min). Execute as seguintes etapas com tubos no gelo.</li>
	<li>Rotular mL 2 tubos de tampa de rosca e coloque-os em gelo, um tubo para cada amostra. Adicione ~0.6 mL de grânulos ácido lavado a cada tubo, usando um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para colher e medir os grânulos.</li>
	<li>Adicione 0,6 mL de tampão RLT frio para os tubos de 50 mL.</li>
	<li>Pipetar acima e para baixo para remover células de filtro e suspender em solução. Evite deixar o filtro permanecem na solução, como o filtro irá absorver a solução. Remover toda solução absorvido o filtro usando a ponta da pipeta para apertar o filtro contra a parede do tubo.</li>
	<li>Transferi todo o líquido do tubo de 50 mL para os tubos de tampa de rosca contendo grânulos.</li>
	<li>Coloque os tubos de tampa de rosca em um homogeneizador de moinho do grânulo e concorrer a um min. Imediatamente, coloque os tubos no gelo durante três minutos. Novamente, coloque os tubos para o homogeneizador e concorrer a um min.</li>
	<li>Retire os tubos do homogenizador e lugar no gelo por 5 min. As contas vão resolver para o fundo do tubo.</li>
	<li>Execute o restante das etapas à temperatura ambiente.</li>
	<li>Com uma pipeta, transferir somente o lisado (~ 350 µ l), evitando os grânulos, para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Microcentrifuga por 2 min em velocidade máxima e a transferência então o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicione 1 volume de etanol a 70% (feito de etanol de grau biologia molecular prova 200). Misture bem por pipetagem.</li>
	<li>Transferir a solução e qualquer precipitado para uma coluna de RNA que foi colocada dentro de um tubo de coleta de 2 mL.</li>
	<li>Centrifugar por 15 s em ≥12, 000 x g e descarte o escoamento (o líquido no tubo).</li>
	<li>Adicione 350 µ l de tampão RW1 à coluna. Centrifugar por 15 s em ≥12, 000g x e descarte o escoamento.</li>
	<li>Adicione 80 µ l DNase mistura de incubação para a membrana de coluna (não ficar nos lados do tubo) e deixe para descansar por 15 min.</li>
	<li>Adicione 350 µ l de tampão RW1 a coluna. Microcentrifuga por 15 s em ≥12, 000 x g e descarte o escoamento.</li>
	<li>Adicione 500 µ l de tampão RPE à coluna. Microcentrifuga por 15 s em ≥12, 000 x g e descarte de passagem.</li>
	<li>Adicione 500 µ l de tampão RPE à coluna. Microcentrifuga por 2 min em ≥12, 000 x g.</li>
	<li>Cuidadosamente remova a coluna e colocar em um novo tubo de coleta de 2 mL. Microcentrifuge a toda a velocidade para 1 min (para secar completamente a membrana).</li>
	<li>Descartar o tubo de coleta e colocar a coluna em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Adicione 30 µ l de água livre de RNase para a membrana da coluna.</li>
	<li>Eluir o RNA da coluna por microcentrifuging por 1 min em ≥12, 000 x g. Quando carregar as colunas para a microcentrifuga, certifique-se que as tampas do tubo da coleção estão enfrentando na direção centrífuga gira, para evitar que as tampas de romper.</li>
	<li>Adicione outro 30 μL de água livre de RNase para a membrana da coluna, mantendo a coluna no mesmo tubo microcentrifuga.</li>
	<li>Microcentrifuga por 1 min em ≥12, 000 x g, para que o volume final de eluato é 60 µ l.</li>
	<li>Armazene cada tubo de 1,5 mL contendo 60 µ l de RNA em congelador a-80 ° C.</li>
</ol>3. determinar a qualidade e a concentração de RNA
<ol><li>Medir a concentração de RNA e DNA em cada amostra de RNA, usando um dados, (b) DNA e RNA-específico fluorescente corantes e tubos de ensaio (c), conforme listado na Tabela de materiais. Siga as instruções dos dados e os corantes.</li>
	<li>Alternativamente, medir a concentração de ácido nucleico com um espectrofotômetro UV a 260 nm. Nota: Uma leitura de260 A do 1.0 é equivalente a ~ 40 µ g/mL, single-stranded do RNA.</li>
	<li>Testar a qualidade do RNA executando o RNA em um analisador de ácido nucleico comercial (veja a Tabela de materiais) ou em um padrão de formaldeído/agarose gel 26.</li>
</ol>4. RNA-seq análise
<ol><li>Partir do estoque de RNA total, compõem 21 µ l de 100 ng / µ l do RNA em água livre de RNase. Use 1 µ l deste 21 µ l para testar a concentração de RNA como acima. Enviar o restantes 20 µ l (2 µ g) RNA total para um centro de sequenciamento externo para enriquecimento do mRNA, preparação de biblioteca vertente específica (com oito ou mais códigos de barras para multiplexação) e sequenciamento (veja a Tabela de materiais). Alternativamente, localmente realizar o enriquecimento de mRNA e preparação de biblioteca e então apresentar a biblioteca para sequenciamento.</li>
	<li>Pool de oito ou mais amostras multiplexadas e sequência em uma pista de um sequenciador de última geração.</li>
	<li>Baixe o arquivo FASTQ que contém todas as leituras de sequência e lê o índice correspondente. Também, baixe o arquivo de texto contendo os códigos de barras multiplex. Nota: O índice lê pode estar presente em um arquivo separado de FASTQ. Coloque todos esses arquivos em um diretório.</li>
	<li>Coloque o script fornecido aqui, "fastq_pipeline.sh", no mesmo diretório. Edite este script conforme apropriado para a experiência e os diretórios do computador. Nota: este script contém anotações extensas explicando os passos. Em breve, a qualidade de roteiro apara o lê, o lê é mapeado para o genoma e gera um arquivo delimitado por tabulação que contém o número de leituras por gene para cada amostra.</li>
	<li>Deposite os arquivos FASTQ e dados de contagem de leitura crua na expressão do Gene Omnibus do NCBI antes publicação 27. Siga as instruções para "Submeter dados de sequência de alto rendimento para GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.</li>
	<li>Importar os dados de contagem de leitura para o ambiente de estatística R e realizar análise estatística, utilizando o script de R fornecido aqui, "time_course_script. R". Edite este script conforme apropriado para a experiência e os diretórios do computador. Nota: Este script contém anotações extensas explicando os passos. Em breve, este script importa os dados de leitura, normaliza o lê, identifica genes que mudam significativamente durante o curso do tempo, realiza análise PCA e gráficos a expressão dos genes selecionados.</li>
</ol>

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Os autores não têm nada para divulgar.

Neste estudo, os níveis de RNAm para todos os genes foi medido durante hipóxia em levedura S. cerevisiae. O objetivo foi analisar as mudanças de expressão de gene como global devido ao crescimento em um ambiente controlado de perto-anóxica. Várias medidas foram tomadas para garantir que o método descrito aqui foi cuidadosamente controlada e reprodutível. Primeiro, as células foram expostas a um ambiente hipóxico precisamente definido: 99,999% N2 em mídia rica (YPD). Outros estudos de hipóxia tem fecha...

Muitos organismos respondem a hipoxia, ou O baixo2, alterando a expressão de gene a 1,2,3. Esta resposta ajuda a lidar com a falta de um substrato fundamental para a respiração aeróbia e para diversas reações biossintéticas, mas também com uma mudança de estado redox 4células. Vários estudos de microarray, realizados em S. cerevisiae mostram que os níveis de RNAm de centenas de genes mudam em resposta a hipóxia 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. recentemente, RNA-seq era usado para caracterizar as mudanças de expressão do gene ao longo do tempo durante a hipóxia 13. Aqui, os detalhes experimentais são apresentados e discutidos.
Hipóxia pode ser conseguida de várias maneiras, cada uma produzindo um nível diferente de O2. Aqui, hipóxia foi estabelecida por continuamente fluindo ultra-alta-pureza N2 balões, que reduz a [O2] imediatamente dissolvido com cinética reprodutíveis 10. É possível que há algumas2 moléculas O presentes que contribuem para a expressão de gene e metabolismo, mas este ambiente é considerado muito perto anaeróbica. Na ausência de O2, as células de levedura não heme biossintetize, ergosterol e ácidos graxos insaturados 4,12,14. Assim, estudos anteriores incluíram estes metabólitos quando crescer o fermento sem oxigênio 5,10,15. No entanto, muitas respostas hipóxicos são mediadas por esgotamento destes metabolitos e assim reabastecer os inverte o gene hipóxica expressão respostas 12,16. Para imitar a hipóxia natural, estes metabólitos não foram adicionados aos meios de comunicação. No pouco tempo que as células foram expostas a hipóxia sem a presença desses metabólitos essenciais, não havia nenhum aumento perceptível na morte celular (dados não mostrados) nem uma resposta de estresse prolongado 13.
A resposta também é dependente da cepa e o seu genótipo. Especialmente importantes são os alelos dos reguladores conhecidos do hipóxica respostas 2. O fundo de tensão S288C é altamente desejado para que os resultados podem ser comparados a outros estudos genômicos realizados com esta estirpe. No entanto, o S288C contém um alelo de perda-de-função parcial do HAP1 gene 17, um regulador transcricional crítico para a resposta a hipoxia. Este alelo foi reparado em S288C utilizando uma sua cópia do Σ1278b Coe fundo 11.
Expressão gênica é altamente dependente do ambiente celular. Assim, ao realizar a análise do mRNA de todo o genoma, é importante manter um ambiente de constante ao mesmo tempo variando de outro parâmetro como tempo, estímulo ou genótipo. Para alcançar resultados altamente reprodutíveis, considere estas três práticas para o estudo e todas suas réplicas biológicas ou técnicas. Em primeiro lugar, a mesma experimenter(s) deve realizar o estudo, desde que as práticas técnicas podem variar entre experimentadores. Em segundo lugar, o mesmo lote dos ingredientes deve ser usado nos meios de comunicação de crescimento como cada lote tem uma composição ligeiramente diferente que pode afetar a expressão do gene. Em terceiro lugar, para minimizar os efeitos do ciclo celular, cada ponto de tempo deve consistir de células assíncronas na fase log de média de crescimento (1-2 x 107 células/mL).
Quando caracterizando uma resposta complexa como a expressão de gene resposta à hipoxia, um curso de tempo é vantajoso para determinar a cinética de diversos eventos. Pontos de tempo específico devem ser escolhidos que irá capturar as principais alterações da resposta. Neste estudo, foram observados pontos de tempo entre 0 e 4 h, porque experiências passadas revelaram generalizadas alterações na expressão gênica durante este período 13.
Para medir a expressão gênica global, RNA-seq foi usado 18,19. Este método usa o sequenciamento de última geração para determinar a abundância relativa de transcrição do gene cada. Em comparação com análise de microarray de DNA, RNA-seq apresenta maior sensibilidade (para detectar menos abundantes transcrições), uma maior gama dinâmica (para medir alterações maiores de dobra) e reprodutibilidade superior (para seguir com precisão a expressão gênica ao longo do tempo). Normalmente, o RNA celular mais é RNA ribossomal, que muitos métodos têm sido desenvolvidos para enriquecer específicas do RNA espécie 20. Aqui, grânulos de poli-T foram utilizados para purificar A poli-contendo transcrições de mRNA, embora os diversos comercialmente - disponíveis kits de depleção de rRNA podem também ser eficazes no enriquecimento do mRNA.
Caracterizou-se aqui, a resposta de expressão do gene de S. cerevisiae à hipoxia. As células foram expostas à hipoxia e então amostradas em oito pontos de tempo (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 e 240 min). Para confirmar a reprodutibilidade e identificar estatisticamente alteradas transcrições, realizaram-se três repetições biológicas. RNA foi extraído por ruptura mecânica e purificação da coluna e processado para análise de RNA-seq. Pós-sequenciamento pipeline é descrito e scripts de programação são fornecidos que permitem a replicação exata das análises realizadas. Especificamente, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, o ambiente estatístico R 24e o pacote de DESeq2 25 foram usados para processar os dados de RNA-seq e identificar 607 genes que mudam significativamente durante hipóxia. Análise de componentes principais (PCA) e expressão gênica das repetições indicaram a reprodutibilidade da técnica. Clustering e heatmaps revelou cinética de expressão abrangente, enquanto a análise do gene ontology (GO) mostrou que muitos processos celulares, como a respiração aeróbia, são enriquecidos no conjunto de genes regulados de oxigênio.

<table><tbody><tr><td>Incubadora seca fechada</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4000</td><td>Ajustada a 30 °C. Modifique a porta para permitir a entrada de um tubo Tygon. Como alternativa, use a incubadora New Brunswick G25, que contém uma porta de tubo. Não use um agitador de água ao ar livre, pois a condensação se acumulará nos tubos entre os frascos, possivelmente contaminando as culturas.</td></tr><tr><td>Porta-filtro de micro-análise</td><td>Millipore</td><td>XX1002530</td><td>25mm de diâmetro, suporte em aço inoxidável, montagem de rolha de silicone perfurado nº 5 em frasco filtrante padrão de 125 mL</td></tr><tr><td>Vácuo forte</td><td>Edwards</td><td>E-LAB 2</td><td>O " casa" O vácuo pode ser muito fraco. Como alternativa, use uma bomba de vácuo portátil de energia elétrica como a listada aqui.</td></tr><tr>Frasco <td></td><td></td> de <td>1.000 mL</td><td>Para atuar como purgador de vácuo.</td></tr><tr><td>~2 pés de comprimento de Tubo de Vácuo de Parede Pesada, diâmetro interno 3/8 pol, diâmetro externo 7/8 pol</td><td>Tygon</td><td>38TT</td><td>Duas peças: a primeira conecta o vácuo ao purgador, e a segunda conecta o purgador ao sistema de filtro.</td></tr><tr>Tanque <td></td><td></td><td>de gás N2 de alta pressão</td><td>99,999% de pureza, >1.000 psi, com regulador e controlador de fluxo de gás</td></tr><tr><td>Frasco</td><td></td><td></td> autoclavado de 500 mL <td>Abertura coberta com folha de alumínio. Um para cada cepa de levedura.</td></tr><tr>Frascos <td></td><td></td><td>autoclavados de 250 mL</td><td>Aberturas cobertas com folha de alumínio. Um para cada ponto de tempo mais dois para armadilhas de água.</td></tr><tr><td>Rolhas de frasco (tamanho 6, dois furos com 5 mm de diâmetro)</td><td></td><td></td><td>Esterilizado com etanol a 70%. Um para cada frasco.</td></tr><tr><td>Tubo de vidro, comprimento 9 cm ou 17 cm, diâmetro interno 2 mm, diâmetro externo 5 mm</td><td></td><td></td><td>Esterilizado com etanol 70%. Dois tubos para cada frasco. Coloque nos orifícios de cada rolha. Veja a Figura 1 para a colocação de tubos de 9 vs 17 cm.</td></tr><tr><td>~25 cm de comprimento de tubo de plástico, diâmetro interno 5 mm</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>Uma peça para cada frasco. Esterilizado com etanol 70%.</td></tr><tr><td>Discos de filtro estéreis</td><td>Millipore</td><td>HAWP02500</td><td>25 mm de diâmetro, 0,45 &micro; m tamanho dos poros, um para cada ponto de tempo</td></tr><tr><td>DH2O estéril (~100 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL cubetas</td><td></td><td></td><td>Para medir OD600 (ou seja, concentração celular)</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga estéreis de 50 mL Um</td><td></td><td></td><td>para cada ponto de tempo</td></tr><tr><td>Pinças limpas</td><td></td><td></td><td></td>e estéreis</tr><tr><td>nitrogênio</td><td></td><td></td> líquido <td>Para congelar células</td></tr><tr><td>contas lavadas com ácido</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>Mantenha a 4 &deg; C para células lisadoras</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Para purificação de coluna de RNA</td></tr><tr><td>Qiagen RLT buffer</td><td></td><td></td><td>Prepare adicionando 10 &micro; L de &beta;-mercaptoetanol por 1 ml de tampão RLT, manter a 4 °C.</td></tr><tr><td>Tubos de coleta de 2 mL</td><td>Qiagen</td><td></td><td>incluídos no Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RPE</td><td>Qiagen</td><td></td><td>incluído no Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RW1</td><td>Qiagen</td><td></td><td>incluído no Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>DNase I estoque e soluções de trabalho</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>A enzima DNase I vem como pó liofilizado em um frasco de vidro. Usando uma agulha e seringa estéreis, injete 550 &micro; L de água sem RNase (fornecida no kit Qiagen) no frasco. Misture invertendo suavemente a garrafa. Para evitar a desnaturação da enzima, não faça vórtice. Usando uma pipeta, remova esta solução estoque do frasco e armazene no freezer (-20 &deg; C) em alíquotas de uso único (80 &micro; L cada). A solução estoque não deve ser descongelada e congelada novamente.</td></tr><tr><td>Tampão RDD</td><td>Qiagen</td><td>incluído no Kit Qiagen DNase</td><td></td></tr><tr>Tubos <td></td><td></td><td>gelados de 2 mL com tampa de rosca</td><td>Para lise de células durante a extração de RNA</td></tr><tr><td>homogeneizador de moinho de esferas</td><td>Biospec Mini-Beadbeater-24</td><td>112011</td><td>Manter em câmara fria</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>DF0118</td><td>para meio líquido YPD</td></tr><tr><td>Extrato de levedura Bacto</td><td>BD</td><td>DF0886</td><td>para líquido Mídia YPD</td></tr><tr><td>glicose</td><td>Fisher</td><td>D16</td><td>para mídia YPD líquida</td></tr><tr><td>Tubos de ensaio Qubit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32856</td><td>para medir a concentração de ácido nucleico</td></tr><tr><td>Kit de ensaio Quant-iTTM dsDNA BR</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32853</td><td>para medir a concentração de ácido nucleico</td></tr><tr><td>Kit de ensaio de RNA Quant-iTTM</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32855</td><td>para medir a concentração de ácido nucleico</td></tr><tr><td>Fluorômetro Qubit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>para medir a concentração de ácido nucleico</td></tr><tr><td>Sistema de eletroforese comercial</td><td>Agilent</td><td>Bioanalyzer 2100</td><td>para medir a qualidade do ácido nucleico</td></tr><tr><td>Sequenciador de próxima geração</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500</td><td>para bibliotecas de sequenciamento</td></tr><tr><td>sistema automatizado de manuseio de líquidos</td><td>Wafergen</td><td>Apollo 324</td><td>para criação Bibliotecas de sequenciamento</td></tr><tr><td>PrepX PolyA mRNA Isolation Kit</td><td>Wafergen</td><td>400047</td><td>para isolar mRNA do RNA total</td></tr><tr><td>PrepX RNA SEQ para Illumina Library Kit</td><td>Wafergen</td><td>400039</td><td>para criar bibliotecas de sequenciamento específicas de fita do RNA total</td></tr><tr><td>Barcode Splitter</td><td></td><td></td><td>https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d</td></tr><tr><td>Samtools, que inclui o comando</td><td></td><td></td> gzip <td>http://www.htslib.org/download/</td></tr> <tr><td>Trimmomatic</td><td></td><td></td><td>http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Bowtie2 (instalado antes do TopHat)</td><td></td><td></td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td></tr><tr><td>TopHat</td><td></td><td></td><td>https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml</td></tr><tr><td>HTSeq</td><td></td><td></td><td>http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html</td></tr><tr><td>R (instalado antes do R Studio)</td><td></td><td></td><td>https://cran.rstudio.com</td></tr><tr><td>R Studio (versão gratuita)</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr></tbody></table>

medição de níveis de mrna ao longo do tempo durante a levedura s. cerevisiae hipóxica resposta

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complexas mudanças na expressão gênica tipicamente mediam uma grande parcela de uma resposta celular. Cada gene pode alterar a expressão com cinética original como o gene é regulamentado pelo sincronismo particular de um dos muitos estímulos, sinalização de percursos ou efeitos secundários. A fim de capturar o gene todo resposta de expressão à hipoxia em levedura S. cerevisiae, análise de RNA-seq foi usada para monitorizar os níveis de mRNA de genes todos em horários específicos, após a exposição à hipoxia. Hipóxia foi estabelecida pelo crescimento de células de gás de2 ~ 100% N. Importante, ao contrário de outros estudos hipóxicos, ergosterol e ácidos graxos insaturados não foram adicionados para a mídia porque estes metabólitos afetam a expressão genética. Pontos de tempo foram escolhidos na faixa de 0 - 4 h após hipoxia porque esse período captura as grandes mudanças na expressão gênica. Em cada ponto de tempo, mid log hipóxicos células foram rapidamente filtrada e congelado, limitar a exposição ao2 e concomitante as mudanças na expressão gênica. O RNA total foi extraído de células e usado para enriquecer para mRNA, que depois foi convertido em cDNA. A partir deste cDNA, multiplex bibliotecas foram criadas e oito ou mais amostras foram sequenciadas em uma pista de um sequenciador de última geração. Um pipeline pós-sequenciamento é descrito, que inclui o aparamento de base de qualidade, ler o mapeamento e determinar o número de leituras por gene. DESeq2 dentro do ambiente de estatística R foi usado para identificar genes que alteram significativamente em qualquer um dos pontos de tempo hipóxica. A análise de três réplicas biológicas revelou grande reprodutibilidade, genes da cinética diferente e um grande número de esperado O2-regulado genes. Esses métodos podem ser usados para estudar como as células de vários organismos respondem à hipoxia ao longo do tempo e adaptados para estudar a expressão gênica durante outras respostas celulares.

O curso de tempo de hipóxia e RNA-seq análise foram realizadas independentemente de três vezes. Para examinar a reprodutibilidade de as três repetições, dados da expressão do gene para todos os genes foi analisados usando análise de componente Principal (PCA). A Figura 2 mostra como as amostras mudam durante os dois primeiros componentes principais, que juntos representam 58,9% da variabilidade. Esta análise indicou que cada curso do tempo exibe alterações si...

Aqui, apresentamos um protocolo utilizando RNA-seq para monitorar os níveis do mRNA ao longo do tempo durante a hipoxia resposta das células de S. cerevisiae . Esse método pode ser adaptado para analisar a expressão gênica durante qualquer resposta celular.

Medição de níveis de mRNA ao longo do tempo durante a levedura s. cerevisiae hipóxica resposta

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

O objetivo geral deste experimento é monitorar os níveis de mRNA de todos os genes ao longo do tempo enquanto células de S. cerevisiae são expostas à hipóxia. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave nas áreas de sinalização celular, como: quais são as cinéticas das alterações na expressão gênica durante uma resposta celular? A principal vantagem desta técnica é que os níveis de mRNA são medidos ao longo do tempo, em vez de em um único ponto durante a resposta celular. Embora este método possa fornecer informações sobre a resposta hipóxica em leveduras, ele também pode ser aplicado a outras espécies microbianas que possam ser cultivadas em meio líquido. A demonstração visual deste método é fundamental para transmitir o arranjo detalhado dos frascos e das conexões de tubos, bem como a coleta rápida das células sob hipóxia. Um dia ou mais antes do curso temporal de hipóxia, prepare os materiais necessários. Posicione o tanque de nitrogênio, incubadora, vácuo e sistema de filtração em proximidade próxima, para permitir o processamento rápido das células. Prepare o meio líquido estéril YPD misturando glicose, extrato de levedura e peptona em um frasco de vidro e autoclavando

measuring-mrna-levels-over-time-during-yeast-s-cerevisiae-hypoxic

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em...

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Este protocolo descreve o procedimento experimental para a realização de...

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Nós apresentamos um protocolo simples de se obter filmes de microscopia de fluorescência de crescimento de células de levedura, e um pacote de software baseado em GUI para extrair dados de séries temporais de uma única célula. A análise inclui linhagem automatizada e divisão atribuição tempo integrado com inspeção visual e curadoria manual de dados controladas.

Aquisição de fluorescência Filmes Time-lapse da levedura de brotamento e análise da dinâmica de células simples utilização de enxertos

Dois métodos complementares baseados em citometria de fluxo e microscopia são apresentadas, que permitem a quantificação, no nível de uma única célula, da dinâmica da expressão de genes induzidos pela activação de uma via de MAPK em levedura.

A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro

O nível de estado estacionário de ARNm específicos é determinada pela velocidade de síntese e decaimento do ARNm. Taxas de degradação de mRNA genome-wide ou as taxas de decaimento de mRNAs específicos pode ser medido através da determinação de ARNm de semi-vida. Este protocolo centra-se na medição das taxas de decaimento de mRNA em Saccharomyces cerevisiae.

Medição do mRNA Decay Preços em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Usando<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

Regulamento translacional desempenha um papel importante no controle da abundância de proteína. Aqui, descrevemos um método de alta produtividade para análise quantitativa de tradução em brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae.

Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

O protocolo descrito aqui baseia-se a quantificação de todo o genoma de mRNA recentemente sintetizadas purificada de células de levedura rotuladas com 4-thiouracil. Este método permite medir a síntese de mRNA desacoplada do decaimento do mRNA e, portanto, fornece uma medição precisa da transcrição do RNA polimerase II.

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Este protocolo descreve uma aplicação de fluorescência de molécula única na hibridização situ (smFISH) para medir a cinética in vivo da síntese e degradação do mRNA.

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Apresentamos uma técnica para estabilizar rapidamente complexos translacionais (biossíntese de proteínas) com formaldeído interligando em leveduras vivas e células mamíferas. A abordagem permite dissecar intermediários transitórios e interações dinâmicas de RNA:protein. Os complexos interligados podem ser usados em vários aplicativos a jusante, como em métodos de perfil baseados em sequenciamento profundo, microscopia e espectrometria de massa.

Correção rápida in Vivo e isolamento de complexos translacionais de células eucarióticas

Este protocolo emprega um repórter bioluminescente, permitindo medições da atividade transcricional em Saccharomyces eubayanus para monitorar a transição glicose-maltose, permitindo a análise em tempo real das adaptações metabólicas e apoiando a otimização da cepa para fermentação industrial sob diversas condições.

In vivo Monitoramento da atividade transcricional durante a transição metabólica usando um repórter bioluminescente em levedura

Aprenda a medir níveis de mRNA ao longo do tempo durante a resposta hipóxica de S. cerevisiae usando RNA-seq. Este método permite analisar a dinâmica da expressão gênica em resposta ao estresse celular.

Medição de níveis de mRNA ao longo do tempo durante a levedura s. cerevisiae hipóxica resposta

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